龍 利，游 旅，韋小瑜，，李世軍，王 丹，黃俊飛，童 毅，郭 華，王 銘，汪俊華

非傷寒沙門菌(Non-typhoidal Salmonella, NTS)是引起人類感染性腹瀉和食物中毒最為常見的腸道致病菌之一，其感染呈全球分布[1]。全球疾病、傷害和風(fēng)險因素負(fù)擔(dān)研究估計，2017年發(fā)生NTS侵襲性疾病53.5萬例，造成77 500例死亡[2]。相關(guān)研究顯示，我國食源性NTS感染每年發(fā)病約903.5萬人次，每年死亡估計792人，且呈上升趨勢[3]。貴州省也是沙門菌感染的高發(fā)省份，以往對貴州省腹瀉患者的細(xì)菌病原學(xué)監(jiān)測顯示，NTS是引起感染性腹瀉的主要病原菌[4-5]。由NTS感染引起的暴發(fā)事件在貴州省時有發(fā)生，2011-2016年全省共有食源性疾病暴發(fā)事件486起，其中細(xì)菌性暴發(fā)事件52起，沙門菌位列細(xì)菌性暴發(fā)事件的前3位[6]。因此對NTS的監(jiān)測和防控預(yù)警都應(yīng)引起足夠的重視。

據(jù)報道，貴州省受污染的禽類制品、食品中NTS分離率較高，且表現(xiàn)出高耐藥性[7-8]，但關(guān)于臨床上NTS的耐藥性和分子分型的相關(guān)研究未有系統(tǒng)性的報道。本研究對2017-2018年貴州省NTS臨床分離株的耐藥性及PFGE分子分型進(jìn)行分析，為貴州省沙門菌的防控提供相關(guān)的實驗室數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 以貴州省17家哨點醫(yī)院為監(jiān)測點，除了2家為婦幼保健院，其余15家均為綜合性醫(yī)院。將符合以下兩條及以上的患者列為沙門菌監(jiān)測對象：1)24 h內(nèi)連續(xù)腹瀉3次及以上且伴有稀便、水樣便、粘液便等糞便性狀異常者；2)出現(xiàn)發(fā)熱，體溫達(dá)38 ℃以上，伴有頭痛、寒戰(zhàn)、全身乏力等癥狀；3)出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、腹痛等癥狀。2017年1月至2018年12月，共收集到191株NTS菌株。質(zhì)控菌株布倫登盧普沙門菌(H 9812)和大腸埃希菌(ATCC 25922)。

1.2 主要試劑和儀器XbaI酶為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；沙門菌顯色培養(yǎng)基為法國CHROM Agar公司產(chǎn)品；API20E生化鑒定條為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品；沙門菌診斷血清為丹麥SSI公司產(chǎn)品；蛋白酶K為德國Merck公司產(chǎn)品；革蘭陰性需氧藥敏檢測板為上海星佰生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；CHEF MapperTM脈沖場電泳儀、Gel Doc2000凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 菌株的復(fù)核及血清分型 菌株接種至科瑪嘉沙門菌顯色培養(yǎng)基上，36 ℃培養(yǎng)過夜,從培養(yǎng)基上挑取淡紫色可疑菌落接種至克氏雙糖和動力-靛基質(zhì)-尿素培養(yǎng)基進(jìn)行初步生化鑒定。符合沙門菌初步生化的菌株進(jìn)一步采用API20E生化鑒定板條進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定,對明確鑒定為非傷寒沙門菌的菌株轉(zhuǎn)種至血瓊脂平板，36 ℃培養(yǎng)18～24 h。挑取少許菌苔進(jìn)行沙門菌O、H相多價、單價玻片血清凝集，生理鹽水作陰性對照。根據(jù)White-Kauffmann-Le Minor抗原表確定對應(yīng)血清型別。

1.4 藥物敏感性試驗 采用美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI2017)推薦的微量肉湯稀釋法測定最小抑菌濃度(MIC)。本實驗共測定10類16種抗生素，環(huán)丙沙星、鏈霉素、氨芐西林、氯霉素、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明、萘啶酸、阿莫西林/克拉維酸鉀、頭孢曲松、多西環(huán)素、慶大霉素、阿奇霉素、四環(huán)素、頭孢西丁、頭孢吡肟、亞胺培南。ATCC 25922作為質(zhì)控菌株，Whonet 5.6軟件分析結(jié)果，操作過程參照文獻(xiàn)[9]。3類或以上抗生素同時耐藥定義為多重耐藥株(Multi-drug resistance，MDR)。

1.5 PFGE分子分型 根據(jù)國際PulseNet網(wǎng)絡(luò)實驗室公布的沙門菌PFGE標(biāo)準(zhǔn)分型方法，對分離的非傷寒沙門菌進(jìn)行PFGE分子分型，H 9812作為質(zhì)控菌株。XbaI 37 ℃酶切3 h，Gelred染色30 min，純水脫色10 min，用Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)拍攝圖像并將其保存。上傳條帶至 BioNumerics軟件包(Version7.6)對指紋圖譜進(jìn)行識別、處理，使用非加權(quán)配對算術(shù)平均法(unweighted pair group method with arithmetic averages,UPGMA)進(jìn)行菌株聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1 NTS地區(qū)分布及血清型分布 2017-2018年共分離出NTS 191株，其中2017年105株(55.0%)，2018年86株(45.0%)。共分出18種血清型，有8株血清型未分型，其中鼠傷寒沙門菌87株(45.5%)，腸炎沙門菌56株(29.3%)，這兩種血清型為貴州省NTS主要血清型。貴陽市、安順市、黔東南州以鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌為主；六盤水市以腸炎沙門菌和倫敦沙門菌為主；遵義市以鼠傷寒沙門菌為主，其次為德爾卑沙門菌；畢節(jié)市和黔南州以腸炎沙門菌為主。菌株的地區(qū)分布和血清型分布見表1。

表1 貴州省2017-2018年非傷寒沙門菌各地區(qū)血清型分布

2.2 NTS藥敏實驗結(jié)果 96.8%(185/191)的菌株對至少一種抗生素產(chǎn)生耐藥。對磺胺異惡唑(82.7%，158/191)、鏈霉素(81.7%，156/191)、氨芐西林(80.6%，154/191)、四環(huán)素(68.1%，130/191)、多西環(huán)素(63.4%，121/191)高度耐藥。NTS對一代喹諾酮類藥物萘啶酸耐藥率較高，達(dá)48.2%(92/191)，對三代氟喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星耐藥率為13.1%(92/191)，中介率達(dá)68.1%(130/191)。頭孢菌素類藥物中，第三代頭孢曲松耐藥率最高，為7.9%，第四代頭孢吡肟和第二代頭孢西丁耐藥率分別為6.3%(12/191)、1.6%(3/191)。出現(xiàn)7株對環(huán)丙沙星和頭孢曲松共同耐藥的菌株，占所有菌株的3.7%(7/191)，在這7株菌中，有3株還對阿奇霉素耐藥。此外，還出現(xiàn)2株菌對亞胺培南耐藥。優(yōu)勢血清中，鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌兩者均對鏈霉素、氨芐西林、磺胺異惡唑產(chǎn)生較高的耐藥率，在78%～91%之間。鼠傷寒沙門菌對氯霉素(66.3%，58/87)、復(fù)方新諾明(59.3%，52/58)、多西環(huán)素(80.2%，70/87)、四環(huán)素(81.4%，70/87)耐藥性較高，腸炎沙門菌對萘啶酸耐藥性高度耐藥，耐藥率達(dá)96.5%(54/56)。各種抗生素的藥敏結(jié)果見表2。

表2 貴州省2017-2018年非傷寒沙門菌耐藥情況(%)

2.3 耐藥譜 191株NTS菌株共形成69種耐藥譜型，主要譜型為：氨芐西林+鏈霉素+磺胺異惡唑+萘啶酸(28株，14.7%)和氨芐西林+氯霉素+鏈霉素+磺胺異惡唑+四環(huán)素+多西環(huán)素+復(fù)方新諾明(27株，14.1%)。87株鼠傷寒沙門菌形成38種耐藥譜型，以氨芐西林+氯霉素+鏈霉素+磺胺異惡唑+四環(huán)素+多西環(huán)素+復(fù)方新諾明(21株，24.1%)為主要耐藥譜型，其次為氨芐西林+氯霉素+磺胺異惡唑+多西環(huán)素(11株，12.6%)。56株腸炎沙門菌形成18種耐藥譜型，氨芐西林+鏈霉素+磺胺異惡唑+萘啶酸(27株，48.2%)為主要耐藥譜型，其次為氨芐西林+鏈霉素+磺胺異惡唑+萘啶酸+四環(huán)素+多西環(huán)素(7株，12.5%)。

2.4 多重耐藥 2017-2018年貴州省NTS多重耐藥率為84.3%(161/191)，鼠傷寒沙門菌多重耐藥率為90.8%(79/87)，腸炎沙門菌多重耐藥率為83.9%(47/56)。多重耐藥菌株中，對5類抗生素耐藥的最多，占比為38.5%(62/161)，其次為4耐類，占比為32.3%(52/161)。一部分菌株出現(xiàn)對6類及以上的抗生素耐藥，6耐類抗生素的菌株有22株，7耐類抗生素的菌株有13株，8耐類抗生素的菌株有5株，9耐類抗生素的菌株有1株。各市(州)均分離到多重耐藥菌株，多重耐藥率最高的是銅仁市(91.4%，53/58)，其次是安順市(90.5%，19/21)和六盤水市(90.0%，9/10)，其余市(州)多重耐藥率分別為：貴陽市(88.2%，30/34)、黔東南州(85.0%，17/20)、黔南州(83.3%，10/12)、遵義市(64.3%，18/28)、畢節(jié)市(62.5%，5/8)。

2.5 PFGE分子分型和聚類分析 所有NTS菌株經(jīng)XbaI酶切電泳后，188株菌株得到較好分離，有3株未跑出條帶。按照PFGE圖譜相似度為100.0%時為同一型別，對主要血清型鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌分別進(jìn)行PFGE圖譜聚類分析。

2.5.1 鼠傷寒沙門菌聚類分析結(jié)果 87株鼠傷寒沙門菌經(jīng)PFGE分型后，共獲得60種帶型，命名為JPXX01.GZ0001～JPXX01.GZ0060。11種帶型包括2株及以上的菌株，優(yōu)勢帶型JPXX01.GZ0047有11株(12.6%),包括貴陽市4株，銅仁市4株，遵義市2株；JPXX01.GZ0051有5株(5.7%)，JPXX01.GZ0038、JPXX01.GZ0042、JPXX01.GZ0046各有3株(3.4%)，6種帶型各有2株(2.3%)，其余53種帶型均為1株(1.1%)。3種帶型跨年份交叉出現(xiàn)，5種帶型跨地區(qū)出現(xiàn)，JPXX01.GZ0047、JPXX01.GZ0050、JPXX01.GZ0051存在跨地區(qū)跨年份帶型相同的菌株。觀察同一帶型菌株的耐藥譜發(fā)現(xiàn)，有4種帶型的同源菌株耐藥譜完全一致；而有一部分耐藥譜相同的菌株沒有聚類特征，如主要耐藥譜氨芐西林+氯霉素+鏈霉素+磺胺異惡唑+四環(huán)素+多西環(huán)素+復(fù)方新諾明分布在11個型別中(見圖1)。

注：“Resistance profile”中ACSSuTNDG分別表示氨芐西林、氯霉素、鏈霉素、磺胺異惡唑、四環(huán)素、萘啶酸、多西環(huán)素、慶大霉素，CIP、SXT、AMC、AZM、CRO、FOX、FEP、IMP分別表示環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、阿莫西林/克拉維酸鉀、阿奇霉素、頭孢曲松、頭孢西丁、頭孢吡肟、亞胺培南，”——“表示敏感

2.5.2 腸炎沙門菌聚類分析結(jié)果 56株腸炎沙門菌經(jīng)PFGE分型后，共獲得21種帶型，命名為JEGX01.GZ0001～JEGX01.GZ0021。6種帶型包含2株及以上的菌株，其中JEGX01.GZ0005有13株(23.3%),為優(yōu)勢帶型，包括銅仁市5株，黔東南州3株，安順市3株，黔南州2株；次優(yōu)勢帶型JEGX01.GZ0007有12株(21.4%)，分布于5個地市(州)；JEGX01.GZ0004有8株(14.3%)，JEGX01.GZ0001有4株(7.1%)，2種帶型各有2株(3.6%)，其余15種帶型均為1株(1.8%)。有3種帶型存在跨地區(qū)跨年份帶型相同的菌株。結(jié)合PFGE帶型與耐藥譜分析結(jié)果顯示，氨芐西林+鏈霉素+磺胺異惡唑+萘啶酸和氨芐西林+鏈霉素+磺胺異惡唑+四環(huán)素+萘啶酸+多西環(huán)素為JEGX01.GZ0005的主要耐藥譜，JEGX01.GZ0007的優(yōu)勢耐藥譜為氨芐西林+鏈霉素+磺胺異惡唑+萘啶酸，其余帶型的耐藥表型分布較為分散，見圖2。

注：“Resistance profile”中ACSSuTNDG分別表示氨芐西林、氯霉素、鏈霉素、磺胺異惡唑、四環(huán)素、萘啶酸、多西環(huán)素、慶大霉素，CIP、SXT、AMC、AZM、CRO、FOX、FEP、IMP分別表示環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、阿莫西林/克拉維酸鉀、阿奇霉素、頭孢曲松、頭孢西丁、頭孢吡肟、亞胺培南

3 討 論

NTS是一類危害動物和人類健康的重要人獸共患致病菌，給全球的公共衛(wèi)生造成重大的負(fù)擔(dān)[2-3]。血清型分型是NTS重要的表型之一，也是流行病學(xué)研究的基礎(chǔ)，有助于實現(xiàn)病原微生物的溯源分析，對NTS的防控和風(fēng)險評估具有重要意義。貴州省2017-2018年NTS臨床患者血清型分布呈現(xiàn)多樣性，主要血清型為鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌，與廣州市、重慶市報道的結(jié)果相似[10-11]，與安徽省馬鞍山市報道的阿貢納沙門菌為當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢血清型有所區(qū)別[12]，說明NTS血清型分布有一定的區(qū)域特點。貴州省各市(州)分離的菌株中，菌株數(shù)多的三個市(州)為銅仁市、貴陽市、遵義市，其原因可能與各市(州)沙門菌的流行情況，標(biāo)本的采樣及分離技術(shù)、送檢是否及時有關(guān)，提示在今后的監(jiān)測工作中需加強(qiáng)對各監(jiān)測點的培訓(xùn)及監(jiān)測力度，完善相關(guān)工作。各地區(qū)主要血清型別有所差異，提示實時監(jiān)測全省NTS的動態(tài)變化至關(guān)重要，針對各地區(qū)流行的血清型做好防控措施。

國內(nèi)外研究顯示，耐藥性NTS近年來引起了全球的關(guān)注，成為醫(yī)療機(jī)構(gòu)面臨的重大問題[2,13]。本次藥敏結(jié)果顯示，磺胺異惡唑、鏈霉素、氨芐西林、四環(huán)素、多西環(huán)素耐藥率超過60%，此結(jié)果高于2016年中國26個省市食源性沙門菌的整體耐藥水平[14]。沙門氏菌受血清型的影響很大，部分血清型對某些抗菌藥物表現(xiàn)出較高水平的耐藥性。研究結(jié)果顯示，鼠傷寒沙門菌對氯霉素、復(fù)方新諾明、多西環(huán)素、四環(huán)素表現(xiàn)出高度耐藥，腸炎沙門菌對萘啶酸的耐藥率和環(huán)丙沙星的中介率高于其他血清型，具體原因尚不清楚。

喹諾酮類和頭孢菌素類抗菌藥物目前分別是臨床上治療成人和兒童NTS感染使用最廣泛的抗生素。在兒童中，頭孢菌素對于治療嚴(yán)重的腹瀉和侵襲性NTS感染至關(guān)重要，若對頭孢曲松這類超廣譜頭孢菌素耐藥將會給臨床上抗NTS感染增添更嚴(yán)重的問題。不同地區(qū)報道的頭孢曲松耐藥性有所不同，但總體呈上升趨勢[15-16]。191株NTS菌株中，15株(7.9%)對頭孢曲松耐藥。各市(州)對頭孢曲松耐藥率在0%～19.0%之間，以安順市(19.0%)最高，黔東南州(15.0%)次之。喹諾酮類抗菌藥物中，萘啶酸耐藥率較高，環(huán)丙沙星耐藥率雖不是很高，但表現(xiàn)出非常高的中介率，這部分菌株應(yīng)引起我們的重視。值得注意的是，本次藥敏實驗中，出現(xiàn)了對環(huán)丙沙星和頭孢曲松、阿奇霉素共同耐藥的菌株，阿奇霉素被證明治療NTS感染的效果與超廣譜頭孢菌素類和氟喹諾酮類藥相當(dāng)，同時對這3種重要的抗生素耐藥，若出現(xiàn)NTS暴發(fā)感染，臨床治療將變得非常困難。

NTS多重耐藥的流行已成為人類健康的重大威脅，本次研究多重耐藥率已超過80%，高于美國、歐盟報道的人源NTS分離株的多重耐藥性[15,17]。銅仁市、安順市、六盤水市的多重耐藥菌株高達(dá)90.0%，遠(yuǎn)高于國內(nèi)部分城市[7-8]。菌株的耐藥譜結(jié)果顯示，所有菌株共形成69種耐藥譜型，優(yōu)勢耐藥譜型與其他地區(qū)不同[9,13,18]，其原因可能與區(qū)域血清型別、抗生素的使用量和種類有關(guān)。在20世紀(jì) 80年代出現(xiàn)了一種典型的多重耐藥表型DT104，表現(xiàn)出對氨芐西林、氯霉素、鏈霉素、磺胺類和四環(huán)素類抗菌藥物同時耐藥(即ACSSuT)，具有這種耐藥模式的沙門氏菌感染者比敏感感染者可能住院時間更長和死亡[19]。本次研究有72株(38.0%)菌株出現(xiàn)這種耐藥模式，若這種耐藥模式的菌株持續(xù)存在，將會影響貴州省NTS感染患者的臨床治療。碳青霉烯類抗菌藥物作為抗生素“多重耐藥的一道防線”，菌株對該類藥物產(chǎn)生抗性說明耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重[10]。此次研究，出現(xiàn)2株菌株對亞胺培南產(chǎn)生耐藥，提示貴州省的NTS多重耐藥形勢嚴(yán)峻。

PFGE作為細(xì)菌分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”，利用不同菌株的電泳圖譜具有高度特異性，成為流行病學(xué)監(jiān)測、感染控制和暴發(fā)調(diào)查中使用最廣泛的方法之一[20]。經(jīng)PFGE分型，除鼠傷寒、腸炎、德爾卑沙門菌中有一部分菌株有聚類特征外，其他血清型的沙門菌沒有出現(xiàn)聚類現(xiàn)象，總體呈現(xiàn)多態(tài)性，與國內(nèi)外研究相似[21-22]。腸炎沙門菌聚類結(jié)果顯示，較多的菌株條帶相似度為100.0%，表明貴州省存在腸炎沙門菌散發(fā)流行的可能，應(yīng)做好早期預(yù)防和預(yù)警。鼠傷寒沙門菌PFGE型別分散、帶型復(fù)雜，該血清型的菌株防控難度較大，應(yīng)做好全方位的防控措施。這兩種血清型均有跨年份跨地區(qū)的同一帶型的菌株，表明可能在某些食品的原材料、加工、銷售等環(huán)節(jié)中存在持續(xù)的污染源，人員的流動性、食品的貿(mào)易等使病原菌跨地區(qū)跨年份傳播和蔓延。帶型相同的菌株主要集中在菌株分離數(shù)較多的銅仁市、貴陽市和遵義市，呈地域的聚集性。鼠傷寒沙門菌JPXX01.GZ0006型的兩株菌分離自同一天，均為銅仁市思南縣分離株，且耐藥表型相似，不排除這兩株菌來源于同一感染源。本研究中，PFGE分型與耐藥表型存在一定的相關(guān)性，根據(jù)這種關(guān)聯(lián)性有助于發(fā)現(xiàn)耐藥菌株。同時，耐藥表型不同卻出現(xiàn)相同的PFGE帶型，提示不同菌株基因組的特性有所差異，后續(xù)可結(jié)合耐藥基因檢測進(jìn)行更深入的研究。

利益沖突：無