王晨笑，青舒婷，王丹鳳,鄭 妍，徐學(xué)兵，岳 進,3,*

（1.上海交通大學(xué)食品科學(xué)與工程系，上海 200240；2.豐益全球研發(fā)中心，上海 200240；3.上海交通大學(xué)四川研究院，四川 成都 610000）

大豆分離蛋白（Soy Protein Isolate,SPI）是食品工業(yè)中使用最廣泛的植物蛋白之一。SPI的蛋白質(zhì)組成、結(jié)構(gòu)、變性和聚集程度對于其功能特性有較大影響。凝膠特性是蛋白質(zhì)非常重要的一種功能特性，蛋白質(zhì)凝膠可以在食品體系中提供一個容納水、脂肪、風(fēng)味物質(zhì)和食品成分的結(jié)構(gòu)基體。SPI凝膠被廣泛用于肉類產(chǎn)品中，包括香腸、午餐肉和丸子等傳統(tǒng)肉類產(chǎn)品或人造肉等新型肉類產(chǎn)品[1]。誘導(dǎo)SPI形成凝膠的常用方法有熱誘導(dǎo)、酸誘導(dǎo)、鹽誘導(dǎo)和酶誘導(dǎo)等，通過不同方法形成的凝膠在機械性能、流變性能、質(zhì)地及保水能力方面各不相同。熱誘導(dǎo)是指通過加熱使球蛋白天然致密結(jié)構(gòu)展開，從而導(dǎo)致原本被掩埋的疏水性殘基暴露，進而促進變性蛋白質(zhì)的聚集[2]。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（Glutamine Transaminase,TGase）又稱轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，是一種蛋白質(zhì)-谷氨酰胺γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶，可通過催化蛋白質(zhì)結(jié)合的谷氨酰胺的λ-羧酰胺與賴氨酸之間的?；D(zhuǎn)移，形成ε-（λ-谷氨酰胺）-賴氨酸交聯(lián)鍵來修飾蛋白質(zhì)[3-4]。

由于SPI凝膠的硬度和黏彈性較差，限制了其應(yīng)用，通常需要經(jīng)過改性或加入一些交聯(lián)劑進行輔助，增強凝膠強度[5-6]。在食品體系中，當酚類化合物與蛋白質(zhì)均存在時，其間會發(fā)生相互作用使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進而影響蛋白質(zhì)的一些功能特性，如乳化性和凝膠特性等[7]。這一相互作用可以以共價或非共價方式發(fā)生：在堿性條件下，多酚可以被氧化為醌，與蛋白質(zhì)的巰基或氨基發(fā)生不可逆的相互作用，從而通過酚環(huán)形成共價結(jié)合；而非共價相互作用主要通過氫鍵、范德華力和疏水相互作用實現(xiàn)[8]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin Gallate,EGCG）是綠茶中最豐富、最活躍的兒茶素單體，其分子結(jié)構(gòu)包含3個芳香環(huán)，1個吡喃環(huán)和8個酚羥基。由于EGCG分子具有多個羥基，使其具有卓越的功能特性和理化活性，包括常見酚類化合物中較高的自由基清除能力、抗炎癥能力、降血脂能力和癌癥抑制能力[9]。目前已有一些研究關(guān)注到多酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)發(fā)生變化[10-11]。劉勤勤等[12]發(fā)現(xiàn)，茶多酚可以與SPI中的色氨酸殘基發(fā)生相互作用，改變SPI的分子構(gòu)象。Jia等[13]報道，乳清蛋白與EGCG之間的共價相互作用改變了乳清蛋白的構(gòu)象結(jié)構(gòu)并改善了其理化特性。李楊等[14]發(fā)現(xiàn)與EGCG復(fù)合后的SPI乳化特性顯著提高。但多酚類物質(zhì)與SPI共同形成凝膠的研究鮮有報道。

本研究重點考察EGCG對熱誘導(dǎo)和TG誘導(dǎo)的SPI凝膠特性的影響，以表面疏水性、自由巰基含量、內(nèi)源熒光光譜和圓二色譜探究EGCG對SPI結(jié)構(gòu)的影響，并分析了EGCG/SPI凝膠體系的作用力、機械性能、流變學(xué)特性和微觀結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白（蛋白質(zhì)含量85.1%），由豐益（上海）生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司提供；表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG），純度＞95%，購自僑怡生物科技（上海）有限公司；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（TG），購自江蘇一鳴生物股份有限公司。試驗中所用試劑均為分析純，所用水均為去離子水。

1.1.2 儀器與設(shè)備

M200 Pro多功能酶標儀，瑞士Tecan公司；J-815圓二色光譜儀，日本JASOC公司；TA.XTPlus Texture Analyzer質(zhì)構(gòu)儀，英國StableMicroSystems公司；Haake-RheoStress6000流變儀，美國賽默飛公司；D-1903拉曼圖像-掃描電子顯微鏡聯(lián)用儀，捷克WITec公司。

1.2 方法

1.2.1 SPI-EGCG復(fù)合凝膠的制備

用磷酸緩沖液（0.1 mol/L,pH 7.4）溶解SPI，磁力攪拌2 h，配制成12%的溶液備用。將EGCG（0.01、0.02、0.05 g/g）加入SPI溶液制備混合液。取適量樣品，用磷酸緩沖液（0.1mol/L,pH 7.4）稀釋至SPI濃度為1 mg/mL，用于蛋白性質(zhì)測定。

參考Ben-Harb等[2]的方法，采用熱誘導(dǎo)與酶誘導(dǎo)兩種方法制備SPI-EGCG復(fù)合凝膠。將SPI-EGCG混合物置于90℃加熱30 min，然后放入冰水浴中冷卻，4℃下穩(wěn)定24 h后，制得熱誘導(dǎo)凝膠。在SPI-EGCG混合物中加入TG（50 U/g）后在45℃下保持2 h，制得酶誘導(dǎo)凝膠。

1.2.2 蛋白表面疏水性

表面疏水性能采用熒光法測定，熒光探針選用8-苯胺-1-萘磺酸（ANS）。取一定量的混合物稀釋至SPI濃度分別為0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL。分別取不同濃度稀釋樣品4 mL，在390 nm激發(fā)波長和470 nm發(fā)射波長下分別測定樣品的熒光強度（FI0）和樣品加入20μL ANS溶液（8 mmol/L）后的熒光強度（FI1），兩者差值記為FI。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，F(xiàn)I為縱坐標作圖，曲線初始階段的斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)，記為H0。

1.2.3 自由巰基含量

準確稱取10.42 g Tris、6.76 g甘氨酸和1.49 g EDTA溶于900 mL去離子水中，調(diào)節(jié)pH至8.0后，定容至1 L，得標準緩沖溶液。準確稱取0.2 g 5，5′-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）溶于50 mL標準緩沖液中，制得Ellman試劑。

取1 mg/mL的SPI溶液4 mL，加入40μLEllman試劑，混勻后于25℃恒溫水浴中保溫45 min，用紫外分光光度計在412 nm波長下測定吸光值。以不加樣品只加Ellman試劑作為試劑空白，以Ellman試劑只加樣品溶液作為樣品空白。游離巰基含量可以通過下式計算得出：

式中：A412為除去樣品空白和試劑空白后的吸光值；D為稀釋倍數(shù)；13 600為DTNB的摩爾吸光系數(shù)，L/（mol·cm）；C為樣品中蛋白質(zhì)含量，mg/mL。

1.2.4 內(nèi)源熒光光譜

使用熒光酶標儀獲得SPI-EGCG復(fù)合物的內(nèi)源熒光光譜。激發(fā)波長設(shè)定為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別設(shè)定為5 nm。發(fā)射波長范圍設(shè)置為300～400 nm，掃描速度為10nm/s。

1.2.5 蛋白二級結(jié)構(gòu)

采用圓二色譜（Circular Dichroism,CD）分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。參考Zhou等[15]的方法，選擇0.1 mg/mL的蛋白質(zhì)濃度用于CD光譜分析。在室溫下，用圓二色光譜儀在240～190 nm下掃描樣品，掃描速度為1 nm/s，帶寬為1.0 nm，響應(yīng)時間為0.25 s。收集的光譜數(shù)據(jù)通過DICHROWEB軟件進行分析。

1.2.6 凝膠分級溶解度

參考Gómez-Guillén等[16]的方法。將3 g凝膠樣品與30 mL的四種溶劑混合：0.6 mol/L氯化鈉（S1）；0.6 mol/L氯化鈉+1.5 mol/L尿素（S2）；0.6 mol/L氯化鈉+8 mol/L尿素（S3）；0.6 mol/L氯化鈉+8 mol/L尿素+0.5 mol/Lβ-巰基乙醇（S4）。將混合物以9 000 r/min離心15 min，并收集上清液。將5 mL 20%三氯乙酸添加到等體積的上清液中，并放置在冰箱中過夜以沉淀蛋白質(zhì)。之后，將混合物以7 200 r/min離心20 min，收集沉淀，并將沉淀物溶解于1 mol/L的NaOH中，用縮二脲法測定蛋白質(zhì)含量。凝膠在S1、S2、S3、S4中的溶解度分別代表離子鍵、氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵的貢獻。

1.2.7 凝膠流變特性

參考Pang等[17]的方法，使用流變儀分析凝膠的流變特性。使用直徑27 mm的圓形平板探頭進行測量，測量間距為1 mm。將混合物倒在流變儀上，按照測量間距設(shè)置探頭位置，覆蓋一層石蠟油，按照“1.2.1”的方法在流變儀上制備凝膠，并進行0.1%～100%，1 Hz的應(yīng)變掃描。

1.2.8 凝膠強度

參考Li等[18]的方法，使用質(zhì)構(gòu)儀在室溫下分析凝膠的強度。使用圓柱形探針（直徑30 mm），測試前速度為1.5 mm/s，測試速度和測試后速度均為1.0 mm/s，壓縮距離和觸發(fā)力分別為4.0 mm和5 g。最大持續(xù)壓縮力即為凝膠強度。

1.2.9 凝膠形態(tài)

根據(jù)Wu等[19]的方法，使用掃描電子顯微鏡觀察SPI凝膠形態(tài)。將3 g樣品在2.5%戊二醛磷酸鈉緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.2）中固定1 h，浸入磷酸鹽緩沖液中在4℃冰箱中保存24 h。將樣品用磷酸鈉緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.2）漂洗3次，每次15 min，并將樣品凍干。掃描電子顯微鏡在5 kV加速電壓下觀察固定樣品。

1.2.10 凝膠持水力（WHC）

參考Liu等[20]的方法，略有改動。將凝膠在4℃下用9 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，除去上清液后，記錄離心前后離心管和凝膠的總質(zhì)量。WHC（%）可以通過以下公式計算得出：

式中：m0為空管的質(zhì)量（g），m1和m2分別代表離心前后管和凝膠的質(zhì)量（g）。

1.2.11 數(shù)據(jù)處理

凝膠強度試驗重復(fù)10次，其他每項試驗重復(fù)3次。均值和標準差的統(tǒng)計分析通過SPSS26.0完成，使用Duncan多范圍檢驗（P＜0.05）進行單向方差分析，以檢測平均值之間的顯著性差異。使用OriginPro 2018進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPI表面疏水性和自由巰基含量

SPI的表面疏水性隨EGCG濃度的增加而增強（圖1）。蛋白質(zhì)的表面疏水性主要是由聚集的非極性基團與水分子之間的排斥作用力引起的[21]，EGCG可以與蛋白質(zhì)中的疏水基團發(fā)生相互作用，導(dǎo)致這一作用力增強。加入EGCG促進SPI自由巰基含量的增加，且低濃度下增加明顯（圖1），這表明EGCG與蛋白質(zhì)的非共價結(jié)合促進了蛋白質(zhì)的展開，使得更多的巰基被暴露。多酚對蛋白質(zhì)表面疏水性和自由巰基含量的影響已有較多報道，Jiang等[22]發(fā)現(xiàn)，花青素的添加對SPI自由巰基含量有較大影響，在添加較高濃度花青素時可能生成SPI-花青素共價復(fù)合物，使自由巰基含量有所下降。

圖1 EGCG 添加量對SPI表面疏水性和自由巰基含量的影響Fig.1 Effects of EGCG additions on surface hydrophobicity and free sulfhydryl contents of SPI

2.2 SPI內(nèi)源熒光光譜

天然蛋白質(zhì)分子中的色氨酸和酪氨酸殘基是內(nèi)源熒光的主要來源。SPI在325 nm處顯示出最大發(fā)射波長（圖2），加入EGCG降低了SPI的熒光強度，這可能是由于SPI結(jié)構(gòu)由于EGCG的加入發(fā)生展開，色氨酸殘基暴露程度增加，被親水環(huán)境包圍。較高濃度EGCG使SPI的最大發(fā)射峰出現(xiàn)輕微紅移（6 nm）。Sui等[23]發(fā)現(xiàn)，花青素-SPI非共價復(fù)合物具有更低的蛋白質(zhì)熒光強度，證明了SPI和花青素之間的相互作用誘導(dǎo)了SPI多肽鏈的解鏈和結(jié)構(gòu)變化。

圖2 EGCG 添加量對SPI內(nèi)源熒光光譜的影響Fig.2 Effects of EGCG additions on fluorescence spectra of SPI

2.3 SPI二級結(jié)構(gòu)

與未添加EGCG的SPI相比，添加EGCG后SPI的無序結(jié)構(gòu)（β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲）含量明顯增加，β-折疊含量明顯減少（表1）。這一結(jié)果說明EGCG的加入導(dǎo)致SPI的聚集程度降低，蛋白質(zhì)鏈出現(xiàn)松弛和拉伸，分子柔性增強。蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要由氫鍵維持[24]，而以上變化可能有助于SPI在凝膠形成過程中發(fā)生更多氫鍵之間的相互作用，形成更強的凝膠結(jié)構(gòu)。Cao等[25]研究發(fā)現(xiàn)，多酚的添加會破壞維持α-螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵，促進蛋白質(zhì)的展開，從而導(dǎo)致在凝膠形成過程中形成更多的氫鍵。

表1 EGCG添加量對SPI二級結(jié)構(gòu)的影響Table 1 Effects of EGCGadditionson the secondary structure of SPI

2.4 SPI凝膠分級溶解度

離子鍵、氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵等化學(xué)力的作用使蛋白質(zhì)形成凝膠[26]。特定的化學(xué)試劑可以裂解特定的作用力，使凝膠部分溶解于其中，溶解的蛋白質(zhì)含量與凝膠中該作用力的大小有關(guān)[17]。不同EGCG添加量下的SPI凝膠的分級溶解度如圖3所示。TG可以在蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)形成ε-（γ-谷氨?；?賴氨酸交聯(lián)，建立穩(wěn)定的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，從而形成凝膠[3]，因而在TG誘導(dǎo)的SPI凝膠中的四種化學(xué)力均顯著低于熱誘導(dǎo)的SPI凝膠（P＜0.05）。形成熱凝膠的主要化學(xué)力為二硫鍵和疏水相互作用，EGCG的添加增強了熱凝膠的氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵。一方面，多酚的添加有助于凝膠網(wǎng)絡(luò)中氫鍵的形成，并且二級結(jié)構(gòu)的變化使得更多氫鍵可以相互作用；另一方面，由于EGCG的添加造成的蛋白質(zhì)鏈拉伸使得其表面疏水性增強，二硫鍵增多，由自由巰基間的交聯(lián)反應(yīng)驅(qū)動的熱誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集增加，使得疏水相互作用及二硫鍵在SPI熱凝膠網(wǎng)絡(luò)中的數(shù)量增加，特別是在較低濃度EGCG的情況下[27-28]。

圖3 不同EGCG 添加量對SPI凝膠分級溶解度的影響Fig.3 Effects of EGCG additions on protein fractional solubility of SPIgels

2.5 SPI凝膠機械性能

儲存模量（G’），又稱彈性模量，可以反映在某些應(yīng)變或應(yīng)力下凝膠的能量存儲能力[29]。由圖4可知，TG誘導(dǎo)凝膠儲存模量明顯高于熱誘導(dǎo)凝膠，這是由于熱凝膠和酶凝膠形成機理不同，機械性能存在較大差異，而EGCG的添加均增加這兩種SPI凝膠的儲存模量，因為EGCG使凝膠結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)固，凝膠表現(xiàn)出更強的彈性和對抗應(yīng)力的能力。EGCG添加量為0.01 g/g時，兩種SPI凝膠的儲存模量最大，更高的EGCG添加量反而使儲存模量下降，可能由于高濃度的多酚使聚集蛋白質(zhì)之間的相互作用減弱，削弱凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。Ai等[30]在堿誘導(dǎo)的鴨蛋蛋清凝膠中添加茶多酚，同樣發(fā)現(xiàn)較高的茶多酚濃度會使凝膠的儲存模量降低。

圖4 不同EGCG 添加量對SPI凝膠彈性模量的影響Fig.4 Effects of EGCG additionsonelastic modulus of SPIgels

由圖5可知，加入EGCG，凝膠強度增大，TG誘導(dǎo)的SPI凝膠強度均高于熱誘導(dǎo)的SPI凝膠，說明酶誘導(dǎo)的凝膠具有更牢固緊密的結(jié)構(gòu)，所能承受的最大壓力更大。另外，隨著EGCG添加量的增加，SPI凝膠的凝膠強度先升高后降低，與儲存模量的變化趨勢一致。這同樣可以說明當EGCG添加量過高時會減弱蛋白之間的分子相互作用，使得凝膠強度下降。

圖5 EGCG 添加量對SPI凝膠強度的影響Fig.5 Effects of EGCG additions on the gel strength of SPIgels

2.6 SPI凝膠微觀結(jié)構(gòu)

在熱誘導(dǎo)凝膠化過程中，分子會逐漸舒展并隨后發(fā)生聚集，進而形成不可逆的凝膠結(jié)構(gòu)[31]。未添加EGCG的熱凝膠表面粗糙，凝膠網(wǎng)絡(luò)稀疏（圖6A）。隨著EGCG的加入，凝膠網(wǎng)絡(luò)變得更加規(guī)則和均勻，孔徑減小，表明凝膠形成了更多的三維結(jié)構(gòu)。與熱凝膠相比，酶凝膠具有更致密和均勻的結(jié)構(gòu)。并且添加0.01、0.02 g/g EGCG同樣使蛋白質(zhì)凝膠表現(xiàn)出更為精細且多孔的結(jié)構(gòu)（圖6F、G），說明EGCG的添加可以在一定程度上改善蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。而當EGCG添加量增加到0.05 g/g時，SPI熱凝膠與酶凝膠的孔徑又變大，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的松散也使得其彈性模量與凝膠強度下降。與該結(jié)果相似，Zhu等[32]發(fā)現(xiàn)，谷酰胺轉(zhuǎn)氨酶誘導(dǎo)的凝膠具有更均勻致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)以及更小的孔分布，其凝膠強度更強，持水力更好。

圖6 SPI凝膠掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron micrographs of SPIgels

2.7 SPI凝膠持水力

對于熱誘導(dǎo)和酶誘導(dǎo)形成的SPI凝膠，添加EGCG均能提高凝膠的持水力（表2）。這可能由于添加EGCG造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，形成高密度的孔結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定的凝膠，從而有效固定水分。相比于熱誘導(dǎo)SPI凝膠，酶誘導(dǎo)SPI凝膠具有更高的持水力，這得益于其更穩(wěn)定和致密的結(jié)構(gòu)。熱誘導(dǎo)SPI凝膠持水力隨EGCG添加量的增加而持續(xù)增強，說明蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)更牢固，可以較好地保留其中的水，并且更為復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)也阻止了水分子的滲出。Dai等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在熱誘導(dǎo)形成肌球蛋白凝膠過程中加入咖啡酸可以增強其凝膠強度和持水力，因為咖啡酸可以增強肌球蛋白的疏水作用和氫鍵，加速肌球蛋白的凝膠形成。

表2 EGCG添加量對SPI凝膠持水力的影響Table 2 Effects of EGCGadditionson thewater holding capacity of SPIgels

3 結(jié)論

EGCG與SPI間的非共價結(jié)合可以引起SPI構(gòu)象的變化，使其表面疏水性、自由巰基含量增加，蛋白鏈舒展。在SPI熱誘導(dǎo)和酶誘導(dǎo)凝膠形成過程中加入EGCG可以使SPI發(fā)生更多交聯(lián)和相互作用，增強了熱凝膠的氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵作用力，提高熱凝膠和酶凝膠的機械性能和持水力，特別是在酶凝膠中。0.01 g/g的EGCG添加量下，兩種凝膠具有最高的儲存模量和凝膠強度，凝膠結(jié)構(gòu)最為穩(wěn)定。因此，在蛋白凝膠形成過程中加入多酚可以改善凝膠結(jié)構(gòu)，促進更大強度凝膠的形成。在后續(xù)研究中，可以結(jié)合核磁共振波譜等手段測定結(jié)合位點與數(shù)目，進一步探究EGCG和SPI的相互作用機理，闡明其在凝膠形成過程中的變化。