廖太陽 王培民 徐波 張力 李曉辰 吳鵬 邢潤麟 黃正泉 張農(nóng)山△

《OARSI膝骨關(guān)節(jié)炎非手術(shù)治療指南》認(rèn)為異常機械應(yīng)力是膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)發(fā)病的高危因素，力學(xué)干預(yù)被推薦為治療的核心等級[1]。細胞焦亡與細胞膜上的多種離子通道的開閉密切相關(guān)[2]，其中Piezo1離子通道能夠感受多種力學(xué)刺激并迅速響應(yīng)，介導(dǎo)多種2價陽離子內(nèi)流，是完全意義上的力敏感離子通道及機械敏感性陽離子通道[3]。中醫(yī)學(xué)“久行傷筋”經(jīng)典理論與現(xiàn)代異常機械應(yīng)力存在某些契合之處，筆者探究在異常機械拉伸應(yīng)力的作用下，是否通過激活滑膜巨噬細胞表面Piezo1離子通道，介導(dǎo)細胞焦亡及推動KOA炎癥反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級別雄性SD大鼠5只，體質(zhì)量180～200 g，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供，動物許可證號為SYXK(蘇)2017-0001。

1.2 實驗藥物及試劑

Piezo1抑制劑GsMTx4(批號為B5762，美國APE分子生物公司)；MitoSOXTM紅色線粒體超氧物指示劑(批號為M36008，美國 Thermo 公司)；乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(批號為C0016，碧云天)；細胞凋亡Hoechst33342/PI 雙染試劑盒(批號為CA1120，索萊寶公司)；白介素-1β(Rat，IL-1β)、白介素-18(Rat，IL-18)、ELISA試劑盒(批號為F15810，F(xiàn)15950，上海西唐生物公司)；活性氧(ROS)檢測標(biāo)準(zhǔn)試劑盒(批號為S0033，上海Beyotime生物公司)；Caspase-1 p10 抗體(批號為P29466，Bioworld 生物科技公司)；Caspase-1一抗、GSDMD一抗、β-actin內(nèi)參抗體(批號為ab1872，ab219800，ab8227，Abcam公司)；胰蛋白酶消化液、培養(yǎng)基(美國Gibco公司)。

1.3 實驗儀器

細胞牽張拉伸應(yīng)力加載實驗系統(tǒng)(型號為FX-5000T)；BioFlex專用板(美國flexcell細胞力學(xué)公司)；酶標(biāo)儀(美國 Enspire 公司)；蛋白電泳系統(tǒng)，電泳凝膠成像系統(tǒng)，超靈敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)LAS-4000(美國GE公司)；熒光倒置顯微鏡(型號為DMI-3000B，德國萊卡生物公司)。

1.4 方法

1.4.1細胞提取與培養(yǎng) 5只SD大鼠(6周，180～200 g)，由江蘇省青龍山動物場提供(許可證號SYXK(蘇)2017-0001)提供，通過二氧化碳窒息法處死大鼠。消毒后，將大鼠輕放在一消毒過的硬板上，墊高腹部，從腹腔右側(cè)偏下位置注射0.01 mmol/L PBS溶液30 mL，然后仰臥平放在冰上，輕柔按摩大鼠腹部3～5 min。在無菌條件下打開腹腔，可觀察到腹腔內(nèi)有淡黃色清亮液體即為腹腔液，用50 mL大注射器輕輕抽取液體約20～30 mL，注意避免戳到腸道組織造成污染。1 200 r/min離心5 min，接種于硅膠膜制成的Bioflex培養(yǎng)板中，在CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后常規(guī)換液，PBS清洗兩遍未貼壁細胞[4]。

1.4.2細胞分組方法及干預(yù)過程 巨噬細胞被接種到BioFlex板，并生長融合到80%～90%。實驗分組為空白對照組、應(yīng)力拉伸組及應(yīng)力拉伸+Piezo1抑制劑組。應(yīng)力拉伸實驗使用FX-5000T拉伸應(yīng)力系統(tǒng)，以6個循環(huán)/min的周期性頻率對BioFlex板內(nèi)巨噬細胞進行表面干預(yù)，周期性牽張應(yīng)力強度為20%，拉伸時間為24 h，頻率0.5 Hz刺激，在拉伸24 h后收集細胞。此外，巨噬細胞先使用Piezo1抑制劑(GsMTx4)預(yù)處理后進行循環(huán)拉伸，空白對照組在相同條件下培養(yǎng)但未暴露于機械拉伸環(huán)境中。拉伸結(jié)束后收集細胞上清，提取細胞蛋白并進行熒光操作。

1.4.3Western Blot法檢測Caspase-1，Caspase-1 p10，GSDMD蛋白表達 提取巨噬細胞總蛋白，BCA法450 nm檢測蛋白含量，按照5∶1加入碧云天5倍蛋白上樣緩沖液，99 ℃煮蛋白10 min。用BCA法檢測蛋白，制備8%的分離膠及4%的分離膠，在各孔道加入蛋白Marker 3 μL標(biāo)記，隨后進行電泳分離及轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗(1∶1 000)過夜，4 ℃孵二抗(1∶5 000)2 h，最后每片PVDF膜使用200 μL ECL曝光顯色，內(nèi)參蛋白設(shè)置為 β-actin。

1.4.4巨噬細胞Hoechst33342/PI雙染 根據(jù)說明書，吸除原培養(yǎng)上清，使用0.01 mmol/L PBS洗3次，每孔依次加入 5 μL Hoechst33342 染色液、5 μL碘化丙啶(PI)染色液和1 mL細胞染色緩沖液?；靹颍? ℃孵育 30 min。吸除染色液，無菌0.01 mmol/L PBS洗3次。用熒光倒置顯微鏡觀察紅色熒光和藍色熒光的分布情況。

1.4.5巨噬細胞培養(yǎng)上清LDH含量檢測 根據(jù)說明書操作指示，提前1 d準(zhǔn)備好細胞含量不超過90%的96孔板，用PBS洗1次，換無血清培養(yǎng)基。設(shè)置分組，做好標(biāo)記，應(yīng)力拉伸+Piezo1抑制劑組加入Piezo1抑制劑，對照孔加入LDH釋放試劑，各孔加入60 μL LDH檢測工作液，在490 nm處測定吸光度值，根據(jù)說明書所寫方法計算LDH酶活力單位。

1.4.6巨噬細胞ROS熒光檢測 4 μmol/L的MitoSOX處理細胞15 min，并用無菌PBS洗滌2次，用熒光顯微鏡觀察熒光強度。

1.4.7IL-1β、IL-18含量檢測 收集巨噬細胞培養(yǎng)上清液，配置標(biāo)準(zhǔn)品液；每孔加入100 μL標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品，輕輕混勻在37 ℃下孵育50 min；洗滌液洗滌4～6次；各孔加入蒸餾水及一抗工作液50 μL，混勻后孵育30 min，洗滌4～6次；后續(xù)添加酶標(biāo)抗體工作液孵育30 min及終止液15 min，450 nm測定吸光度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 巨噬細胞各組Caspase-1、Caspase-1 p10及GSDMD蛋白表達量

Western Blot 檢測巨噬細胞Caspase-1、Caspase-1 p10及GSDMD蛋白，蛋白條帶及相對表達量見圖1。應(yīng)力拉伸組Caspase-1、Caspase-1 p10及GSDMD蛋白較空白對照組表達增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，應(yīng)力拉伸+Piezo1抑制劑組較應(yīng)力拉伸組表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 巨噬細胞各組Caspase-1、Caspase-1 p10及GSDMD蛋白相對表達對比(*應(yīng)力拉伸組與空白對照組相比，P<0.05；#應(yīng)力拉伸+Piezo1抑制劑組與應(yīng)力拉伸組相比，P<0.05)

2.2 巨噬細胞培養(yǎng)上清IL-1β、IL-18含量

ELISA 檢測巨噬細胞促炎因子表達水平見圖2。應(yīng)力拉伸組細胞培養(yǎng)上清中IL-1β和IL-18含量顯著上升，與空白對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；應(yīng)力拉伸+Piezo1抑制劑組中的IL-1β和IL-18含量顯著下降，與應(yīng)力拉伸組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 巨噬細胞培養(yǎng)上清IL-1β、IL-18含量(*應(yīng)力拉伸組與空白對照組相比，P<0.05；#應(yīng)力拉伸+Piezo1抑制劑組與應(yīng)力拉伸組相比，P<0.05)

2.3 滑膜巨噬細胞Hoechst33342/PI雙染

正常細胞具有完整的細胞膜，PI不能穿過，故不能染色，沒有紅色熒光；壞死細胞(細胞膜破壞受損)PI可以染色，呈現(xiàn)紅色熒光。Hoechst33342可以穿透細胞膜，對細胞核進行染色，呈現(xiàn)藍色熒光?？瞻讓φ战M為正常狀態(tài)，PI不能染色，沒有紅色熒光；應(yīng)力拉伸組細胞膜破壞，PI染色陽性，有紅色熒光，說明焦亡模型構(gòu)建成功；應(yīng)力拉伸+Piezo1抑制劑組細胞膜較為完整，PI不能染色或者染色較少，說明Piezo1介導(dǎo)的細胞焦亡被抑制(見圖3)。

圖3 巨噬細胞Hoechst33342/PI雙染(×100)(應(yīng)力拉伸組PI染色陽性；應(yīng)力拉伸+Piezo1抑制劑組PI不能染色或者染色較少)

2.4 巨噬細胞培養(yǎng)上清LDH含量檢測

LDH的釋放可以作為細胞膜完整性參考指標(biāo)之一，應(yīng)力拉伸組巨噬細胞20%機械牽張力干預(yù)后，上清中LDH含量顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；應(yīng)力拉伸+Piezo1抑制劑組LDH含量低于應(yīng)力拉伸組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；這說明巨噬細胞在20%的周期性拉伸力作用下細胞破裂，釋放大量LDH至細胞外(見圖4)。

圖4 巨噬細胞各組培養(yǎng)上清LDH含量檢測(*應(yīng)力拉伸組與空白對照組相比，P<0.05；#應(yīng)力拉伸+Piezo1抑制劑組與應(yīng)力拉伸組相比，P<0.05)

2.5 巨噬細胞ROS熒光采集

檢測MitoSOXTM染色下的紅色熒光分布可測定線粒體活性氧的水平。ROS的升高直接推動炎癥小體活化，巨噬細胞在20%的周期性拉伸力下，活性氧大量產(chǎn)生，誘發(fā)Caspase-1活化，發(fā)生自我剪切，產(chǎn)生p10片段，GSDMD切割細胞膜，發(fā)生焦亡。應(yīng)力拉伸組在機械牽張應(yīng)力的作用下，ROS大量產(chǎn)生，呈現(xiàn)紅色熒光；應(yīng)力拉伸+Piezo1抑制劑組ROS產(chǎn)生的紅色熒光很少，說明細胞內(nèi)活性氧水平被抑制(見圖5)。

圖5 巨噬細胞內(nèi)線粒體活性氧檢測(×100)

3 討論

KOA是一種常見的以累及軟骨、軟骨下骨和滑膜病變?yōu)樘卣鞯穆灾職埿躁P(guān)節(jié)疾病，KOA最終致殘率甚至可達到53%[5]。膝骨關(guān)節(jié)炎之“骨痹”之稱源自《素問·痹論篇》“風(fēng)寒濕三氣雜至合而為痹也……痹在于骨則重，在于筋則屈不伸”[6]?！熬眯袀睢崩碚撆c骨痹關(guān)系也十分密切，《素問·脈要精微論》提及“膝者筋之府，屈伸不能，行則僂附，筋將憊矣”就是對這一關(guān)系的深刻闡釋。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“筋骨”之間彼此影響，倘若久行久動，則會導(dǎo)致筋骨皆?！，F(xiàn)代研究表明膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展與異常機械應(yīng)力密切相關(guān)，是力學(xué)與生物學(xué)因素等多種因素作用下的結(jié)果。在機械拉伸應(yīng)力作用下，機械敏感性離子通道可以感受細胞膜上力的變化，并快速作出反應(yīng)，將細胞膜感受到的機械信號轉(zhuǎn)化為電信號或化學(xué)信號，進而調(diào)控細胞的生命活動[7]。研究發(fā)現(xiàn)異常機械應(yīng)力會對軟骨及軟骨細胞造成損傷，加重骨關(guān)節(jié)炎[8]。

眾所周知，適當(dāng)活動可推動氣血運行、暢達氣機，促進肝血對筋骨的滋養(yǎng)，有利于膝關(guān)節(jié)筋骨堅固有力；但若一個人保持長時間奔走或者跑步，會導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)筋肉始終緊繃，進而發(fā)生勞損疼痛，屈伸不利，誘發(fā)KOA。這與力學(xué)與炎癥微環(huán)境的關(guān)系是一致的，少量的應(yīng)力可能使機體內(nèi)抗炎成分大于促炎成分發(fā)揮保護作用，反之，異常的機械應(yīng)力則使促炎因子異常分泌導(dǎo)致炎癥損傷。近年來細胞焦亡已成為研究的熱點，吸引了研究者極大的關(guān)注，它高度依賴于Caspase-1活化，經(jīng)過GSDMD誘導(dǎo)，導(dǎo)致細胞破裂死亡，釋放大量的炎癥因子[9]。筆者之前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)滑膜巨噬細胞存在焦亡現(xiàn)象，并且被沉默抑制后會導(dǎo)致NLRP3、ASC、GSDMD和 GSDMD-N 蛋白表達降低[10]。

Piezo1離子通道作為一種對機械敏感的離子通道，可分為Piezo1和Piezo2蛋白[11]，研究表明細胞外機械刺激可以調(diào)節(jié)Piezo1的打開和關(guān)閉[12]。近來Piezo1與各種炎癥之間的關(guān)系也逐漸受到大家的重視[13-14]，而細胞焦亡由經(jīng)典途徑(Caspase-1)及非經(jīng)典途徑(Caspase-4、11、5)介導(dǎo)，然后切割底物GSDMD引發(fā)炎癥級聯(lián)擴大。GSDMD由2個結(jié)構(gòu)域N-端片段(GSDMD-NT)及C-端片段(GSDMD-CT)組成，前者可誘導(dǎo)細胞焦亡，而后者需要與GSDMD-NT結(jié)合才能發(fā)揮抑制作用，阻止GSDMD-NT的活化[15]。即Caspase-1與寡聚的炎性小體結(jié)合，結(jié)合后的復(fù)合物活化后，一方面可以形成有活性的炎性介質(zhì)(IL-1β和IL-18的前體)，另一方面GSDMD也被切割，其N-端片段會作為焦亡的“執(zhí)行者”，自身形成復(fù)雜的聚合物并在細胞膜上打孔，對細胞造成不可逆的損傷及崩解，細胞內(nèi)促炎物質(zhì)(白介素1β和18)大量釋放，引起下游炎癥擴大[16-17]。在另一項研究中發(fā)現(xiàn)在髓核細胞中機械拉伸應(yīng)力激活Piezo1，進而激活炎癥小體來促進IL-1β的產(chǎn)生和成熟，從而介導(dǎo)炎癥[18]。故此，進一步探究異常機械應(yīng)力、Piezo1、焦亡和炎癥之間的作用關(guān)系成為亟需解決的問題。

在骨科相關(guān)疾病中，通過Piezo1蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括破骨細胞、成骨細胞、軟骨細胞等在內(nèi)的多種細胞，可以受到細胞外環(huán)境的機械刺激，進而影響細胞生命活動，包括增殖、分化、遷移和凋亡[19]。在另一項研究中發(fā)現(xiàn)機械拉伸激活Piezo1，促進髓核細胞中NLRP3炎性小體的活化，上調(diào)Caspase-1，產(chǎn)生IL-1β，Piezo1的沉默減少了機械拉伸引起的髓核細胞炎癥[20]。

本研究首先采取腹腔巨噬細胞替代滑膜巨噬細胞的方式，因為受限于現(xiàn)有的技術(shù)，即使使用磁珠分選提取膝關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜巨噬細胞也顯得十分困難，幸運的是目前這種替代方法獲得了國際公認(rèn)[4，20-21]。但是替代也意味著不是對滑膜巨噬細胞的直接觀察，這也是筆者以后仍需努力的方向。其次，筆者選取24 h拉伸時間，是因為之前的研究顯示分別在2、12、24、48 h進行拉伸，Piezo1表達量不是呈現(xiàn)絕對時間依賴性的，最高表達量出現(xiàn)在24 h[17，22]。筆者的研究表明在20%的周期性機械應(yīng)力拉伸24 h下，應(yīng)力拉伸組IL-1β和IL-18表達上升，而加入Piezo1抑制劑后炎癥因子表達受到抑制。與此同時，蛋白水平上也驗證了Piezo1激活了焦亡信號通路，而巨噬細胞Hoechst33342/PI雙染驗證了機械牽張應(yīng)力下發(fā)生焦亡致使巨噬細胞膜遭受破壞，Piezo1抑制劑阻止了這一進程。檢測到因細胞破裂導(dǎo)致釋放大量LDH，線粒體活性氧的大量產(chǎn)生更進一步加重了焦亡。當(dāng)然本研究也有不足之處，未進行基因及在體層次的觀察和研究，未對焦亡及Piezo1的機制進行更深入的研究，未來仍需要繼續(xù)努力。