陳申習(xí)，宿智新，張 磊，林 斌，陳 凱，劉源才，楊 強(qiáng)*

（勁牌有限公司 勁牌研究院 中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 大冶 435100）

白酒是我國(guó)具有悠久歷史的傳統(tǒng)釀造食品，在我國(guó)，白酒有多達(dá)十幾種香型，其中以清香型、濃香型和醬香型為主要三大香型，借助現(xiàn)代品評(píng)及檢測(cè)技術(shù)分析，各香型白酒在口感、風(fēng)格、風(fēng)味物質(zhì)含量方面各有自身獨(dú)特特點(diǎn)，適應(yīng)并滿足了不同消費(fèi)者多元化的個(gè)性需求。

白酒中所含風(fēng)味物質(zhì)種類及所占比例是影響白酒品質(zhì)的重要影響因素之一，如現(xiàn)代白酒品評(píng)術(shù)語中的綿甜、爽凈、醇厚、優(yōu)雅等詞，是由于白酒中含有的醇、醛、酸、酯等特定微量風(fēng)味物質(zhì)所決定，而各種風(fēng)味物質(zhì)是由釀造使用的酒曲中含有的微生物代謝底物產(chǎn)生的[1]。為了提升白酒產(chǎn)品品質(zhì)，探究各香型白酒酒曲微生物多樣性的差異，分析不同酒曲中微生物的群落結(jié)構(gòu)，尤其是特殊功能性菌株，就顯得尤為重要。

近年來高通量測(cè)序技術(shù)逐漸被應(yīng)用于各種香型白酒酒曲、酒醅樣品分析中，不用分離就可以獲知微生物種屬信息，為白酒釀造微生物的研究帶來了極大的便利[2-3]。徐占成等[4]采用高通量測(cè)序?qū)δ洗捍笄婢M成進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步分析劍南春大曲功能微生物提供了理論依據(jù)。楊旭等[5]采用16S rRNA的V3和V4區(qū)高通量測(cè)序，分析了賈湖酒業(yè)集團(tuán)公司原香型白酒高溫大曲細(xì)菌結(jié)構(gòu)，指出細(xì)菌群落差異是導(dǎo)致白酒品質(zhì)差異的主要原因之一。呂錫斌等[6]利用Illumina Miseq PE300高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)醬香型白酒下造沙輪次的微生物多樣性進(jìn)行了檢測(cè)，分析了不同階段微生物群落特點(diǎn)，為深入研究釀造機(jī)理提供參考依據(jù)。

清香型小曲白酒從工藝上分為傳統(tǒng)酒曲法和純種根霉法生產(chǎn)兩種，采用傳統(tǒng)酒曲生產(chǎn)法的白酒企業(yè)主要分布在湖北、湖南、江西等地，其中勁牌公司生產(chǎn)的小曲白酒產(chǎn)量規(guī)模最大[7-8]。目前對(duì)清香型小曲白酒酒曲研究主要集中在對(duì)酒曲中微生物的種類組成及其代謝成分的解析方面[9-10]。廖美德等[11]描述了綠衣觀音土曲的特殊制作工藝及與其他小曲的區(qū)別，發(fā)現(xiàn)棒曲霉（Aspergillus clavatus）為綠衣觀音土曲的主要糖化菌。馮春等[12-13]對(duì)綠衣觀音土曲中主要微生物種群區(qū)系及其功能進(jìn)行了研究，從土曲中分離出了棒曲霉、黃曲霉、構(gòu)巢曲霉等真菌，并對(duì)酵母、霉菌和細(xì)菌之間的相互關(guān)系進(jìn)行了研究[14]。但截至目前關(guān)于清香型小曲與其他香型大曲微生物種屬差異尚研究不足。本研究以清香型小曲及其制作種曲、清香型大曲以及醬香型大曲為研究對(duì)象，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)清香型和醬香型酒曲樣品開展測(cè)序分析，比較分析不同酒曲中真菌種類和多樣性，為清香型和醬香型核心微生物的分離、鑒定以及白酒品質(zhì)提升、白酒差異對(duì)比提供重要的真菌資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清香型小曲及其種曲：勁牌有限公司傳統(tǒng)制曲車間；清香型大曲：湖北繡林玉液有限公司；醬香型大曲：茅臺(tái)鎮(zhèn)某醬香型酒廠，采樣信息及樣品編號(hào)見表1。

表1 試驗(yàn)所用的樣品信息Table 1 Information of sample used in the experiment

1.2 儀器與設(shè)備

2720型PCR儀：美國(guó)ABI公司；DYY-6C型電泳儀：北京六一儀器廠；BG-gdsAUTO（130）凝膠成像系統(tǒng)：北京百晶生物科技有限公司；Miseq高通量測(cè)序儀：美國(guó)Illumina公司；Biotek ELx800酶標(biāo)儀：美國(guó)BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理方法

參照參考文獻(xiàn)處理方法[15]，將在車間取得的不同酒曲樣品寄送到上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行基因組DNA提取。

1.3.2 樣品DNA提取和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增

采用DNA提取試劑盒對(duì)酒曲樣品進(jìn)行總DNA提取，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增采用NEB公司Q5高保真DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，引物參考文獻(xiàn)[15-16]中采用的真菌ITS區(qū)通用引物ITS5：（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'），ITS2：（5'-GCTGCGTTCTTCATC-GATGC-3'），并嚴(yán)格控制擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，確保同一批樣本的擴(kuò)增條件一致。PCR擴(kuò)增體系（25 μL）：反應(yīng)緩沖液10 μL，dNTP混合液（2.5 mmol/L）2 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，真菌DNA模板2 μL，超純水8.75 μL，Q5 DNA聚合酶0.25 μL。PCR擴(kuò)增程序（25μL）：98℃預(yù)變性2min；98℃變性15 s；55℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過2%瓊脂糖凝膠電泳，使用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)DNA回收，-20 ℃保存。利用DNA定量檢測(cè)試劑盒對(duì)回收的DNA進(jìn)行精確定量，依托上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測(cè)序。

1.3.3 測(cè)序文庫構(gòu)建

1.3.4 生物信息學(xué)分析

為了整合原始雙端測(cè)序數(shù)據(jù)，采用滑動(dòng)窗口法對(duì)FASTQ格式的雙端序列逐一作質(zhì)量篩查。利用FLASH軟件對(duì)通過質(zhì)量初篩的雙端序列根據(jù)重疊堿基進(jìn)行配對(duì)連接，根據(jù)每個(gè)樣本所對(duì)應(yīng)的Index信息，將連接后的序列識(shí)別分配入對(duì)應(yīng)樣本（要求Index序列完全匹配），從而獲得每個(gè)樣本的有效序列。根據(jù)測(cè)序序列質(zhì)量進(jìn)行初步篩查，運(yùn)用QIIME軟件去除嵌合體等疑問序列，并對(duì)獲得的序列按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）劃分。通過將OTU代表序列與對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)庫的模板序列相比對(duì)，獲取每個(gè)OTU所對(duì)應(yīng)的分類學(xué)信息。針對(duì)真菌的ITS序列，采用UNITE數(shù)據(jù)庫。按照OTU在不同樣品中的豐度分布，運(yùn)用QIIME軟件計(jì)算每個(gè)樣品的α多樣性水平，并結(jié)合稀疏曲線反映測(cè)序深度是否合格；α多樣性指數(shù)計(jì)算，常用的度量指數(shù)包括側(cè)重于體現(xiàn)群落豐富度的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)，以及群落均勻度的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。利用SPSS 20.0軟件對(duì)酒曲樣品的真菌屬進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。使用Origin v8.5軟件，獲取各樣本在門屬分類水平上的組成和豐度分布，并通過柱狀圖呈現(xiàn)分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒曲樣品真菌α多樣性指數(shù)分析

稀釋曲線顯示每個(gè)樣本的當(dāng)前測(cè)序深度足以反映該群落樣本所包含的微生物多樣性。樣品有效序列量及OTU值見表2。

表2 酒曲樣品真菌序列信息及α多樣性指數(shù)Table 2 Sequence information and α diversity indexes of fungi in Jiuqu samples

王喆等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Chao1或ACE指數(shù)越大，表明樣品群落的豐富度越高。Shannon或Simpson指數(shù)值越高，則表明樣品群落的多樣性越高。如表2所示，8個(gè)酒曲樣品的Chao1豐富度指數(shù)在66～155之間；ACE指數(shù)在62.97～155之間；Shannon指數(shù)在1.49～3.63之間；Simpson指數(shù)在0.41～0.86之間變化。其中，最大指數(shù)值均出現(xiàn)在感官略差的土曲TBF，最小值則出現(xiàn)在感官略差的種曲ZBF。各指數(shù)表明感官略差的土曲在真菌豐富度和多樣性方面均高于感官較好的土曲。而在種曲中，表面帶紅色的種曲，其真菌豐富度和多樣性遠(yuǎn)高于感官較好和略差的種曲。勁牌桂花曲HHF因其由部分篩選的優(yōu)勢(shì)純菌種和土曲按照優(yōu)化比例制成，在真菌豐富度和多樣性方面略低于土曲TBF，但明顯高于醬香型大曲JF和清香型大曲QDF。這說明在勁牌制曲車間，經(jīng)過多年的連續(xù)不間斷生產(chǎn)，車間富集馴養(yǎng)了多種多樣的釀酒真菌類群，經(jīng)過開放式培菌制曲，酒曲中真菌的豐富度和多樣性處在一個(gè)較高的水平，為車間釀造優(yōu)質(zhì)原酒提供了豐富的菌種資源。

2.2 酒曲樣品中物種的相對(duì)豐度

2.2.1 酒曲樣品中真菌門的分類

基于酒曲樣品中微生物ITS基因序列，8個(gè)樣品共獲得572 846條有效序列，以97%序列相似性將有效序列在門水平上進(jìn)行聚類，結(jié)果見圖1。如圖1所示，在8個(gè)酒曲樣品中子囊菌門（Ascomycota）、毛霉門（Mucoromycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）3類真菌占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，這三類真菌相對(duì)豐度總和均超過93%。其中，大曲樣品中主要含有子囊菌門和毛霉門真菌，小曲樣品中還含有4.3%～49.2%不等的擔(dān)子菌門類真菌，特別是感官較好的ZGF種曲樣品中，擔(dān)子菌門占比達(dá)到了49.2%，而且在其他兩類種曲ZBF和ZRF中占比也超過了10%，說明了種曲的生產(chǎn)工藝、原料等條件更適合富集擔(dān)子菌門類真菌。

圖1 酒曲樣品在門分類水平的真菌組成Fig.1 Composition of fungi in Jiuqu samples at phylum level

2.2.2 酒曲樣品中真菌屬的分類

結(jié)合各屬的相對(duì)豐度，分析了樣品中真菌在屬水平的分布特點(diǎn)。如圖2所示，在各酒曲中前10類真菌屬中主要有根霉屬（Rhizopus）、曲霉屬（Aspergillus）、假絲酵母屬（Candida）、Apiotrichum、熱子囊菌屬（Thermoascus）、紅曲霉屬（Monascus）、根毛霉屬（Rhizomucor）、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）、毛霉屬（Mucor）。在勁牌桂花曲HHF中，根霉屬占比最高，達(dá)到79.7%，這與桂花曲中增加了篩選的優(yōu)勢(shì)根霉菌株有關(guān)。除此之外，HHF中還含有7.4%的威克漢姆酵母屬，與本研究團(tuán)隊(duì)前期使用HHF在清香型小曲白酒機(jī)械化生產(chǎn)過程發(fā)酵酒醅中分離出了多株異常威克漢姆酵母菌（Wickerhamomyces anomalus）相一致[17]。在感官略差的種曲ZBF和清香型大曲QDF中，根霉屬占比較低，分別占比0.2%和0.4%，而曲霉屬占比較高，分別為76.8%和35.7%。另外，在QDF中還含有較高比例的紅曲霉屬和根毛霉屬，占比都在14%以上。有研究發(fā)現(xiàn)[18-20]，紅曲霉屬可以代謝多種酶類，包括淀粉酶、蛋白酶、糖化酶等，且可促進(jìn)底物分解，根霉可以促進(jìn)淀粉的分解，使淀粉轉(zhuǎn)變成易被酵母利用的葡萄糖等小分子物質(zhì)[7]，因此推斷在QDF中，可能是由較多的曲霉屬、紅曲霉屬和根毛霉屬真菌將淀粉分解，從而這三種菌屬所占的比例較高。土曲TGF和TBF所檢測(cè)到的真菌屬較為類似，兩者曲霉屬占比都比較高，分別為26.1%和29.8%，主要原因是土曲中含有較多的棒曲霉（Aspergillus clavatus），這與前期研究[12]發(fā)現(xiàn)土曲表面含有大量的棒曲霉的結(jié)果一致。在醬香型大曲JF和清香型大曲QDF中，都含有較高比例的熱子囊菌屬，占比分別為14.5%和20.8%，這可能與這兩種大曲的制曲工藝及制曲溫度有關(guān)。醬香型大曲作為中高溫大曲，其制作頂點(diǎn)溫度可以達(dá)到60 ℃以上，而清香型大曲制曲頂點(diǎn)溫度也接近50 ℃，較高的制曲培菌溫度，有利于富集篩選周圍環(huán)境中一些耐高溫的微生物[21-22]。

圖2 酒曲樣品在屬分類水平的真菌組成Fig.2 Composition of fungi in Jiuqu samples at genus level

2.4 酒曲樣品中真菌主成分分析

酒曲中真菌菌群結(jié)構(gòu)主成分分析結(jié)果見圖3。

圖3 酒曲中真菌菌群結(jié)構(gòu)主成分分析Fig.3 Principal component analysis of fungal structure in different Jiuqu samples

由圖3可知，各酒曲真菌群落第一主成分（PC1）貢獻(xiàn)率達(dá)69.81%，第二主成分（PC2）貢獻(xiàn)率達(dá)14.52%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到84.33%，表明能夠解釋樣品中的信息。其中，勁牌桂花曲HHF和醬香型大曲JF距離較近，土曲TGF和TBF距離較近，說明HHF和JF以及TGF和TBF的真菌菌落結(jié)構(gòu)較為相似。而種曲ZBF和ZRF及ZGF距離較遠(yuǎn)，說明ZBF與ZRF及ZGF的真菌菌落結(jié)構(gòu)有較大差距。主成分分析表明不同感官種曲的真菌多樣性存在一定差異。

3 討論

本研究借助現(xiàn)代高通量測(cè)序技術(shù)研究清楚酒曲中真菌類群特點(diǎn)，揭示了各酒曲樣品中真菌的主要類群及差異，造成真菌差異的原因主要與各酒曲制作時(shí)的環(huán)境、原料、工藝參數(shù)有關(guān)。制曲車間所用原料、母曲及周圍環(huán)境形成的獨(dú)特微生態(tài)決定了酒曲中富集的微生物類群，進(jìn)一步結(jié)合工藝釀造出風(fēng)格不同的白酒[23]。同時(shí)，本研究顯示在現(xiàn)代制曲技術(shù)指導(dǎo)下，勁牌公司生產(chǎn)的傳統(tǒng)土曲和桂花曲中真菌豐富度和多樣性遠(yuǎn)超之前人們對(duì)小曲的認(rèn)知，且真菌種類并不比醬香型大曲和清香型大曲少。這與勁牌公司采用的清香型小曲制作工藝不同于川法純種制曲工藝有關(guān)[24]。勁牌傳統(tǒng)小曲采用先培養(yǎng)母曲-種曲，然后把種曲與原料混合進(jìn)行土曲制作，經(jīng)過一周的開放式控溫控濕生產(chǎn)，即可培養(yǎng)完成。這個(gè)過程中土曲充分富集了周圍環(huán)境中多種有益微生物。勁牌桂花曲是在傳統(tǒng)土曲的基礎(chǔ)上，添加了經(jīng)現(xiàn)代化工藝生產(chǎn)的天然優(yōu)勢(shì)菌種，經(jīng)比例優(yōu)化復(fù)配而成。既保證了曲中天然有益釀酒微生物的種類數(shù)量，又能利用優(yōu)勢(shì)菌提高了原料利用率，應(yīng)用生產(chǎn)后可以顯著提高原酒的產(chǎn)量和品質(zhì)[25]。

借助現(xiàn)代高通量測(cè)序技術(shù)研究清楚酒曲中真菌類群特點(diǎn)，可以為下步通過傳統(tǒng)分離手段鑒定酒曲中的核心微生物提供指導(dǎo)。兩種研究方法相結(jié)合，可以快速獲得酒曲中的核心微生物。在核心微生物功能解析后，挑選其中的優(yōu)良菌株，通過復(fù)配的形式強(qiáng)化到酒曲中，是一種有效提升各種酒曲質(zhì)量的策略，亦或是通過在制曲車間環(huán)境中添加一定比例的優(yōu)勢(shì)微生物來提高曲中核心微生物的豐度，同樣可以達(dá)到提升酒曲質(zhì)量的目的。

4 結(jié)論

通過對(duì)清香型小曲及其種曲、清香型大曲和醬香型大曲高通量測(cè)序分析，不同酒曲樣品中真菌的多樣性和豐富度差異明顯。其中，勁牌公司在開放式環(huán)境下生產(chǎn)的土曲及其種曲真菌的α多樣性較高。在門水平上，8個(gè)酒曲樣品中子囊菌門、毛霉門和擔(dān)子菌門真菌占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其相對(duì)豐度總和均超過93%。在大曲樣品中主要含有子囊菌門、毛霉門類真菌，而小曲樣品中還含有4.3%～49.2%不等的擔(dān)子菌，說明了勁牌小曲制作工藝、原料等條件有利于富集擔(dān)子菌門類真菌。在各酒曲樣品中主要真菌屬有根霉屬、曲霉屬、假絲酵母屬、Apiotrichum、熱子囊菌屬、紅曲霉屬、根毛霉屬、威克漢姆酵母屬和毛霉屬。其中，勁牌桂花曲HHF中，由于添加了篩選的優(yōu)勢(shì)根霉菌，根霉屬占比達(dá)到79.7%。在QDF中含有較高比例的紅曲霉屬和根毛霉屬，代替根霉屬進(jìn)行淀粉原料的分解，行使糖化功能。在醬曲JF和清香型大曲QDF中，熱子囊菌屬比例較高，分析原因，可能與大曲較高的培菌制曲溫度有關(guān)。真菌α多樣性指數(shù)及主成分分析表明不同感官酒曲的真菌多樣性存在一定差異，為優(yōu)化酒曲感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供了真菌資源方面的參考。