唐曉東，蔣春志，徐俊杰，張麗，樊翠芹，于翠紅

（河北省農林科學院糧油作物研究所/河北省作物遺傳育種實驗室，河北 石家莊 050035）

植物激素是植物體內產生的一些微量但能調節(jié)自身生理過程的有機化合物，與植物生長發(fā)育密切相關，是研究植物代謝生理的重要內容[1～3]。準確測定植物激素種類和含量，對于植物的栽培生理、發(fā)育生理[4，5]以及抗性生理[6]研究具有重要作用。

雖然目前激素檢測手段已經(jīng)發(fā)展到質譜水平，但受限于儀器價格高昂，因此質譜技術在小麥激素檢測方面的應用還很少[7～9]，液相色譜仍是植物激素檢測的主要儀器。但是，已有的高效液相色譜檢測植物激素方法一般只能檢測2～4 種[10～16]，檢測時間在25 min以上[11～13，17，18]，檢測能力和效率還有很大的提升空間?；趯σ陨蠋追矫娴母倪M，采用高效液相色譜法對小麥激素測定進行優(yōu)化，將植物激素檢測種類提升至7 種，檢測時間縮短到15 min，從而顯著提高了液相色譜法在小麥植物激素的檢測能力和檢測效率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試小麥品種為冀麥325。將Hoagland 營養(yǎng)液水培的小麥苗，取相同部位的葉片和根，3 次重復，稱量后與鋼珠一起置于2 mL 離心管中，于液氮中冷凍后在-80 ℃超低溫冰箱保存，備用。

試驗儀器有Agilent 1200 型高效液相色譜儀、ZORBAX Eclipse XDB-C18 色譜柱 （4.6 mm×150 mm）、eppendorf 5810R 型離心機、QIAGEN Tissue lyserⅡ組織破碎儀和減壓蒸干裝置（自研）。

試劑中，tZ（反式玉米素）、tZR（反式玉米素核苷）、α-萘乙酸（NAA）、吲哚-3-乙酸（IAA）、赤霉素A3（GA3）、6-芐氨基嘌呤（6-BA）和脫落酸（ABA）標準品均為索萊寶公司生產；甲醇（色譜純）等色譜試劑為Fisher 公司生產；石油醚、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、乙酸乙酯、甲酸等提取試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥激素提取方法的改進 （1）取小麥根或葉片樣品0.2 g 冷凍振蕩破碎至粉狀，加入事先已經(jīng)預冷的含有30 μg/mL 二乙基二硫代氨基甲酸鈉（DDTC）的80%甲醇1 mL，0～4 ℃避光浸提過夜。4 ℃下5 000 r/min離心10 min 后取上清液，殘渣再用1 mL 上述提取液復懸，重復浸提2 h；相同條件離心后，合并上清液至10 mL 梨形瓶中，35 ℃減壓蒸干。（2）依次用石油醚1 mL、磷酸緩沖液（pH 值8.0）1 mL 沖洗梨形瓶，重復1～2 次。（3）棄去醚層，保留水相，加入等體積的乙酸乙酯萃取2 次，并將乙酸乙酯轉移至新的梨形瓶中。（4）用甲酸將剩余水相pH 值調至3.0，再次用等體積的乙酸乙酯萃取2 次，合并所有乙酸乙酯，然后35 ℃減壓蒸干。 （5）用80%甲醇1 mL 溶解，過0.45 μm 有機濾膜后備用，待上機。上述步驟中，除減壓蒸干外，其他步驟盡可能使用冰盒或冰袋，使樣品轉移過程一直處于低溫狀態(tài)。

1.2.2 激素檢測色譜條件的優(yōu)化

1.2.2.1 波長掃描與確定。將tZ、tZR、GA3、6-BA、IAA、ABA 和NAA 標準品用80%甲醇溶解至適當濃度，在紫外可見分光光度計上進行全波長逐點掃描，記錄各波長下的吸光度，匯總后確定檢測波長。并在230～320 nm 波長范圍內，每5 nm 進行1 次液相色譜驗證。

1.2.2.2 初始色譜條件。ZORBAX Eclipse XDB-C18 色譜柱（4.6 mm×150 mm）；柱溫45 ℃；流動相A 為甲醇，流動相B 為含有0.8%冰醋酸的水溶液：總流速0.8 mL/min；進樣量20 μL；檢測波長270 nm。進行梯度洗脫（表1）。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.2.2.3 柱溫的優(yōu)化。在初始色譜條件下，分別設定柱溫為25、30、35、40 和45 ℃，其他條件不變，檢驗最佳的檢測柱溫。

1.2.2.4 流速的優(yōu)化。在初始色譜條件下，分別設定流速為 0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 和 1.1 mL/min，其他條件不變，檢驗最佳的流速。

1.2.3 標準曲線的線性與范圍 將tZ、tZR、GA3、6-BA、IAA、ABA 和NAA 標準品用80%甲醇配制成不同濃度的標準溶液，采用1.2.2 中最終優(yōu)化好的檢測方法進行檢測，采用濃度與峰面積擬合標準曲線。

1.2.4 樣品檢測與加標回收率

1.2.4.1 樣品檢測。采用1.2.1 中的提取方法提取小麥的根和葉片，并利用1.2.2 中最終優(yōu)化好的檢測方法進行檢測，檢驗本方法的適用性。

1.2.4.2 加標回收率。將同一小麥葉片樣品分成等量2 份，一份按1.2.4.1 的流程進行檢測，另一份加入適量各激素標準品后再按照1.2.4.1 的流程進行檢測，計算加標回收率。

2 結果與分析

2.1 提取方法的改進（不同pH 值條件下各類激素的提取效果）

用已知濃度的標品在不同pH 值條件下進行模擬提取，結果（圖1，表2）顯示，pH 值對不同激素的提取效果影響較大。在單一pH 值8.0 條件下，GA3幾乎全部被提取出來，提取比例高達99.01%；其次是ABA 和NAA，提取比例分別為96.71%和93.50%；IAA的提取比例為74.30%，tZ 和tZR 的提取比例均約50%；而6-BA 幾乎提取不到，提取比例僅3.77%。在單一pH 值3.0 條件下，各類激素的提取效果與單一pH 值8.0 條件下的提取效果相反：6-BA 的提取效果最佳，提取比例達到98.16%；其次是tZ 和tZR，提取比例分別為58.19%和50.84%；其他激素的提取比例均較低，提取效果較差。而在雙pH 值條件下，可以避免單一pH 值條件下某些激素被破壞或難以提取的缺陷，互補效果顯著，能最大程度地提高提取效果。

圖1 不同pH 值對各類激素提取效果的影響Fig.1 Effects of different pH values on the extraction of various hormones

表2 不同pH 值條件下各類激素提取的峰面積Table 2 Peak area of hormone extracted under different pH values

2.2 檢測方法的優(yōu)化

2.2.1 吸收波長的選擇 分光光度計波長掃描結果（圖2）顯示，在230～320 nm 波長范圍內，除NAA 存在2 個吸收高峰外，其他激素均存在1 個吸收高峰；但各激素吸收高峰所處的波長位置不盡相同，其中，tZ、tZR、GA3、6-BA、IAA、ABA、NAA 最大吸收峰的波長分別為 269、268、253、270、274、261 和 280 nm，NAA 次吸收峰的波長為271 nm。

圖2 不同波長下各激素的吸光度Fig.2 Absorbance of hormones at different wavelengths

對液相色譜中各激素的單位濃度峰面積（峰面積與濃度的比值）變化情況（表3）進行綜合考慮，本研究選用260 nm 作為最終檢測波長。在該波長下可以兼顧本研究涉及到的7 種激素的峰面積響應，最大吸收峰距離260 nm 較遠的GA3和NAA 均下降較少，單一地偏向一側均會引起這二者中的一種吸光度急速下降，造成檢測困難。

表3 不同波長下各激素單位濃度的峰面積變化Table 3 Change of peak area of unit concentration of each hormone at different wavelengths

2.2.2 流動相梯度 目前激素檢測所需時間大多在30 min（含平衡時間）以上。本研究通過選擇合適的色譜柱并配合優(yōu)化后的流動相梯度，將檢測時間縮短到 12 min 以內 （圖 3），檢測 1 個樣品僅需 15 min（含平衡時間），檢測速度提高1 倍以上，極大地提高了檢測效率。

圖3 標準樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of standard samples

2.2.3 柱溫 柱溫對激素的分離效果影響顯著，特別是IAA 與ABA 之間的分離（圖4）。隨著溫度的升高，IAA 與ABA 的分離度逐漸增大（表4）。其中，25 ℃下IAA 和ABA 的峰幾乎為1 個，二者無法分離；30 ℃下二者分離度僅為1.10；35 ℃時分離度提升至1.68；40 ℃時二者基本分開，分離度達到2.24；45 ℃二者分離效果更佳，但有雜峰出現(xiàn)。因此，最終確定本研究的柱溫為40 ℃。而且，較高的柱溫還可在一定程度上提高檢測速度。

表4 不同溫度下IAA 與ABA 的分離度和末峰出峰時間Table 4 Separation of IAA and ABA and last peak time at different temperatures

圖4 不同柱溫條件下各種激素的分離效果Fig.4 Separation effect of various hormones under different column temperatures

2.2.4 流速 流速最主要的影響是出峰快慢，流速越高，出峰越早；同時還影響分離度（表5） 和峰型（圖5）。各流速下IAA 與ABA 的分離度均＞2，其中0.6 mL/min 流速下分離度最大、效果最佳，0.8 mL/min流速下次之。流速除了影響出峰快慢和分離度以外，還對峰型有影響。流速越慢，峰寬越大，其中0.6 mL/min流速下各激素的峰寬均最大（表6），NAA 的峰型甚至變塌。綜合考慮，最終確定流速為0.8 mL/min。

表6 不同流速條件下各種激素的峰寬Table 6 Peak width of various hormones at different flow rates

圖5 不同流速條件下各種激素的保留時間Fig.5 Retention time of various hormones at different flow rates

表5 不同流速下IAA 與ABA 的分離度和末峰出峰時間Table 5 Separation of IAA and ABA and last peak time at different flow rates

2.3 標準曲線

7 種植物激素在各自的線性范圍內，均與峰面積存在良好的線性關系，R2范圍0.999 7～1.000 0（表7），激素濃度與峰面積之間呈顯著正相關。

表7 各種激素的標準曲線Table 7 Standard curve of various hormones

2.4 樣品檢測與加標回收率

2.4.1 小麥樣品的激素測定 采用1.2.1 方法分別對小麥根、葉中的激素進行提取并檢測（圖7），經(jīng)計算，小麥根中的tZ、tZR、GA3、6-BA、IAA、ABA、NAA 含 量 分 別 為 18.82、 17.78、 776.04、 12.92、20.24、7.59 和 16.17 μg/g；葉中的 tZ、tRZ、GA3、IAA、ABA、NAA 含量分別為 10.76、2.18、892.60、2.33、30.09、30.20 和 34.01 μg/g，6-BA 未檢出。

圖7 小麥樣品色譜圖Fig.7 Chromatogram of wheat samples

2.4.2 加標回收率試驗 加標回收率試驗結果顯示，tZ、tZR、GA3、6-BA、IAA、ABA、NAA 的回收率分別為91.45%±0.29%、97.96%±0.77%、96.65%±1.17%、93.40%±0.45%、104.21%±1.85%、92.61%±0.15%和96.65%±2.84%。該方法準確度高，能夠滿足小麥中7種植物激素定量分析的要求。

3 結論與討論

本研究對高效液相色譜測定小麥激素的方法進行了優(yōu)化，最終確定雙pH 值條件（pH 值8.0 和3.0）對樣品進行提取，使用甲醇與0.8%冰醋酸對樣本進行梯度洗脫（時長15 min），柱溫40 ℃，流速0.8 mL/min，檢測器波長260 nm 的檢測方法。該方法能同時測定7種激素 （tZ、tZR、GA3、6-BA、IAA、ABA 和NAA），重復性好，回收率高，檢測效率高于一般3～4 種激素檢測的方法。同時本方法將檢測時間縮短到15 min，單人24 h 內可完成近百份樣品的提取與檢測，遠超每天二三十份樣品的檢測速度，極大地提高了高效液相色譜法在植物激素檢測中的檢測效率。而且該方法具有很好的拓展性，能較容易地應用到其他作物的激素檢測研究中。

需要特殊說明的是，目前大多數(shù)植物激素檢測選用 254 nm 作為檢測波長[11～13，17，18]，本研究通過波長掃描發(fā)現(xiàn)，各類激素的吸收峰峰型以及最大吸收峰所處的波長各不相同，其中，GA3的最大吸收峰處在250 nm，NAA 的最大吸收峰處在280 nm，其他激素的最大吸收峰處在二者之間。所以檢測波長太過偏于一測，會造成最大吸收峰在另一側的激素的峰面積響應急速下降，從而降低該激素的檢測效果。范光宇等[11]就曾經(jīng)使用254 nm 波長檢測NAA，發(fā)現(xiàn)其標品色譜峰中NAA 的峰面積明顯小于其他激素的峰面積，懷疑是NAA 對該波長光吸收響應太低所致。因此，檢測波長需要根據(jù)樣品所含激素的種類與含量進行調整，必要時進行雙邊測試。

另外，由于植物激素具有含量低、易破壞的特點，因此想要獲得理想的實驗結果，提取細節(jié)尤為重要，如整個提取過程需盡量簡化步驟、縮短流程且保持較低溫度，以減少激素的損失。

最后實驗樣品的色譜圖中除了待測峰以外，還存在一些雜峰且與待測物質相鄰，尚未能鑒定，懷疑可能有其他激素或激素修飾物存在，因此該方法還有進一步優(yōu)化的潛力。