王金龍，程平言*，熊曉通，尹艷艷

（貴州茅臺(tái)酒廠（集團(tuán)）習(xí)酒有限責(zé)任公司，貴州 遵義 564622）

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是一種天然產(chǎn)生于發(fā)酵食品（面包、酸奶、醬油等）和飲料酒中的化合物[1-2]，可導(dǎo)致肺腫瘤、淋巴癌、肝癌、皮膚癌等疾病[3]，在2007年被世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥調(diào)研機(jī)構(gòu)列為2A類致癌物[4]。食用發(fā)酵食品和飲用酒精飲料是目前人體攝取EC的兩種主要方式[5]，歐美發(fā)達(dá)國(guó)家為降低其食品安全風(fēng)險(xiǎn)紛紛對(duì)各類市場(chǎng)上的酒精飲料制定了含量不得超過(guò)150 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)[6]。我國(guó)由于發(fā)酵食品種類眾多，檢測(cè)方法不統(tǒng)一等客觀原因?qū)е庐?dāng)下尚未制定出酒類飲用產(chǎn)品中氨基甲酸乙酯的強(qiáng)制性限量標(biāo)準(zhǔn)[7-8]。但隨著國(guó)內(nèi)酒行業(yè)快速發(fā)展和消費(fèi)者的安全健康意識(shí)日益提升，酒中氨基甲酸乙酯所引發(fā)的食品安全潛在危害越發(fā)受重視，其強(qiáng)制性限量標(biāo)準(zhǔn)的制定勢(shì)在必行[9-10]，因此，研究其控制方法及制定限量標(biāo)準(zhǔn)將成為白酒風(fēng)險(xiǎn)體系研究工作的重點(diǎn)。

根據(jù)研究報(bào)道，白酒中的尿素、氨甲酰磷酸、瓜氨酸等前體物質(zhì)能夠與乙醇反應(yīng)生成氨基甲酸乙酯[11-12]，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于解決飲料酒中EC問(wèn)題的研究主要是從減少其來(lái)源、工藝條件控制和后續(xù)儲(chǔ)存過(guò)程中去除等方面考慮，如構(gòu)建低產(chǎn)尿素酵母[13]、添加酸性脲酶[14]以及采用合成樹(shù)脂吸附[15]。但EC的形成途徑多種多樣，不同的存儲(chǔ)環(huán)境對(duì)濃香型基酒中氨基甲酸乙酯的含量也有重要影響[16-18]。隨著色譜與質(zhì)譜的聯(lián)用技術(shù)的逐漸成熟，在機(jī)理及減控方面的研究成為了重點(diǎn)[19-21]。

本研究選取濃香型酒庫(kù)的基酒作為研究對(duì)象，探究?jī)?chǔ)存條件對(duì)氨基甲酸乙酯含量的影響以及其形成機(jī)制的研究，以期對(duì)白酒中氨基甲酸乙酯的含量達(dá)到有效減控，促進(jìn)我國(guó)白酒中氨基甲酸乙酯限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品（99.50%）：ChemService公司；甲醇、甲酸（色譜純）：安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?；?shí)驗(yàn)所用的濃香基酒均由貴州茅臺(tái)酒廠（集團(tuán)）習(xí)酒有限責(zé)任公司提供。所有實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（18.2 MΩ·cm-2）。

1.2 儀器與設(shè)備

UltiMate 3000 高效液相色譜儀：美國(guó)Dionex公司；配備HESI離子源的Q Exactive Focus高分辨質(zhì)譜儀：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；BPG型精密鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；OEM型電子精密天平：奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；QT-1旋渦混合器：上海琪特分析儀器有限公司；Aquaplore 3S型全智能超純水機(jī)：美國(guó)艾科浦國(guó)際有限公司；SB-25-12DT超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

取樣：按釀造加入糧食的種類差異分為單糧濃香基酒和多糧濃香基酒，單糧濃香基酒取自于濃香酒庫(kù)3號(hào)房194#壇、219#壇、165#壇、105#壇；多糧濃香基酒取自于濃香酒庫(kù)7號(hào)房239#壇、197#壇、228#壇。具體分級(jí)是由公司專業(yè)嘗評(píng)人員認(rèn)定入庫(kù)。

酒樣處理：準(zhǔn)確吸取1 mL酒樣于1.5 mL離心管中，置于80 ℃烘箱中去除酒精，取出冷卻后加超純水定容至1 mL，置于旋渦混合器上混勻，用注射器吸取后注入通過(guò)0.22 μm水相微孔濾膜過(guò)濾到進(jìn)樣瓶，上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取一定量EC標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，加水定容后配制成質(zhì)量濃度100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，并放置于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存待用。

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：準(zhǔn)確量取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，加水定容后配制成質(zhì)量濃度1 000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液，再逐級(jí)稀釋至10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、250 μg/L、500 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，并放置于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存待用。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)方法

（1）不同材質(zhì)儲(chǔ)存容器儲(chǔ)存的基酒EC的變化規(guī)律

選取濃香型基酒單糧甲級(jí)194#和多糧甲級(jí)239#作為實(shí)驗(yàn)樣品，分別取500 mL灌裝于玻璃瓶、不銹鋼瓶和陶制瓷瓶中，置于空調(diào)20 ℃的儲(chǔ)物間的柜子（避光）存儲(chǔ)，每月定期測(cè)量，研究不同材質(zhì)儲(chǔ)存容器對(duì)基酒中EC含量的影響。

（2）光照對(duì)基酒EC的影響

選取濃香型基酒單糧甲級(jí)194#和多糧甲級(jí)239#作為實(shí)驗(yàn)樣品，分別取500 mL灌裝于玻璃瓶，置于空調(diào)20 ℃的儲(chǔ)物間臺(tái)面（見(jiàn)光）和柜子（避光）分別存儲(chǔ)，每月定期測(cè)量，研究光照條件對(duì)基酒中EC含量的影響。

（3）溫度對(duì)基酒EC的影響

選取濃香型基酒單糧甲級(jí)194#和多糧甲級(jí)239#作為實(shí)驗(yàn)樣品，分別取500 mL灌裝于陶瓷瓶（排除光照干擾）中，分別置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃的溫度梯度下，儲(chǔ)存一段時(shí)間后進(jìn)行檢測(cè)，以探究溫度對(duì)基酒中EC含量的影響。

1.3.4 不同溫度下酒樣的差異比較

通過(guò)對(duì)存放4 ℃、20 ℃和60 ℃條件下的濃香型基酒單糧甲級(jí)194#和多糧甲級(jí)239#樣的全掃描，用儀器配帶的Compound Discover軟件對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及差異性比較，初步尋找形成EC的前體物質(zhì)以及演變機(jī)制。

1.3.5 基酒存儲(chǔ)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

選取酒庫(kù)中的5個(gè)陶壇儲(chǔ)存的濃香基酒（多糧甲級(jí)197#、多糧乙級(jí)228#、單糧甲級(jí)219#、單糧乙級(jí)165#、單糧丙級(jí)105#）在平均室溫為22.6 ℃，平均濕度45%，避光儲(chǔ)存條件下，每月定期跟蹤EC含量，以期完成EC的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

1.3.6 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法

（1）色譜條件

流動(dòng)相：A相為0.1%（V/V）甲酸水溶液，B相為甲醇；色譜柱：Accucore aQ 液相色譜柱（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣盤(pán)溫度：4 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；洗脫方式：梯度洗脫，具體程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

（2）質(zhì)譜條件

離子源：可加熱大氣壓電噴霧電離源，正離子掃描模式；掃描類型：選擇離子監(jiān)測(cè)（selected ion monitoring，SIM）模式；掃描范圍：55～95 m/z；分辨率：70 000；自動(dòng)增益控制目標(biāo)離子數(shù)：1×e6；最大注入時(shí)間：5 ms；鞘氣流速：30 arb；輔助氣流速：15 arb；噴霧電壓：2.3 kV；離子傳輸管溫度：350 ℃；S-lens RF level：80；輔助氣加熱溫度：200 ℃。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

使用Origin9.0軟件進(jìn)行繪圖，使用儀器配帶的Compound Discover分析軟件進(jìn)行酒樣的差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同材質(zhì)儲(chǔ)存容器對(duì)基酒EC的影響

以濃香型基酒作為實(shí)驗(yàn)樣品，選用玻璃瓶、不銹鋼瓶和陶制瓷瓶作為儲(chǔ)存容器于20 ℃的條件下存儲(chǔ)，研究不同材質(zhì)儲(chǔ)存容器對(duì)基酒中EC含量的影響，結(jié)果如圖1。三種容器存儲(chǔ)的基酒中EC的含量均隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加而增加，且在90～120 d增加速度最快；不同的儲(chǔ)存容器，基酒中EC含量的增長(zhǎng)速度也有所不同。其中，陶瓷瓶的增長(zhǎng)速度較為緩慢，180 d時(shí)基酒194#的EC含量增加到74.59 μg/L，約為初始的2.4倍，低于不銹鋼瓶?jī)?chǔ)存的93.07 μg/L和玻璃瓶?jī)?chǔ)存的113.68 μg/L；基酒239#中EC含量的變化趨勢(shì)與基酒194#一致，表明不同材質(zhì)的儲(chǔ)存容器能夠影響基酒中EC含量的變化[4，22]，并且陶瓷瓶更適合儲(chǔ)存白酒，故建議白酒生產(chǎn)企業(yè)采用陶制容器儲(chǔ)酒。

圖1 儲(chǔ)存材質(zhì)對(duì)基酒中氨基甲酸乙酯含量的影響Fig.1 Effect of storage materials on ethyl carbamate contents in base liquor

2.2 光照對(duì)基酒EC的影響

選取濃香型基酒作為實(shí)驗(yàn)樣品于玻璃瓶中分別置于避光和見(jiàn)光條件下儲(chǔ)存。儲(chǔ)存溫度為20 ℃的條件下，研究光照對(duì)基酒中EC含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 光照對(duì)基酒中氨基甲酸乙酯含量的影響Fig.2 Effect of light on ethyl carbamate contents in base liquor

結(jié)果表明，在兩種環(huán)境下，前30天基酒中EC含量增長(zhǎng)速度較緩慢，30 d后基酒中EC含量急劇增加，120 d后出現(xiàn)平緩趨勢(shì)。但在見(jiàn)光條件下EC含量增加速度遠(yuǎn)大于避光條件下，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[23]。因此，建議白酒生產(chǎn)企業(yè)存酒環(huán)境盡量避光。

2.3 溫度對(duì)基酒EC的影響

以濃香型單糧甲級(jí)194#和多糧甲級(jí)239#兩種基酒作為實(shí)驗(yàn)樣品，分別設(shè)置5個(gè)溫度梯度（15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃），儲(chǔ)存一個(gè)月后進(jìn)行檢測(cè)，以探究溫度對(duì)基酒中EC含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。無(wú)論是單糧基酒還是多糧基酒，在溫度低于20 ℃時(shí)，酒中的EC含量增加較為緩慢；超過(guò)25 ℃后，兩種基酒的EC含量急劇增加，并且在30 ℃時(shí)超過(guò)了150 μg/L的食品安全風(fēng)險(xiǎn)限，而且隨著溫度越高，EC生成量越多，這與研究報(bào)道的當(dāng)儲(chǔ)存溫度超過(guò)24 ℃時(shí)酒中EC的含量將迅速增加的論述基本吻合[4，24]。此外，通過(guò)比較兩個(gè)酒樣在15 ℃和35 ℃時(shí)的EC含量，可以發(fā)現(xiàn)存在有約7～9倍的差距，表明不同原料釀制的基酒在高溫條件下儲(chǔ)酒都存在EC含量增加的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。因此，企業(yè)應(yīng)選擇在15～20 ℃范圍內(nèi)存儲(chǔ)，有條件的酒廠可以考慮洞藏或者進(jìn)行窖藏。

圖3 溫度對(duì)基酒中氨基甲酸乙酯含量的影響Fig.3 Effect of temperature on ethyl carbamate contents in base liquor

2.4 不同溫度下酒樣的差異比較

由2.3所知，在一定溫度范圍內(nèi)，基酒中EC的形成與其成正相關(guān)關(guān)系，為進(jìn)一步證實(shí)溫度是導(dǎo)致EC大量形成的重要因素，并初步篩選EC在酒中的前體物質(zhì)，設(shè)置4 ℃、20 ℃和60 ℃三個(gè)溫度條件儲(chǔ)存，定期檢測(cè)分析EC含量變化情況，結(jié)果見(jiàn)圖4。

如圖4所示，在4 ℃儲(chǔ)存條件下基酒中的EC含量無(wú)明顯變化；20 ℃儲(chǔ)存條件下基酒中EC含量增加速度較緩慢，存放到180 d時(shí)EC的含量為原來(lái)的2～2.5倍；值得注意的是，在60 ℃儲(chǔ)存條件下，基酒中EC的含量在前30天就能增加到較高數(shù)值，后期溫度也是一直在升高。這反映了一定溫度條件下短期內(nèi)能夠使EC前體物質(zhì)完成轉(zhuǎn)化。

圖4 不同時(shí)間及溫度對(duì)基酒中氨基甲酸乙酯含量的影響Fig.4 Effect of different time and temperature on ethyl carbamate contents in base liquor

此外，對(duì)所設(shè)溫度條件下儲(chǔ)存的基酒進(jìn)行檢測(cè)分析，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compound Discover軟件，進(jìn)行差異性分析。如圖5所示，每個(gè)小方格代表一種物質(zhì)，每一列表示每個(gè)樣品所有物質(zhì)的表達(dá)量情況，顏色深淺表示物質(zhì)表達(dá)量的大小，綠色表示含量低，紅色表示含量高，顏色越深表示含量越低或者越高；上方樹(shù)形圖表示不同實(shí)驗(yàn)分組的聚類分析結(jié)果，左側(cè)樹(shù)狀圖表示不同物質(zhì)聚類分析結(jié)果。從圖中聚類分組來(lái)看，兩個(gè)酒樣的上方樹(shù)形圖基本一樣，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)分組一致。左側(cè)物質(zhì)聚類分組差異較大，在顏色上也有所區(qū)別，說(shuō)明不僅三個(gè)溫度下物質(zhì)表達(dá)存在差異，而且兩個(gè)酒樣之間的對(duì)比也存在一定差異。

圖5 基酒的熱圖分析Fig.5 Heatmap analysis of base liquor

為了解全掃描物質(zhì)變化差異，選取基酒在高溫（60 ℃）和低溫（4 ℃）兩種條件下檢測(cè)數(shù)據(jù)繪制火山圖（圖6），比較它們之間的差異分布情況。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)檢測(cè)到的差異物質(zhì)，灰色表示該物質(zhì)在4 ℃和60 ℃下無(wú)差異，綠色表示物質(zhì)含量發(fā)生了下調(diào)，紅色表示物質(zhì)含量上調(diào)，圓點(diǎn)偏離中心越遠(yuǎn)表示差異倍數(shù)越大，越靠近頂部的點(diǎn)表示兩個(gè)樣本的物質(zhì)含量變化差異越顯著。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，全掃描后的多糧基酒239#的物質(zhì)種類為5 273種，多于單糧的194#的3 342種，這可能是造成單糧酒口感單薄寡淡而多糧酒醇厚豐滿的原因。此外，在P≤0.05，差異倍數(shù)為2時(shí)，60 ℃與4 ℃相比，單糧甲級(jí)194#基酒有854種物質(zhì)展現(xiàn)出無(wú)差異，338種物質(zhì)下調(diào)，2 150種物質(zhì)上調(diào)；多糧甲級(jí)239#基酒中有754種物質(zhì)無(wú)差異，763種物質(zhì)下調(diào)，3 756種物質(zhì)上調(diào)。此外，P值保持不變，調(diào)整差異倍數(shù)為5時(shí)，194#基酒種有98種物質(zhì)下調(diào)，239#基酒中有113種物質(zhì)下調(diào)，通過(guò)逐一篩查，兩種酒樣中共同有三種與氨基甲酸乙酯結(jié)果相似的物質(zhì)存在極大的下調(diào)顯著性差異，分別是糠醛、尿素和二環(huán)氧基乙酯。因此，可推測(cè)在上調(diào)的物質(zhì)中有一種是氨基甲酸乙酯在發(fā)生顯著變化，而且在下調(diào)的物質(zhì)中存在一種或者多種氨基甲酸乙酯的前體物質(zhì)，這思路對(duì)氨基甲酸乙酯的前體物質(zhì)篩查及形成機(jī)制的演化提供了參考。

圖6 基酒火山分析圖Fig.6 Volcano plots analysis results of base liquor

2.5 基酒存儲(chǔ)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

酒庫(kù)被視為白酒企業(yè)的“液體銀行”，是基酒老熟的存儲(chǔ)基地，其環(huán)境條件直接影響酒質(zhì)好壞及酒體特征的變化[25]。經(jīng)研究，儲(chǔ)存容器、光照條件和溫度是影響儲(chǔ)存過(guò)程中EC含量的重要因素，陶制容器儲(chǔ)酒于低溫避光條件下儲(chǔ)存有利于EC含量的減控。由于儲(chǔ)酒庫(kù)房環(huán)境（陶壇儲(chǔ)酒、避光和室溫）基本與實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件有相似之處，所以選擇了酒庫(kù)的5個(gè)濃香基酒（多糧2個(gè)級(jí)別，單糧3個(gè)級(jí)別）進(jìn)行EC含量跟蹤，探究其儲(chǔ)存變化規(guī)律，以期完成EC的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。濃香型酒庫(kù)為陶壇作為儲(chǔ)存容器，平均室溫為22.6 ℃，平均濕度45%，避光儲(chǔ)存。其跟蹤酒中EC含量隨儲(chǔ)存時(shí)間的變化情況如圖7所示。

圖7 基酒中氨基甲酸乙酯含量隨儲(chǔ)存時(shí)間的變化情況Fig.7 Change of ethyl carbamate contents in base liquor with storage time

結(jié)果表明，5個(gè)酒樣在前90 d內(nèi)EC含量變化緩慢，在90～150 d內(nèi)酒樣EC含量迅速增長(zhǎng)，隨后出現(xiàn)平緩趨勢(shì)。盡管各基酒中EC隨儲(chǔ)存時(shí)間的增加，但均未超過(guò)加拿大、美國(guó)等國(guó)家認(rèn)定的限量標(biāo)準(zhǔn)（150 μg/L），因此，酒庫(kù)儲(chǔ)酒EC的風(fēng)險(xiǎn)較低。

3 結(jié)論

文章探討了儲(chǔ)酒容器、光照和溫度對(duì)不同原料制備的濃香型基酒中EC含量的影響并且簡(jiǎn)單分析了低含量EC基酒和高含量EC基酒差異性情況。在研究中發(fā)現(xiàn)使用陶瓷瓶的使用、避光和低溫都有利于酒中EC含量的減控；對(duì)比三種影響因素，溫度是短期內(nèi)影響酒中EC含量變化最大的主要原因，同時(shí)高溫下儲(chǔ)酒具有較高的食品安全風(fēng)險(xiǎn)；不同溫度下對(duì)基酒初步對(duì)比分析為準(zhǔn)確篩選EC前體物質(zhì)提供研究思路；在平均室溫為20 ℃左右，平均濕度45%左右，用酒庫(kù)用陶壇儲(chǔ)酒能夠?qū)崿F(xiàn)低成本的儲(chǔ)酒要求且儲(chǔ)存風(fēng)險(xiǎn)較低。本研究對(duì)白酒中EC在不同條件下含量的變化情況的探究，為EC的生成機(jī)理及找出前體物質(zhì)提供了參考依據(jù)，為白酒中EC的控制和消除提供了研究方向。