袁先鈴，陳崇艷，彭先杰，袁玉梅，張 婷

（四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000）

醬肉是將豬后腿肉用甜面醬、香辛調(diào)味料腌制后經(jīng)自然風(fēng)干而成的一類(lèi)腌臘肉制品，具有色澤美觀、風(fēng)味濃郁的特點(diǎn)，因其獨(dú)有的風(fēng)味和口感受到越來(lái)越多消費(fèi)者的青睞。醬肉生產(chǎn)加工過(guò)程中主要以添加亞硝酸鹽的方法對(duì)其進(jìn)行護(hù)色和防腐。硝酸鹽或亞硝酸鹽是肉制品加工中應(yīng)用歷史最長(zhǎng)、范圍最廣的食品添加劑之一。這類(lèi)食品添加劑價(jià)格低廉，不僅可通過(guò)發(fā)色作用賦予肉制品良好的外觀色澤，增強(qiáng)肉制品腌制風(fēng)味，延緩脂肪氧化酸敗，還可抑制腐敗菌生長(zhǎng)繁殖，延長(zhǎng)肉制品貨架期，能有效防止致病菌（特別是肉毒桿菌、沙門(mén)氏菌）導(dǎo)致的食物中毒，受到生產(chǎn)者的歡迎。但是自上世紀(jì)70年代早期，人們認(rèn)識(shí)到亞硝酸鹽能與肉制品中的氨基酸反應(yīng)生成亞硝胺類(lèi)化合物（N-亞硝基吡咯烷、N-亞硝基二甲胺等），這類(lèi)化合物是強(qiáng)致癌物。除此之外，亞硝酸鹽被食用后在人體內(nèi)胃中還可以形成亞硝胺[1]，這在一定程度上給消費(fèi)者的身體健康埋下了隱患?？刂剖称分衼喯跛猁}使用及殘留量成為普遍關(guān)注的問(wèn)題，因此醬肉制品低硝化或無(wú)硝化是實(shí)現(xiàn)醬肉健康持續(xù)發(fā)展的必然趨勢(shì)[2-6]。

針對(duì)肉類(lèi)防腐，目前市場(chǎng)上已有較多的復(fù)配型肉制品保鮮劑，很多學(xué)者也在研究用幾種天然或者非天然的食品防腐劑來(lái)完全或者部分替代亞硝酸鹽[7-8]。徐海祥等[9]經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用乳酸鏈球菌素部分替代亞硝酸鹽，細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖得到顯著抑制，可大幅延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期。Thippareddi等[10]經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乳酸鹽可控制火雞肉中莢膜芽孢桿菌的數(shù)量。Zhang等[11]通過(guò)向牦牛肉糜中添加3種不同種類(lèi)的乳酸鹽替代亞硝酸鹽，結(jié)果表明，乳酸鹽可顯著提高肉色的穩(wěn)定性。Vareltzis等[12]測(cè)試結(jié)果顯示，在4℃和20℃條件下，甜菜堿/山梨酸鉀體系對(duì)芽孢桿菌的生長(zhǎng)比傳統(tǒng)亞硝酸鹽體系有更好的抑制作用。本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定Nisin、山梨酸鉀、雙乙酸鈉、乳酸鈉4種防腐劑對(duì)醬肉的菌落總數(shù)及揮發(fā)性鹽基氮含量的影響，結(jié)合正交試驗(yàn)探究最佳防腐劑復(fù)配效果，從而達(dá)到降低亞硝酸鹽使用量及殘留量、延長(zhǎng)貨架期的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

豬后腿肉、甜面醬、食鹽、曲酒、白砂糖、花椒面，均購(gòu)于四川省自貢市沃爾瑪超市。

Nisin、山梨酸鉀、雙乙酸鈉、乳酸鈉、亞硝酸鈉、D-異抗壞血酸鈉，均為食品級(jí)，河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 儀器與設(shè)備

GZ-250-S低溫生化培養(yǎng)箱：上海AL5O設(shè)備有限公司；BagMixer均質(zhì)機(jī)：法國(guó)Interscience公司；DZQ-5002SB型真空包裝機(jī)：上海圣松有限公司；WFJ7200可見(jiàn)分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；SKY-2102C搖床：上海珂準(zhǔn)儀器有限公司；JJ-CJ-1FD潔凈工作臺(tái)：蘇州市金凈凈化設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 川味醬肉配方

川味醬肉的工藝配方為（以鮮肉百分含量計(jì)）：肥瘦質(zhì)量比約為3∶7、食鹽4%、曲酒0.5%、白砂糖1%、花椒面0.3%、甜面醬9%。

1.2.2 工藝流程

1.2.3 操作要點(diǎn)

選擇帶皮豬后腿肉，切成厚度2～3 cm，重約300 g小長(zhǎng)條；用無(wú)菌水清洗肉塊，去除肉表面淤血、豬毛等雜物，晾干；將配料及防腐劑均勻涂抹在肉的表面，保鮮袋封口放入7℃冰箱中腌制4 d，期間上下翻動(dòng)3次，促使腌制均勻；將肉掛于溫度10℃、相對(duì)濕度40%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，待表面微干，上面醬，當(dāng)醬半干時(shí)，重復(fù)上述步驟兩遍，待上醬完成后置于培養(yǎng)箱中3 d。再經(jīng)過(guò)常溫風(fēng)干12 h，當(dāng)醬肉表面不再出現(xiàn)大的水珠時(shí)50℃干燥11 h；將制作好的醬肉進(jìn)行真空包裝，23℃下保存待用。

1.2.4 測(cè)定項(xiàng)目與方法

揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）：采用GB5009.228—2016[13]中的方法測(cè)定；菌落總數(shù)：按照GB4789.2—2016[14]中的方法測(cè)定；亞硝酸鹽殘留量：按照GB 5009.33—2016[15]中的鹽酸萘乙二胺法測(cè)定；貨架期：結(jié)合ALST法[16]預(yù)測(cè)。

1.2.5 試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

1.2.5.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在醬肉腌制時(shí)期分別添加山梨酸鉀、Nisin、乳酸鈉、雙乙酸鈉等防腐劑，確定各個(gè)防腐劑單一濃度變量對(duì)醬肉防腐效果的影響,添加量均在食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)（GB 2760—2014[17]）范圍內(nèi)，如表1所示。在每組醬肉中添加0.04 g/kg的亞硝酸鹽作為護(hù)色劑，添加0.7 g/kg的D-異抗壞血酸作為助色劑[12]。在醬肉制作好開(kāi)始計(jì)時(shí)，在添加不同防腐劑的情況下，以0、3、6、13、20、27 d為檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮含量和亞硝酸鹽含量等指標(biāo)[5,18-20]。

1.2.5.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)確定防腐劑最佳用量范圍，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，選取防腐劑最佳復(fù)配比。在醬肉制作好開(kāi)始計(jì)時(shí)，分別測(cè)定0、3、6、13、20、27 d菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮含量和亞硝酸鹽含量等指標(biāo)。

1.2.5.3 貨架期預(yù)測(cè)方法

研究采用Q10法進(jìn)行預(yù)測(cè)，設(shè)置差值為10℃的兩個(gè)溫度進(jìn)行儲(chǔ)藏，則兩個(gè)溫度下的貨架壽命比率Q10的計(jì)算公式見(jiàn)式（1），再根據(jù)式（2）即可得到醬肉在7℃、23℃下儲(chǔ)藏的貨架期[16]。

式（2）中，QS(t)為t℃下的貨架期，QS(t0)為t0℃下的貨架期。

將包裝好的醬肉分別置于27℃和37℃溫度下的恒溫箱內(nèi)。每天取37℃恒溫箱內(nèi)的醬肉測(cè)其菌落總數(shù)；每3 d取27℃恒溫箱中醬肉測(cè)其菌落總數(shù)。根據(jù)GB 2730—2015[21]菌落總數(shù)為80 000 CFU/g作為醬肉變質(zhì)的終點(diǎn)，測(cè)得醬肉在兩種情況下的貨架期。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2013對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，將各個(gè)指標(biāo)用SPSS進(jìn)行方差分析（ANOVA），用多重比較法分析差異顯著性，其中P＜0.05表示差異顯著。使用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 山梨酸鉀對(duì)醬肉的防腐效果

山梨酸鉀對(duì)肉制品有較明顯的防腐作用[20]，由圖1可知，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，菌落總數(shù)總體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，在0～6 d時(shí)菌落總數(shù)增加明顯，之后菌落總數(shù)的增加趨勢(shì)變緩，在27 d時(shí)，山梨酸鉀添加量為0.70、1.05、1.40 g/kg的菌落總數(shù)水平在104～105CFU/g，添加量為0.35、0.70 g/kg兩組的菌落總數(shù)差值最大，說(shuō)明在此濃度范圍的山梨酸鉀對(duì)菌落總數(shù)的影響最大。由圖2可知，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，揮發(fā)性鹽基氮含量總體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，0 d時(shí)揮發(fā)性鹽基氮含量約13 mg/100 g，在儲(chǔ)藏后期（20～27 d）時(shí)，山梨酸鉀添加量為0.70 g/kg時(shí)揮發(fā)性鹽基氮增長(zhǎng)較其他組緩慢，且最終揮發(fā)性鹽基氮與添加量0.35 g/kg的含量相差很小。選取0.35～0.70 g/kg濃度范圍的山梨酸鉀進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖1 山梨酸鉀添加量對(duì)醬肉菌落總數(shù)的影響Fig.1 Effects of potassiumsorbate additionson the total numbers of coloniesin sauced meat

圖2 山梨酸鉀添加量對(duì)醬肉揮發(fā)性鹽基氮含量的影響Fig.2 Effects of potassiumsorbateadditionson TVB-Ncontents in sauced meat

2.2 Nisin對(duì)醬肉防腐效果的影響

Nisin對(duì)肉制品有較明顯的防腐作用[22-24]，由圖3可知，隨儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，菌落總數(shù)總體呈上升趨勢(shì)，在0～6 d時(shí)菌落總數(shù)增加很明顯，之后菌落總數(shù)的增加趨勢(shì)減緩。在27 d時(shí)，Nisin添加量為0.09 g/kg組菌落總數(shù)最多，超過(guò)了106CFU/g，說(shuō)明在此濃度下Nisin對(duì)醬肉的防腐效果不理想，其余幾組菌落總數(shù)相對(duì)較少（105CFU/g左右）。添加量為0.35 g/kg時(shí)菌落總數(shù)與添加量為0.18、0.27 g/kg相差較小，按照添加劑最小原則，選取Nisin添加量范圍為0.18～0.27 g/kg進(jìn)行正交試驗(yàn)。由圖4可知，揮發(fā)性鹽基氮含量總體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，但是與對(duì)照組相比，不同的Nisin添加量對(duì)揮發(fā)性鹽基氮含量影響不大。0 d時(shí)的揮發(fā)性鹽基氮含量在13 mg/100 g左右，27 d時(shí)揮發(fā)性鹽基氮含量上升到31 mg/100 g。因此，依照菌落總數(shù)指標(biāo)，選取Nisin添加量范圍為0.18～0.27 g/kg進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖3 Nisin添加量對(duì)醬肉菌落總數(shù)的影響Fig.3 Effects of Nisin additionson thetotal numbers of coloniesin sauced meat

圖4 Nisin添加量對(duì)醬肉揮發(fā)性鹽基氮含量的影響Fig.4 Effects of Nisin additionson TVB-Ncontents in sauced meat

2.3 雙乙酸鈉對(duì)醬肉防腐效果的影響

雙乙酸鈉對(duì)肉制品有較明顯的防腐作用[20,25]，由圖5可知，雙乙酸鈉添加量1.10 g/kg與1.65 g/kg組醬肉菌落總數(shù)相差較大，說(shuō)明此濃度范圍對(duì)菌落總數(shù)影響最大。由圖6可知，試驗(yàn)組揮發(fā)性鹽基氮的含量均高于對(duì)照組，雙乙酸鈉添加量對(duì)揮發(fā)性鹽基氮含量影響不明顯，其添加量在1.65 g/kg時(shí)揮發(fā)性鹽基氮含量最低，因此將此添加量作為最適添加量的參考。綜合分析，選取1.10～1.65 g/kg濃度范圍的雙乙酸鈉進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖5 雙乙酸鈉添加量對(duì)醬肉菌落總數(shù)的影響Fig.5 Effects of sodiumdiacetateadditionson thetotal numbers of coloniesin sauced meat

圖6 雙乙酸鈉添加量對(duì)醬肉揮發(fā)性鹽基氮含量的影響Fig.6 Effects of sodiumdiacetateadditions on TVB-Ncontentsin sauced meat

2.4 乳酸鈉對(duì)醬肉防腐效果的影響

乳酸鈉對(duì)肉制品有較明顯的防腐作用[26]，由圖7可知，在乳酸鈉添加量為10～20 g/kg時(shí)，菌落總數(shù)的差值最大，說(shuō)明乳酸鈉在此濃度范圍對(duì)醬肉的菌落總數(shù)影響最大。由圖8可知，27 d時(shí)乳酸鈉添加量為30 g/kg和20 g/kg的醬肉揮發(fā)性鹽基氮含量接近，故可選擇20 g/kg乳酸鈉作為最佳添加量。綜合分析，選取10～20 g/kg濃度范圍的乳酸鈉進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖7 乳酸鈉添加量對(duì)醬肉菌落總數(shù)的影響Fig.7 Effects of sodiumdiacetateadditionson thetotal numbers of coloniesin sauced meat

圖8 乳酸鈉添加量對(duì)醬肉揮發(fā)性鹽基氮含量的影響Fig.8 Effects of sodiumlactate additions on TVB-Ncontentsin sauced meat

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

復(fù)合防腐劑對(duì)肉類(lèi)防腐有顯著優(yōu)勢(shì)[27-29]，根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表，測(cè)定不同處理組的菌落總數(shù)及揮發(fā)性鹽基氮含量，計(jì)算各組指標(biāo)及平均值，結(jié)果見(jiàn)表2。

根據(jù)表2可知，就菌落總數(shù)而言，根據(jù)極差分析，各防腐劑對(duì)醬肉防腐效果影響次序?yàn)椋荷嚼嫠徕洠救樗徕c＞Nisin＞雙乙酸鈉，最優(yōu)復(fù)配組合為A3B3C2D3，即各個(gè)防腐劑添加量為：山梨酸鉀0.70 g/kg、Nisin 0.22 g/kg、雙乙酸鈉1.40 g/kg、乳酸鈉20 g/kg。各防腐劑對(duì)醬肉揮發(fā)性鹽基氮生成影響次序?yàn)椋荷嚼嫠徕洠倦p乙酸鈉＞Nisin＞乳酸鈉，最優(yōu)復(fù)配組合為A3B3C3D3，即各個(gè)防腐劑添加量為：山梨酸鉀0.70 g/kg、Nisin 0.22 g/kg、雙乙酸鈉1.65 g/kg、乳酸鈉20 g/kg。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental design and results

綜上所述，這幾種防腐劑對(duì)菌落總數(shù)的影響較大，對(duì)揮發(fā)性鹽基氮的影響較小，最優(yōu)配比可以依照菌落總數(shù)的最優(yōu)配比來(lái)選擇，但是在GB2760—2014[17]添加劑使用原則中提及各防腐劑的用量占其最大用量的比列和不應(yīng)超過(guò)1，而以上兩個(gè)最優(yōu)復(fù)配組合比例和都大于1，就實(shí)際生產(chǎn)而言是無(wú)意義的。根據(jù)主次影響因素，主要因素是山梨酸鉀，次要因素是乳酸鈉，然后才是Nisin和雙乙酸鈉，可將主要因素和次要因素選擇為A3D3，另外兩個(gè)添加劑選定為B1C1，即最優(yōu)組合為A3B1C1D3，此時(shí)各個(gè)防腐劑添加量為：山梨酸鉀0.70 g/kg、Nisin 0.18 g/kg、雙乙酸鈉1.15 g/kg、乳酸鈉20 g/kg。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，按照A3B1C1D3最優(yōu)復(fù)配添加量制作醬肉并測(cè)其揮發(fā)性鹽基氮和菌落總數(shù)，27 d時(shí)菌落總數(shù)為2.37×104CFU/g，與正交試驗(yàn)第7組的菌落總數(shù)相近；27 d時(shí)揮發(fā)性鹽基氮含量為34.88 mg/100 g，比正交試驗(yàn)第8組減小了0.38 mg/100 g，防腐效果較好。此時(shí)亞硝酸鹽殘留量為3.15 mg/kg，與對(duì)照組相比降低了6.55 mg/kg，達(dá)到了降低亞硝酸鹽殘留量的目的。

2.6 亞硝酸鹽殘留量分析

選取單因素中最優(yōu)添加量測(cè)定亞硝酸鹽殘留量，結(jié)果如圖9所示。

圖9 亞硝酸鹽殘留量的測(cè)定Fig.9 Determination of nitrite residue

由圖9可知，在不影響對(duì)醬肉的防腐情況下，4種防腐劑按最優(yōu)添加量加入，能明顯降低亞硝酸鹽的殘留量，達(dá)到預(yù)期的試驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

2.7 最優(yōu)組貨架期的確定

2.7.1 醬肉在37℃下菌落總數(shù)的變化趨勢(shì)

由圖10可知，在37℃的條件下，隨著時(shí)間的增加，醬肉菌落總數(shù)增加趨勢(shì)較為明顯，在第8天時(shí)達(dá)到80000CFU/g，參考腌臘肉制品標(biāo)準(zhǔn)GB2730—2015[21]，醬肉已腐敗，可確定醬肉在37℃下貨架期為8 d。

圖10 醬肉在37℃下菌落總數(shù)的變化趨勢(shì)Fig.10 Variation trends of thetotal numbers of coloniesin sauced meat at 37℃

2.7.2 醬肉在27℃下菌落總數(shù)的變化趨勢(shì)

由圖11可知，在27℃下，隨著時(shí)間的增加，在第23天菌落總數(shù)達(dá)到80 000 CFU/g，根據(jù)GB 2730—2015[21]，醬肉已腐敗，可確定醬肉在27℃下貨架期為23 d。

2.7.3 醬肉貨架期的預(yù)測(cè)結(jié)果

本研究采用Q10貨架期預(yù)測(cè)模型對(duì)醬肉的貨架期進(jìn)行預(yù)測(cè)[16,30-32]。綜合圖10和圖11得出27℃儲(chǔ)藏條件下的貨架期為23 d，37℃儲(chǔ)藏條件下的貨架期為8 d，帶入式（1）求出Q10，即Q10=t℃下的貨架期/（t+10）℃下的貨架期=23/8=2.875；預(yù)測(cè)得到常溫23℃下醬肉貨架期為Qs2(23℃)=Qs(t0)×Q10(t0-t)/10=23×2.875(27-23)/10=35 d，低溫7℃下醬肉貨架期為Qs3(7℃)=Qs(t0)×Q10(t0-t)/10=23×2.875(27-7)/10=190 d?？梢?jiàn)低溫儲(chǔ)藏可大大延長(zhǎng)醬肉貨架期，應(yīng)用Arrhenius關(guān)系式建立貨架期預(yù)測(cè)模型可以在較高溫度下收集數(shù)據(jù)，然后用外推方法求得在較低溫度下的貨架壽命，大大縮減了貨架期試驗(yàn)時(shí)間。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了山梨酸鉀、Nisin、雙乙酸鈉和乳酸鈉有效達(dá)到醬肉防腐目的的同時(shí)降低了亞硝酸鹽的殘留量。通過(guò)正交試驗(yàn)及綜合分析，確定最優(yōu)復(fù)配組合為A3B1C1D3，各個(gè)防腐劑添加量為：山梨酸鉀0.70 g/kg、Nisin 0.18 g/kg、雙乙酸鈉1.15 g/kg、乳酸鈉20 g/kg。并且進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期相符，菌落總數(shù)為2.37×104CFU/g，揮發(fā)性鹽基氮含量為34.88 mg/100 g，亞硝酸鹽殘留量為3.15 mg/kg，與對(duì)照組相比降低了6.55 mg/kg，達(dá)到了降低亞硝酸鹽殘留量的目的。利用ASLT法測(cè)得醬肉在7℃貨架期為190 d，23℃常溫下可儲(chǔ)藏35 d左右，低溫儲(chǔ)藏更有利于醬肉的保存。