劉 暢 孟 云 劉金棟 王雅美,* Guoyou Ye,2

研究簡報(bào)

結(jié)合QTL-seq和連鎖分析發(fā)掘水稻中胚軸伸長相關(guān)QTL

劉 暢1孟 云1劉金棟1王雅美1,*Guoyou Ye1,2

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所, 廣東深圳 518120;2國際水稻研究所, 菲律賓馬尼拉 DAPO Box 7777

中胚軸長度(mesocotyl length, ML)是影響旱直播水稻出苗和早期幼苗活力的重要性狀。發(fā)掘中胚軸伸長相關(guān)位點(diǎn), 解析其遺傳機(jī)制, 選育長中胚軸品種是促進(jìn)旱直播技術(shù)推廣最為經(jīng)濟(jì)和有效的方式。本研究以長中胚軸品種‘Changai’和短中胚軸品種‘IR 145’為親本構(gòu)建的F2遺傳分離群體為材料, 構(gòu)建長池和短池并開展深度重測序(50×)。利用Δ(SNP-index)和G-value兩種方法在3號(hào)染色體29.56~33.28 Mb處鑒定到1個(gè)中胚軸伸長相關(guān)位點(diǎn)。在候選區(qū)域開發(fā)KASP標(biāo)記, 對184個(gè)F2株系開展連鎖分析, 將候選區(qū)間縮小到28.89~31.03 Mb。結(jié)合基因注釋、連鎖分析和基因表達(dá)分析結(jié)果, 推測和為候選基因。這些基因分別與植物激素的調(diào)控和細(xì)胞分裂相關(guān)機(jī)制有關(guān)。本研究發(fā)掘了一個(gè)水稻中胚軸伸長相關(guān)位點(diǎn), 對選育長中胚軸品種有一定幫助。

中胚軸; 混合分組分析法; Δ(SNP-index); 連鎖分析; 候選基因

水稻是我國主要的糧食作物之一, 傳統(tǒng)的水稻栽培方式以育秧移栽為主。近年來, 隨著勞動(dòng)力成本的快速提高, 無需育秧移栽、節(jié)省大量人力和水資源的旱直播技術(shù)逐步成為我國水稻生產(chǎn)的發(fā)展方向[1-3]。然而, 旱直播水稻面臨的出苗率低、出苗不齊、生長勢差等問題長期無法解決。當(dāng)前我國多數(shù)推廣水稻品種和骨干親本不適宜于旱直播[4]。在種子萌發(fā)過程中, 位于幼苗胚芽鞘節(jié)與胚根基部之間的中胚軸組織的伸長有助于水稻在土壤深處或水下播種時(shí)的成苗, 提高出苗的整齊度和生長勢, 是旱直播水稻應(yīng)用的關(guān)鍵性狀[5-7]。因此, 發(fā)掘控制中胚軸伸長相關(guān)基因, 篩選和創(chuàng)制長中胚軸種質(zhì), 對培育適于旱直播的新品種, 促進(jìn)旱直播技術(shù)的推廣具有重要意義。

水稻中胚軸長度(mesocotyl length, ML)是一種由多基因控制的數(shù)量遺傳性狀[8]。數(shù)量遺傳性狀基因挖掘的傳統(tǒng)方法是利用雙親分離群體, 構(gòu)建高密度、均勻分布、覆蓋全基因組的分子標(biāo)記連鎖圖, 結(jié)合表型數(shù)據(jù)來定位控制目標(biāo)性狀的數(shù)量性狀基因位點(diǎn)(quantitive trait loci, QTL)。已有部分研究通過QTL定位和全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS)的方法, 發(fā)掘了50余個(gè)水稻中胚軸伸長相關(guān)位點(diǎn), 在12條染色體上均有分布[9-11]。近年來關(guān)于中胚軸伸長相關(guān)的遺傳機(jī)制已有報(bào)道。Xiong等[8]發(fā)現(xiàn)乙烯(ethylene, ETH)可通過抑制基因的表達(dá)、控制茉莉酸(jasmonic acid, JA)的生物合成來調(diào)控中胚軸的伸長。Zhao等[12]發(fā)現(xiàn)2個(gè)控制中胚軸伸長的基因,和, 在長中胚軸材料中的表達(dá)量顯著低于短中胚軸材料。Sun等[13]發(fā)現(xiàn)基因可通過協(xié)調(diào)獨(dú)腳金內(nèi)酯(strigolactone, SL)和油菜素內(nèi)酯(brassinolide, BR)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來調(diào)節(jié)中胚軸的伸長。Zheng等[14]發(fā)現(xiàn)Karrikin信號(hào)通路與BR信號(hào)通路可共同調(diào)控中胚軸的伸長。

多數(shù)農(nóng)藝性狀為多基因控制的數(shù)量遺傳性狀[15-17], 其遺傳機(jī)制復(fù)雜, 發(fā)掘目標(biāo)性狀控制位點(diǎn), 并解析其遺傳機(jī)制, 選育優(yōu)良目標(biāo)品種, 一直是困擾遺傳學(xué)家和育種家的難題。傳統(tǒng)的連鎖分析和GWAS方法均需要通過SSR、SNP芯片或重測序的方式針對遺傳群體所有材料開展基因型檢測, 耗費(fèi)大量人力、物力和時(shí)間。混合分組分析法(bulked segregant analysis, BSA)是一種基于目標(biāo)性狀差異,在研究群體中選擇一定量的個(gè)體(20~50個(gè))并提取DNA, 等量混合構(gòu)建混池, 以進(jìn)行基因型分析的方法[18]。DNA混池間存在多態(tài)性的標(biāo)記, 則可看作與目標(biāo)性狀基因關(guān)聯(lián)。BSA法不需要對每個(gè)單株進(jìn)行基因分型, 可快速檢測出與目的基因緊密連鎖的標(biāo)記, 能夠節(jié)約大量成本, 有效提升效率, 在水稻、玉米、小麥、油菜等多種農(nóng)作物數(shù)量性狀基因的定位研究中起著非常重要的作用[19-23]。結(jié)合BSA和二代測序技術(shù)(next generation sequencing, NGS)的QTL-seq技術(shù)結(jié)合了兩者的優(yōu)點(diǎn), 可低成本、快速和高效地確定目標(biāo)QTL。KASP技術(shù)是基于PCR的高通量SNP分型技術(shù), 可基于特定群體的變異信息, 在目標(biāo)區(qū)域開發(fā)特異標(biāo)記, 快速完成基因型檢測。KASP技術(shù)發(fā)展迅速, 在農(nóng)藝性狀QTL定位中發(fā)揮了重要的作用。將QTL-seq與基于KASP標(biāo)記的連鎖分析相結(jié)合的策略, 在作物數(shù)量性狀基因挖掘研究中已得到應(yīng)用[24-26]。Lu等[25]利用QTL-seq定位到一個(gè)控制黃瓜早花性狀的主效QTL (), 結(jié)合遺傳連鎖分析, 將其定位在一個(gè)890 kb的基因組區(qū)域, 并推測為候選基因。Das等[16]將QTL-seq與傳統(tǒng)QTL定位相結(jié)合, 把控制鷹嘴豆千粒重的QTL ()區(qū)域由1.37 Mb縮小到35 kb范圍內(nèi)。Wang等[24]在F2群體中利用QTL-seq將控制甘藍(lán)型油菜分枝角度的QTL定位在6號(hào)染色體17.74~18.32 Mb之間。

相較于傳統(tǒng)的連鎖分析和GWAS分析, QTL-seq可快速、高效地發(fā)掘控制作物重要農(nóng)藝性狀的遺傳位點(diǎn), 在數(shù)量基因發(fā)掘領(lǐng)域已有較為成熟的應(yīng)用[27-29]。盡管中胚軸相關(guān)遺傳研究已有部分報(bào)道, 但已發(fā)掘的遺傳位點(diǎn)仍不能滿足當(dāng)前長中胚軸育種的需求。因此, 發(fā)掘新的中胚軸伸長相關(guān)QTL, 針對目標(biāo)QTL開發(fā)可用分子標(biāo)記對于深入探究水稻中胚軸伸長機(jī)制, 創(chuàng)制長中胚軸種質(zhì)十分必要。本研究采用前期篩選到的長中胚軸品種‘Changai’與短中胚軸品種‘IR 145’構(gòu)建的F2群體為材料, 利用QTL-seq和區(qū)間連鎖分析相結(jié)合的方法, 發(fā)掘控制中胚軸伸長的基因組區(qū)段及目標(biāo)基因, 解析中胚軸伸長遺傳機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以短中胚軸材料‘IR 145’ (0.18 cm)為母本, 長中胚軸材料‘Changai’ (4.75 cm)為父本, 于2018年6月配制雜交組合, 收獲F1代種子后, 同年12月在海南試驗(yàn)基地進(jìn)行南繁加代, 2019年4月單株采收獲得F2代種子。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 幼苗培養(yǎng)與中胚軸長度測定 挑選720粒飽滿無開裂的種子, 播種于裝有定量均質(zhì)營養(yǎng)土的10×5孔穴盤內(nèi), 每孔深度9.5 cm, 上層直徑4.5 cm, 底層直徑2.1 cm, 每穴孔內(nèi)播種15粒, 共計(jì)播種48穴, 其余兩穴種植親本, 確保籽粒間無互相擠壓并覆蓋營養(yǎng)土至與穴孔表面平齊。稱取500 g營養(yǎng)土至托盤內(nèi)并壓實(shí), 將穴盤置于托盤內(nèi), 取適量純凈水分別噴灑穴盤與托盤, 并將其置于30℃恒溫黑暗培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每日定時(shí)澆水至出苗, 并記載發(fā)芽情況。恒溫培養(yǎng)7 d, 將穴盤從人工氣候箱中取出, 以流動(dòng)水沖洗幼苗根部營養(yǎng)土。去除長勢較差單株, 選取均勻一致株系照相并利用ImageJ測量中胚軸長度。

1.2.2 混池測序 基于雙親本及F2分離群體的中胚軸長度構(gòu)建極長和極短混池。具體方式如下, 由F2群體中分別選取50株極長和極短株系, 采用CTAB法提取單株DNA, 并等量混合形成長池和短池?；贗llumina HiSeq 2500平臺(tái)(北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司)對雙親本和極端池進(jìn)行高深度(50×)全基因組重測序(PE150)。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 將測序得到的raw reads進(jìn)行質(zhì)控獲得clean reads。質(zhì)控原則如下: (1) 去除含接頭的reads; (2) 去除N比例大于10%的reads; (3) 去除低質(zhì)量reads (質(zhì)量值Q≤3的堿基數(shù)占整個(gè)read的50%以上)。利用BWA軟件將clean reads與日本晴參考基因組RGAP7 (Rice Genome Annotation Project, MSU)進(jìn)行比對。采用GATK (https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us)推薦算法發(fā)掘SNP (single nucleotide polymorphism)和InDel (insertion- deletion)位點(diǎn)。獲得SNP和InDel信息后, 以‘IR 145’作為參考等位基因, 采用滑動(dòng)窗口策略來繪制2個(gè)子代混合池的SNP-index圖(以1 Mb為窗口, 10 kb為步長), 并過濾掉1 Mb范圍內(nèi)小于10個(gè)SNP位點(diǎn)的區(qū)域。為了減少測序和比對錯(cuò)誤的影響, 同時(shí)過濾掉子代SNP-index都小于0.3和SNP深度小于6的位點(diǎn)。得到2個(gè)子代混合池的SNP-index圖后, 計(jì)算分離位點(diǎn)在子代2個(gè)極端池之間基因頻率的差值Δ(SNP-index), 并進(jìn)行1000次置換檢驗(yàn), 選取99%置信水平作為閾值, 超過閾值外的區(qū)域?yàn)闈撛诘腝TL候選區(qū)域。同時(shí), 計(jì)算該群體的-value來驗(yàn)證以上結(jié)果。Δ(SNP-index)和-value分析由基于R語言的QTL-seqr包進(jìn)行[30]。

1.2.4 競爭性等位基因特異性PCR (kompetitive allele specific PCR, KASP)標(biāo)記檢測 選取184個(gè)長勢正常的F2單株進(jìn)行中胚軸長度測定。根據(jù)由QTL-seq研究中獲得的置信區(qū)間內(nèi)的SNP位點(diǎn)和側(cè)翼序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物, 開發(fā)KASP分子標(biāo)記。同時(shí), 為規(guī)避遺傳背景影響, 其他每條染色體設(shè)計(jì)6個(gè)KASP標(biāo)記作為背景標(biāo)記。每個(gè)標(biāo)記設(shè)計(jì)2條SNP特異性引物(F1/F2)和一條通用引物(R), F1尾部添加能夠與FAM熒光結(jié)合的特異性序列(5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′), F2尾部添加能夠與HEX熒光結(jié)合的特異性序列(5′-GAAGGTCGGAGT CAACGGATT-3′)。引物序列見附表1 (未展示序列標(biāo)記由長沙華智生物技術(shù)有限公司提供)。按照LGC (https:// www.lgcgroup.com/)提供的標(biāo)準(zhǔn)方法設(shè)計(jì)KASP引物, 由上海生工生物工程股份有限公司合成。采用CTAB法提取對應(yīng)單株葉片的DNA, 委托長沙華智生物技術(shù)有限公司對質(zhì)檢合格的DNA樣品進(jìn)行KASP標(biāo)記檢測。KASP擴(kuò)增反應(yīng)體系為10 μL, 具體為: 5 μL 2 × KASP Master Mix, 0.14 μL KASP Primer Mix, 1.0 μL模板DNA (60 ng μL–1), 3.86 μL ddH2O。KASP反應(yīng)程序?yàn)? 94℃熱處理15 min; 94℃變性20 s, 61℃退火和延伸60 s, 10個(gè)循環(huán)(每循環(huán)降低0.6℃); 94℃變性20 s, 55℃退火和延伸60 s, 26個(gè)循環(huán); 4℃避光保存。

1.2.5 遺傳圖譜構(gòu)建及QTL鑒定 根據(jù)兩親本序列信息, 在利用QTL-seq發(fā)掘到的置信區(qū)間及其他背景染色體(每條染色體開發(fā)6個(gè))設(shè)計(jì)KASP熒光標(biāo)記, 在F2群體中選擇184個(gè)株系開展基因型檢測。與母本型相同的標(biāo)記記為“2”, 與父本型相同的標(biāo)記記為“0”, 雜合帶型的標(biāo)記記為“1”, 模糊或缺失帶型的標(biāo)記記為“?1”。選取分型準(zhǔn)確且非偏分離的KASP標(biāo)記, 采用JoinMap v4.0基于Kosambi函數(shù)計(jì)算遺傳距離[31], 構(gòu)建遺傳連鎖圖。利用ICI Mapping v4.2的復(fù)合區(qū)間作圖法(inclusive composite interval mapping, ICIM)[32]進(jìn)行QTL分析, 將LOD值2.5作為判斷QTL存在的閾值。

1.2.6 表型數(shù)據(jù)分析 利用Microsoft Excel 2019對Changai/IR 145 F2群體的中胚軸長度進(jìn)行基本統(tǒng)計(jì)量分析。

1.2.7 連鎖區(qū)域候選基因預(yù)測和表達(dá)量分析 水稻中胚軸伸長受到多種植物激素的調(diào)控, 如JA[8]、SL[13]、BR[13]、赤霉素(gibberellin, GA)[33]、生長素(auxin, IAA)[34-35]、ETH[8,33]、脫落酸(abscisic acid, ABA)[36]和細(xì)胞分裂素(cytokinin, CTK)[37]?；赒TL-seq分析和連鎖定位結(jié)果, 結(jié)合基因注釋信息, 初步確定候選基因清單(附表2)。于第8天取親本‘IR 145’和‘Changai’幼苗的中胚軸組織用于表達(dá)量檢測。采用TRIzol法提取總RNA并檢測總RNA濃度和純度, 根據(jù)純度數(shù)值選取優(yōu)質(zhì)RNA樣品并根據(jù)濃度值確定RNA模板加樣量。依照Thermo Scientific公司提供的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)合成20 μL cDNA。將cDNA模板用無菌雙蒸水稀釋5~10倍, 按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒要求配制qPCR反應(yīng)體系, 在Step One Plus實(shí)時(shí)定量PCR儀器運(yùn)行反應(yīng), 使用2-ΔΔCT運(yùn)算方式進(jìn)行基因表達(dá)水平數(shù)據(jù)分析。每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù), 以、和管家基因?yàn)閮?nèi)參基因?qū)虮磉_(dá)數(shù)據(jù)歸一化分析, 計(jì)算候選基因在‘IR 145’和‘Changai’的相對表達(dá)量。

紅色標(biāo)識(shí)處為對應(yīng)品種中胚軸部位。左側(cè)為‘IR 145’, 中胚軸長度為0.18 cm左右。右側(cè)為‘Changai’,中胚軸長度為4.75 cm左右。

The mesocotyl section is marked by red mark. The left is ‘IR 145’ with a mesocotyl length of about 0.18 cm. The right is ‘Changai’ with a mesocotyl length of about 4.75 cm.

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及F2分離群體的表型測定

在30℃條件下黑暗培養(yǎng)7 d后, ‘IR 145’的中胚軸長度為0.18 cm, ‘Changai’的中胚軸長度為4.75 cm (圖1), 中胚軸長度呈極顯著差異(< 0.01)。在IR 145/Changai F2群體中, 中胚軸長度呈正態(tài)分布(圖2)。以上結(jié)果表明水稻中胚軸長度是一種典型的由多基因控制的數(shù)量遺傳性狀。

2.2 混池測序結(jié)果

2.2.1 測序質(zhì)量分析 對從F2群體中選擇的50個(gè)長中胚軸單株和50個(gè)短中胚軸單株分別構(gòu)建混池并開展高深度(50×)重測序。對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控后共計(jì)獲得數(shù)據(jù)107.9 Gb, 平均測序深度分別為51.32× (Changai), 47.49× (IR 145), 57.83× (長池)和66.53× (短池) (附表3)。將4個(gè)樣本的clean reads分別與日本晴參考基因組進(jìn)行比對, 發(fā)現(xiàn)平均比對效率均在97.32%以上。測序數(shù)據(jù)質(zhì)量合格, 可用于后續(xù)變異檢測與分析。

2.2.2 變異檢測及候選區(qū)間分析 將2個(gè)極端池的clean reads與‘IR 145’參考基因組進(jìn)行比對后, 共計(jì)檢測到7,021,541個(gè)SNP。計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)的SNP-index并過濾掉低質(zhì)量的SNP, 最終獲得3,267,590個(gè)高質(zhì)量SNP位點(diǎn)。根據(jù)SNP頻率, 對SNP-index在染色體上的分布進(jìn)行作圖。以1 Mb為單位窗口, 10 kb為步長, 計(jì)算窗口內(nèi)的SNP-index平均值來反映子代的SNP-index分布并繪制分布圖。將長池與短池所有SNP位點(diǎn)的2個(gè)SNP-index相減得到?(SNP-index)值 (圖3)。以95%置信水平作為關(guān)聯(lián)染色體區(qū)域的篩選閾值, 在3號(hào)染色體鑒定出一個(gè)中胚軸伸長相關(guān)候選區(qū)域(29.56~33.28 Mb), 區(qū)間總長為3.72 Mb, 頂點(diǎn)位于31.29 Mb處(圖3-A)。-value分析也顯示該區(qū)間為顯著關(guān)聯(lián)區(qū)域(圖3-B)。

X軸表示F2群體中胚軸長度, 分為0.18~1.21, 1.21~2.23, 2.23~3.26, 3.26~4.29 和4.29~5.32 cm 5個(gè)水平。Y軸表示各個(gè)水平的個(gè)體數(shù)。

The X-axis represents the mesocotyl length of the F2population, which is divided into five levels: 0.18–1.21, 1.21–2.23, 2.23–3.26, 3.26–4.29, and 4.29–5.32 cm. The Y-axis denotes the number of individuals at each level.

A: Δ(SNP-index)在水稻12條染色體上的分布, 其中, 紅色和綠色代表的置信區(qū)間為95%和99%; B:-value在12條染色體上的分布, 閾值為FDR < 0.01.

A: the distribution of ?(SNP-index) is on 12 chromosomes in rice, and the confidence interval are 95% (red) and 99% (green), respectively; B: the distribution of-value is on 12 chromosomes with the interval of FDR < 0.01 in rice.

2.3 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及QTL分析

基于親本及極端池之間的SNP信息開發(fā)KASP標(biāo)記。經(jīng)過分型質(zhì)量和偏分離檢測后, 共計(jì)74個(gè)標(biāo)記可用于后續(xù)群體基因型檢測, 其中包含12個(gè)置信區(qū)間內(nèi)標(biāo)記和62個(gè)背景標(biāo)記(附表1)。利用在親本間存在多態(tài)性的74個(gè)標(biāo)記對184個(gè)F2代單株進(jìn)行SNP檢測。利用ICI Mapping v4.2的ICIM法對中胚軸長度進(jìn)行QTL定位。在3號(hào)染色體上檢測到一個(gè)中胚軸長度相關(guān)的QTL位點(diǎn), 位于標(biāo)記28,890,281~31,027,370之間, LOD值為2.65, 可解釋表型變異的8.82% (圖4)。

左側(cè)為3號(hào)染色體KASP標(biāo)記遺傳圖譜, 右側(cè)為對應(yīng)LOD曲線, LOD閾值設(shè)為2.5。

The genetic map constructed by KASP markers is on the left, whereas the corresponding LOD curve (LOD > 2.5) is on the right.

2.4 候選基因注釋及表達(dá)量分析

基于QTL-seq和連鎖分析結(jié)果, 結(jié)合日本晴基因組注釋信息, 初步篩選獲得14個(gè)候選基因(附表2)。采用qRT-PCR對上述基因進(jìn)行表達(dá)模式驗(yàn)證(圖5和附圖1)。結(jié)果表明,、和在長中胚軸品種‘Changai’和短中胚軸品種‘IR 145’中的表達(dá)量呈現(xiàn)顯著差異(< 0.05) (表1)。其中()和()在長中胚軸品種‘Changai’表達(dá)水平顯著高于短中胚軸品種‘IR 145’; 表明()和()參與并正調(diào)控中胚軸伸長。另外5個(gè)基因包括()、()、及2個(gè)同系物(、、), 在長中胚軸品種‘Changai’表達(dá)水平顯著低于短中胚軸品種‘IR 145’, 表明該5個(gè)基因參與并負(fù)調(diào)控中胚軸伸長。

3 討論

旱直播在多數(shù)水稻種植國家已得到大面積推廣, 是水稻生產(chǎn)的重要發(fā)展方向。解析水稻中胚軸伸長遺傳機(jī)制,對選育直播稻具有重要作用。當(dāng)前, 水稻直播出苗相關(guān)因素的研究已有較多報(bào)道, 且已發(fā)掘部分中胚軸伸長相關(guān)位點(diǎn), 為培育直播水稻品種提供了參考。但是, 當(dāng)前已發(fā)掘位點(diǎn)依然無法滿足水稻直播育種的需求, 發(fā)掘新的位點(diǎn)及其連鎖標(biāo)記, 對于解析中胚軸伸長遺傳機(jī)制, 選育直播水稻具有重要作用。本研究以‘IR 145’和‘Changai’2個(gè)中胚軸極端材料構(gòu)建F2群體, 結(jié)合QTL-seq和連鎖分析, 高效快速地發(fā)掘水稻中胚軸伸長相關(guān)基因, 為創(chuàng)制長中胚軸優(yōu)異種質(zhì)提供了材料。

本試驗(yàn)利用‘Changai’與‘IR 145’構(gòu)建的F2分離群體進(jìn)行QTL-seq分析, 在3號(hào)染色體上定位到了一個(gè)中胚軸發(fā)育相關(guān)的QTL(29.56~33.28 Mb)。對該位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記開發(fā)并掃描F2分離群體, 將區(qū)間縮小至28.89~31.03 Mb。本研究表明結(jié)合QTL-seq與連鎖分析可快速解析數(shù)量性狀遺傳基礎(chǔ)。隨著測序成本的迅速降低, 該策略的應(yīng)用將會(huì)更加廣泛。中胚軸的伸長除受環(huán)境及植物激素的影響外, 還受自身遺傳因素的影響。目前, 已從多個(gè)遺傳群體中定位到了數(shù)十個(gè)與水稻中胚軸長度相關(guān)的QTL。其中, 3號(hào)染色體含有多個(gè)控制水稻中胚軸伸長的位點(diǎn), 且在多個(gè)研究中均檢測到(附表4)。Redona和Mackill[38]利用Labelle和Black Gora的F2群體檢測到5個(gè)控制中胚軸長度的QTL, 分別位于1號(hào)、3號(hào)、5號(hào)和7號(hào)染色體上。Katsuta-Seki等[39]利用Daorenqiao和Surjumkhi的F2:3家系, 在3號(hào)、6號(hào)和11號(hào)染色體上定位了3個(gè)控制中胚軸長度的QTL。曹立勇等[9]利用秈稻IR64和粳稻Azucena雜交的F1代花粉離體培養(yǎng)獲得的DH群體, 定位了控制中胚軸長度的8個(gè)QTL, 分別位于1號(hào)、3號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)和12號(hào)染色體上。Wu等[40]利用GWAS在1號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)和9號(hào)染色體上均定位到與中胚軸伸長相關(guān)的QTL, 其中, 3號(hào)染色體上來自Kasalath的等位位點(diǎn)貢獻(xiàn)率高達(dá)37.6%。Lee等[15]用Kasalath/Nipponbare構(gòu)建的97個(gè)回交重組自交系對中胚軸長度進(jìn)行QTL定位, 檢測到、和三個(gè)位點(diǎn), 其中在2個(gè)重復(fù)中均存在。Zhao等[12]利用GWAS在3號(hào)和7號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)2個(gè)控制中胚軸伸長的基因和, 并證明兩基因在長中胚軸材料中的表達(dá)量顯著低于短中胚軸材料, 其調(diào)控機(jī)理尚不明確。Liu等[10]利用207份東南亞和我國秈稻種質(zhì), 采用5種不同的基質(zhì)環(huán)境, 在染色體上(除10號(hào)、11號(hào)染色體外)發(fā)掘到16個(gè)遺傳位點(diǎn), 分別解釋6.3%~ 15.9%的表型變異。本研究在3號(hào)染色體上檢測到的位點(diǎn)位于28.89~31.03 Mb處, 與Zhao等[12]和Lee等[15]發(fā)現(xiàn)的QTL位于同一區(qū)域。是一個(gè)在多項(xiàng)研究中均發(fā)現(xiàn)的中胚軸伸長相關(guān)穩(wěn)定QTL位點(diǎn)。

中胚軸伸長受到多種植物激素的調(diào)控。JA和SL抑制中胚軸伸長, BR低濃度和高濃度分別促進(jìn)和抑制中胚軸伸長, GA、IAA、ETH、ABA和CK促進(jìn)中胚軸伸長。其中, ETH是通過抑制JA的合成來促進(jìn)中胚軸伸長, SL和CK拮抗調(diào)節(jié)中胚軸伸長, ETH、ABA和GA三者協(xié)同促進(jìn)中胚軸伸長。目前, 報(bào)道克隆的基因均與激素調(diào)控相關(guān), 分別是、和(附表5)。研究發(fā)現(xiàn),作用于介導(dǎo)的乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游以調(diào)節(jié)中胚軸的伸長, 通過促進(jìn)JA合成相關(guān)基因的表達(dá)抑制中胚軸的伸長[8]。通過協(xié)調(diào)SL和BR信號(hào)傳導(dǎo)來調(diào)控中胚軸的伸長。其中, BR通過抑制對細(xì)胞周期蛋白CYC U2的磷酸化以促進(jìn)中胚軸伸長。此外, BR還能通過增強(qiáng)相關(guān)基因的表達(dá), 如促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂基因、縮短細(xì)胞周期基因等, 來增強(qiáng)細(xì)胞分裂。SL通過F-box蛋白D3降解被磷酸化的CYC U2來抑制中胚軸的伸長[13]。與TOPLESS-RELATED PROTEINs (TPRs)相互作用, 調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)以促進(jìn)中胚軸的伸長[14]。GA則通過改變細(xì)胞微管的排列方向, 增強(qiáng)果膠甲酯化來促進(jìn)細(xì)胞伸長, 進(jìn)而促進(jìn)中胚軸伸長[41]。IAA則主要上調(diào)細(xì)胞壁松弛酶活性, 使得細(xì)胞壁呈現(xiàn)持續(xù)松弛的狀態(tài), 通過細(xì)胞生長達(dá)到中胚軸伸長的效果[34-35,42]。ABA通過增強(qiáng)胚芽鞘節(jié)附近的細(xì)胞分裂, 抑制BR信號(hào)通路促進(jìn)中胚軸伸長[43]。ETH通過抑制JA合成來促進(jìn)中胚軸伸長[8]。

圖A~N依次表示14個(gè)候選基因在‘IR 145’與‘Changai’中胚軸組織中的相對表達(dá)量。內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。、、、、、和在短中胚軸品種‘IR 145’和長中胚軸品種‘Changai’中的表達(dá)量呈現(xiàn)顯著差異(< 0.05)。

Figure A–N shows the relative expression levels of 14 candidate genes in the mesocotyl tissues of ‘IR 145’ and ‘Changai’, respectively. The internal reference gene is. The relative expression levels of,,,,,, andwere significantly different between the short-mesocotyl variety ‘IR 145’ and long-mesocotyl variety ‘Changai’ at< 0.05.

表1 水稻中胚軸伸長相關(guān)候選基因

綜合注釋信息、QTL-seq、連鎖分析和表達(dá)模式結(jié)果, 在定位區(qū)間內(nèi)鑒定到7個(gè)候選基因, 分別為、和。其中,和在長中胚軸品種‘Changai’表達(dá)水平顯著高于短中胚軸品種‘IR 145’, 表明和參與并正調(diào)控中胚軸伸長。隸屬的TIFY家族是特異性參與調(diào)節(jié)植物發(fā)育和逆境反應(yīng)多種生物進(jìn)程, 該家族基因存在結(jié)合DNA的C2C2-GATA鋅指結(jié)構(gòu), 又稱GATA家族[44]。水稻GATA家族由20個(gè)基因構(gòu)成, 蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)/存在CCT結(jié)構(gòu)域, 可被轉(zhuǎn)錄后差異剪接從而行使不同功能[45]。在水稻幼苗期表達(dá)量最高, 并參與光依賴基因調(diào)控和硝酸鹽同化[46], 特定CCT結(jié)構(gòu)域表明其具有潛在的調(diào)節(jié)抽穗時(shí)間的能力[47]。類纖維合成酶在雄蕊和胚根中特異性表達(dá), 催化非纖維素基質(zhì)多糖的合成, 促進(jìn)原生及次生細(xì)胞壁的伸展[48]。細(xì)胞壁在細(xì)胞伸長擴(kuò)張和形態(tài)形成中具有關(guān)鍵性作用, 松弛的細(xì)胞壁有利于中胚軸伸長, 有研究表明, 玉米中胚軸中特異性表達(dá)的類纖維合成酶通過增強(qiáng)細(xì)胞壁的伸展性調(diào)節(jié)中胚軸伸長[49-50]。

另外5個(gè)基因, 包括、、及2個(gè)同系物在長中胚軸品種‘Changai’表達(dá)水平顯著低于短中胚軸品種‘IR 145’, 表明該5個(gè)基因參與并負(fù)調(diào)控中胚軸伸長。ERF亞家族B族的轉(zhuǎn)錄因子在脅迫環(huán)境下調(diào)控植物生長,過表達(dá)致使植物的發(fā)芽率下降、抑制和應(yīng)激基因表達(dá), 是植物生長的負(fù)調(diào)節(jié)因子[51]。在生長缺陷型過表達(dá)植株富集表達(dá), 并受γ射線(gamma ray, GR)和離子束(ion beam, IB)強(qiáng)烈誘導(dǎo)[52-53]。吲哚作為種間和種內(nèi)信號(hào)因子與水稻生長發(fā)育和防御系統(tǒng)的形成過程密切相關(guān), 水稻有5個(gè)基因編碼磷酸吲哚-3-甘油酶IGL, 其中(Os03g58300)是吲哚生物合成的真正的IGL。綜上所述,鑒定出7個(gè)控制中胚軸伸長候選基因, 均是第一次被發(fā)現(xiàn)參與中胚軸發(fā)育且存在不同方式的調(diào)控機(jī)制。下一步將針對這7個(gè)基因開展遺傳轉(zhuǎn)化以確認(rèn)其功能。

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Combining QTL-seq and linkage analysis to identify the QTL of mesocotyl elongation in rice (L.)

LIU Chang1, MENG Yun1, LIU Jin-Dong1, WANG Ya-Mei1,*, and Guoyou Ye1,2

1Agricultural Genomics Institute in Shenzhen, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shenzhen 518120, Guangdong, China;2International Rice Research Institute, Metro Manila DAPO Box 7777, Philippines

Mesocotyl length is an important trait, which affects seedling establishment and early seedling vigor after dry direct seeding. Identifying the loci related to mesocotyl elongation, analyzing the genetic mechanism and selecting varieties with long mesocotyl is the most economic and effective way to promote the popularization of dry direct seeding technology. In this study, an F2population constructed with ‘Changai’ (an extremely long mesocotyl variety) and ‘IR 145’ (an extremely short mesocotyl variety) was used to construct long and short DNA pool, which were re-sequenced at 50×level. Two methods, ΔSNP–index and G–value, were used to identify the quantitative trait loci (QTL) for mesocotyl elongation. A QTL named as, located in the region of 29.56–33.28 Mb on chromosome 3 were detected. After linkage analysis of 184 F2lines with the newly developed KASP markers based on this locus, the region was narrowed down to 28.89–31.03 Mb. Combining the results of gene annotation, linkage analysis, and gene expression analysis,,,,,,,andwere speculated to be candidate genes in this region. These genes were involved in the regulation of plant hormones as well as the mechanism of cell division. This study uncovers a locus related to rice mesocotyl elongation and is helpful for the breeding of long mesocotyl varieties.

mesocotyl; bulked segregant analysis; Δ(SNP-index); linkage analysis; candidate gene

10.3724/SP.J.1006.2021.02082

本研究由中國博士后科學(xué)基金項(xiàng)目(2020M68299)和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程協(xié)同創(chuàng)新任務(wù)(CAAS-XTCX2016001)資助。

This study was supported by the China Postdoctoral Science Foundation (2020M68299) and the Agricultural Science and Technology Innovation Program Cooperation and Innovation Mission of the Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS-XTCX2016001).

王雅美, E-mail: wangyamei@caas.cn

E-mail: woshiyonghwa@163.com

2020-11-30;

2021-03-23;

2021-04-07.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210407.0922.004.html