黃銀燕，趙 剛，賈慶軍，吳亦斐，程慶林，王 樂，陸 敏，李清春，謝 立

猩紅熱(Scarlet Fever)是由能產(chǎn)生紅疹毒素的A組β溶血性鏈球菌(beta-haemolytic group A streptococcus isolates, GAS)，也稱化膿鏈球菌(S.pyogenes)感染所引起的一種急性呼吸道傳染病，是我國法定的乙類傳染病之一[1]。有研究表明嵴鏈球菌一般分離于健康或者齲齒患者的牙菌斑，有利于延緩齲齒的發(fā)生[2]，而從猩紅熱患者咽拭子分離到嵴鏈球菌報道較少[3]。本課題組前期研究從確診的猩紅熱患兒咽拭子分離到一株嵴鏈球菌S22，并且未分離到化膿鏈球菌[3]。本文對S22進行全基因組測序分析，并將其與NCBI基因組數(shù)據(jù)庫中的嵴鏈球菌和部分具有代表性的鏈球菌基因組進行比較基因組學(xué)研究，從基因組的角度探討嵴鏈球的致病機理、耐藥機制及其與其他鏈球菌在基因水平的差異和進化關(guān)系，探索嵴鏈球菌與猩紅熱之間的關(guān)系，為臨床用藥和疾病防控等提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 菌株S22分離自杭州市兒童醫(yī)院猩紅熱患兒咽拭子[3]。細菌藥物敏感實驗采用紙片擴散法測定S22對紅霉素、羅紅霉素、阿奇霉素、泰利菌素、螺旋霉素、林可霉素、鏈陽霉素B、四環(huán)素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、西索米星、妥布霉素、阿米卡星、奈替米星和桿菌肽。將單菌落接種于含 5%牛血清的腦心浸液培養(yǎng)管中，37 ℃孵育過夜。調(diào)整菌液濁度為0.5 麥?zhǔn)媳葷釢舛龋?∶1 000 倍稀釋。以無菌棉拭子蘸取稀釋液均勻涂布在MH瓊脂培養(yǎng)基表面，用無菌鑷子貼上各藥敏紙片并輕壓，兩紙片之間距離以 2～3 cm 為宜。平皿倒置于 37 ℃恒溫培養(yǎng) 18～24 h，測定抑菌圈直徑大小，參照《紙片法藥敏試驗抑菌環(huán)直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)(mm)》(CLSI)中鏈球菌抑菌環(huán)直徑標(biāo)準(zhǔn)判定菌株對藥物的敏感性。

文中用于比較基因組學(xué)分析的28株鏈球菌基因組信息從NCBI基因組數(shù)據(jù)庫下載，詳細信息見表1、表2。

表1 NCBI基因組數(shù)據(jù)庫中19株S.cristatus基因組信息

表2 相關(guān)鏈球菌基因組信息

1.2 DNA提取、基因組測序、注釋和組裝 總DNA的抽提使用DNA抽提試劑盒(Blood & Cell Culture DNA Mini Kit(Qiagen))，參照操作步驟完成。全基因組測序由武漢菲沙基因信息有限公司完成，采用Illumina Hiseq平臺測序，使用 SMRT LINK 5.1 軟件進行數(shù)據(jù)處理?；蚪M組裝用SOAPdenovoV2.04軟件完成，用多種參數(shù)反復(fù)調(diào)試，選取最佳組裝結(jié)果。用軟件Gapcloser v1.12填補組裝后的缺口。組裝后的基因組提交NCBI注釋，S22的NCBI序列號為VIBR01000000。

1.3 基因組基本特征、毒力基因、耐藥基因分析 CDS預(yù)測采用Prokka1.12(https://github.com/tseemann/prokka)軟件進行；tRNA和rRNA預(yù)測分別采用tRNAscan-SE-1.3.1和RNAmmer-1.2；crispr 預(yù)測采用CRISPRfinder(http://crispr.i2bc.paris-saclay.fr/Server/)。S22毒力基因預(yù)測使用BLAST軟件將CDS翻譯的蛋白與VFDB[4](http://www.mgc.ac.cn/VFs/)中鏈球菌毒力基因進行比對，參數(shù)e-value：1-e5，相似度50%，比對區(qū)域覆蓋比對結(jié)果為兩條序列中至少一條的50%。20株S.cristatus的毒力基因分析是將注釋基因組提交到VFDB的VFanalyzer[4]生成。其余9株鏈球菌毒力基因直接從VFDB的鏈球菌屬下載。耐藥基因預(yù)測使用Antibiotic Resistance Genes Database(https://ardb.cbcb.umd.edu/)數(shù)據(jù)庫及其自帶腳本進行分析。

1.4 比較基因組分析 平均核苷酸相似度(ANI)采用軟件Jspecies分析[5]。鏈球菌屬基于全基因組的SNPs進化樹采用軟件kSNP3[6]分析(參數(shù)-k 29，-min_frac 0.5)。

2 結(jié) 果

2.1 S22的抗生素耐藥狀況 紙片擴散法結(jié)果顯示S22對紅霉素、羅紅霉素、阿奇霉素、泰利菌素、螺旋霉素、林可霉素、鏈陽霉素B、四環(huán)素、桿菌肽耐藥，對鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、西索米星、妥布霉素、阿米卡星、奈替米星敏感。

2.2 基因組基本信息 菌株S22基因組全長2.04184 Mb，平均GC含量42.7%，共組裝成30個Scaffold。Prokka1.12 預(yù)測S22有2 020個基因，39個編碼20種氨基酸的tRNA，1 980個潛在的CDS，1個rRNA操縱子，22個基因島，1個crispr。用于比較基因組學(xué)分析的28株鏈球菌包括19株嵴鏈球菌(表1)和9株經(jīng)典的致病性鏈球菌/緩癥鏈球菌(表2)，9株菌均有全基因組完成圖，并且是研究鏈球菌毒力因子的參考菌株[4]。19株嵴鏈球菌有3株分離自中國，1株分離自德國，其余均分離自美國[7-8]。S22和其他28株鏈球菌16S rRNA基因系統(tǒng)進化樹如圖1所示。除S22以外，分離自中國的其他3株菌都在一個分支上，與S22 16S rRNA基因親緣關(guān)系最近的是嵴鏈球菌CC5A。與嵴鏈球菌550_SOLI 16S rRNA基因親緣關(guān)系最近的是血鏈球菌SK36，與嵴鏈球菌771_SOLI和嵴鏈球菌787_SOLI 16S rRNA基因親緣關(guān)系最近的是格氏鏈球菌CH1。

圖1 N-J法構(gòu)建的基于16S rRNA基因的系統(tǒng)進化樹

2.3 S22的耐藥基因和耐藥轉(zhuǎn)座子分布 在S22中存在3個耐藥基因，分別為ermB、tetM、bacA(表3)。其中ermB、tetM，位于同一個Scaffold上的相近區(qū)域，該區(qū)域與Enterococcusfaecalis質(zhì)粒pCF10轉(zhuǎn)座子Tn925(NC_006827)大部分同源(圖2)。另外，S22的轉(zhuǎn)座子在Tn925序列的基礎(chǔ)上又多插入5個基因，包括ISL3 family transposase，ermB，23SrRNA methyltransferase attenuation leader peptide和2個未知功能蛋白。

圖2 S22基因組耐藥轉(zhuǎn)座子區(qū)域

表3 S22的耐藥基因

2.4 鏈球菌屬毒力基因分析 鏈球菌的毒力基因分為黏附素(Adherence)，酶類(Enzyme)，免疫逃逸(Immune evasion)，錳吸收(Manganese uptake)，蛋白酶(Protease)，超抗原(Superantigen)，抗吞噬(Antiphagocytosis)7大類，45個毒力基因(簇)(圖3)，其中S22含有33個毒力基因，包括黏附素基因5個，酶類基因1個，免疫逃逸(莢膜)基因21個，錳吸收基因1個，蛋白酶基因4個，抗吞噬蛋白基因1個(圖3)。除550_SOLI，771_SOLI，787_SOLI以外，其余17株嵴鏈球菌毒力基因分布大致相同。S22與化膿鏈球菌M1毒力基因差異很大，M1中與猩紅熱致病相關(guān)的 M protein、Immunoreactive antigen、Superantigen、Hyaluronidase 等毒力基因在S22中均未發(fā)現(xiàn)。相比其他嵴鏈球菌，550_SOLI與SK36，771_SOLI、787_SOLI與CH1的毒力基因更相似。

注：藍色方框中是20株S.cristatus

2.5 嵴鏈球菌ANI分析 20株嵴鏈球菌的ANI如表4所示。研究表明屬于同一種的兩株菌之間ANI大于95%[9]。所有嵴鏈球菌中未發(fā)現(xiàn)與S22 ANI大于95%的菌株。與S22 ANI值最大的是NCTC13807(94.39%)，其次是NBRC106105(94.37%)和AS1.3089(94.36%)，3株菌均分離自中國且3株菌間的ANI大于99%。A53、A54、A55 3株菌的ANI也大于99%。550_SOLI、771_SOLI、787_SOLI與其他嵴鏈球菌的ANI均小于90%。771_SOLI和787_SOLI間的ANI是95.81%，2株菌與格氏鏈球菌CH1的ANI分別是97.75%和95.24%，550_SOLI與血鏈球菌SK36的ANI是95.33%。

2.6 鏈球菌屬全基因組SNPs進化樹 19株已測序嵴鏈球菌與9株毒力基因參考鏈球菌的全基因組SNPs進化樹如圖4所示。整個進化樹分為3大分支：S22與分離自中國的NCTC13807、NBRC106105、AS1.3089在一個分支上；771_SOLI、787_SOLI、550_SOLI與9株毒力基因參考鏈球菌在一個分支上；其余13株嵴鏈球菌在一個分支上。其中，771_SOLI、787_SOLI與CH1在一個小分支上，550_SOLI與SK36在一個小分支上。

圖4 N-J法構(gòu)建的基于全基因組SNPs的系統(tǒng)進化樹

3 討 論

本文是首次系統(tǒng)地研究了嵴鏈球?qū)俚幕蚪M特征、毒力基因、耐藥基因和進化關(guān)系，也是首次從猩紅熱患兒咽拭子分離嵴鏈球菌進行基因組測序。綜上數(shù)據(jù)，在嵴鏈球菌中，16S rRNA基因進化樹親緣關(guān)系越近，全基因組SNPs進化樹親緣關(guān)系也越近，ANI值也越高，毒力基因數(shù)量和分布也越相似。因此從16S rRNA基因進化樹、全基因組SNP進化樹、ANI結(jié)果、毒力基因分布可以判斷S22屬于鏈球菌屬嵴鏈球菌種。S22與引起猩紅熱的化膿鏈球菌進化關(guān)系遠，毒力基因分布差異大，因此從基因組角度沒有直接證據(jù)顯示S22與猩紅熱的關(guān)系。

S22的33個毒力基因，除了與致病有關(guān)的莢膜基因以外，基因plr/gapA[10]、lmb[11]、psaA[12]、srtA[13]、slrA[14]、lmb[15]、eno[16]、pavA[17]與細菌的黏附和定植相關(guān)?；騢trA/degP[18]、tig[19]、cppA[20]和scpA/scpB[21]為侵襲性的酶類基因。因此，條件致病菌S22是存在潛在致病能力的，圖3中其他的嵴鏈球菌都是有潛在致病能力的。

嵴鏈球菌771_SOLI和嵴鏈球菌787_SOLI雖被命名為嵴鏈球菌，但16S rRNA基因進化樹、全基因組SNPs進化樹、ANI數(shù)據(jù)和毒力基因分布都顯示與771_SOLI和787_SOLI親緣關(guān)系最近的是格氏鏈球菌CH1。因此，771_SOLI和787_SOLI應(yīng)屬格氏鏈球菌。同理，與550_SOLI親緣關(guān)系最近的是血鏈球菌SK36，故550_SOLI應(yīng)屬血鏈球菌。

SNPs進化樹上，分離自中國的4株菌在同一個分支上，相互間的ANI值也是最高的。有趣的是與S22 16S rRNA基因親緣關(guān)系最近的是分離自美國的CC5A，并非其他3株分離自中國的菌株。環(huán)境影響細菌基因組的進化，中國的4株菌分離自黃種人，而其他的嵴鏈球菌分離自白種人(1株德國，其余美國)，相同生境的菌全基因組親緣關(guān)系越近。SNPs進化樹上，S22雖與AS 1.3089、NCTC13807、NBRC 106105在同一個分支上，但相對于其他3株菌的親緣關(guān)系，S22更遠，可能與其分離自咽部有關(guān)。

S22的耐藥基因ermB編碼 23S rRNA 甲基化酶，耐藥表型為 MLSB，即對大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素和鏈陽霉素B交叉耐藥，TetM基因編碼四環(huán)素耐藥基因，bacA為桿菌肽耐藥基因。S22中未發(fā)現(xiàn)其他耐藥基因，耐藥基因和表型完全一致。耐藥基因bacA在所有已測序的嵴鏈球菌中均有發(fā)現(xiàn)。耐藥基因轉(zhuǎn)座子是在四環(huán)素轉(zhuǎn)座子Tn925[22]的基礎(chǔ)上又插了1個ermB基因，與轉(zhuǎn)座子Tn6002(AY898750.1)[23]同源性99%。該轉(zhuǎn)座子同時也存在于分離自中國的 AS 1.3089(CP004409.1)，NCTC13807(LS483471.1)，NBRC 106105(NZ_BJYQ01000021.1)。本研究中的其他菌只有550_SOLI，771_SOLI，ATCC51100含無ermB基因插入的四環(huán)素轉(zhuǎn)座子。該轉(zhuǎn)座子比我們在血鏈球菌S28中發(fā)現(xiàn)的耐藥基因轉(zhuǎn)座子剛好少1個耐氨基糖苷類抗生素的基因aacA-aphD[24]。

研究顯示大環(huán)內(nèi)酯類、頭孢菌素和青霉素這3種抗生素在國內(nèi)兒童醫(yī)院用量很大[25]。研究人員對2002-2006年5家兒童醫(yī)院的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有3家醫(yī)院使用前3位的抗生素是阿奇霉素、頭孢菌素二代、三代[26]，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是肺炎支原體感染的首選藥物[27]。S22寄居在咽部，若患者使用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素后，因S22耐大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，有可能成為咽部的優(yōu)勢菌群，甚至因為抗生素的使用，引起菌群失調(diào)。S22作為條件致病菌可能引起致病。

目前，從中國分離的4株已測序的嵴鏈球菌中都含有ermB-tetM類Tn6002轉(zhuǎn)座子，其他已測序的16株嵴鏈球菌中均未發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)座子。雖然沒有直接證據(jù)證明該轉(zhuǎn)座子在中國地區(qū)分離的嵴鏈球菌中的出現(xiàn)與國內(nèi)抗生素使用的直接關(guān)聯(lián)，但本研究也提示我們：嚴(yán)格控制抗生素的使用，減少抗生素誘導(dǎo)細菌耐藥的發(fā)生，刻不容緩。

利益沖突：無