周 練 劉朝顯 陳秋欄 王文琴 姚 順 趙子堃 朱思穎 洪祥德 熊雨涵 蔡一林

玉米籽粒缺陷突變基因的精細定位及候選基因分析

周 練 劉朝顯 陳秋欄 王文琴 姚 順 趙子堃 朱思穎 洪祥德 熊雨涵 蔡一林*

西南大學玉米研究所 / 農(nóng)業(yè)科學研究院 / 南方山地作物逆境生物學國家級培育基地, 重慶 400715

玉米籽粒與產(chǎn)量和營養(yǎng)品質(zhì)密切相關(guān), 控制籽粒發(fā)育基因的功能研究對解析籽粒發(fā)育分子機制, 提高玉米產(chǎn)量, 改善籽粒營養(yǎng)品質(zhì)提供重要依據(jù)。利用甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate, EMS)處理B73花粉, 篩選到一個玉米籽粒缺陷突變體()。表現(xiàn)出成熟籽粒變小、皺縮、顏色發(fā)白等特征; 遺傳分析表明是一個單基因控制的隱性突變體。石蠟切片顯示淀粉胚乳細胞形狀不規(guī)則且排列致密, 掃描電鏡觀察成熟籽粒胚乳中心區(qū)域發(fā)現(xiàn)淀粉粒周圍蛋白體比野生型少且排列疏松。成熟籽粒的總蛋白、醇溶蛋白、各氨基酸組分和全氮含量相比野生型都顯著降低。利用F2分離群體中的1566個單株, 把定位在7號染色體標記SSR6和SSR7之間, 物理位置約為290 kb。該區(qū)間有3個基因, 基因測序發(fā)現(xiàn)基因第2個外顯子上第351個堿基由G突變?yōu)锳, 從而導致蛋白翻譯的提前終止。該基因在玉米籽粒中特異性表達, 且在12 DAP (days after pollination)籽粒中表達量最高。通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行靶向突變確定候選基因?qū)е略撏蛔儽硇汀＞幋a一個與ZmNRT1.5 (nitrate transporter)具有較高同源性的MFS (major facilitator superfamily)家族蛋白并定位在玉米原生質(zhì)體的細胞質(zhì)膜。該研究為揭示在玉米籽粒發(fā)育的分子機制奠定了重要基礎。

玉米;; 籽粒發(fā)育; 精細定位

玉米(L.)作為一年生禾本科植物, 是我國重要的糧食作物。玉米生產(chǎn)對保障我國糧食安全有著重要的戰(zhàn)略意義。隨著世界人口和經(jīng)濟水平的不斷增長, 對玉米產(chǎn)量和營養(yǎng)品質(zhì)的要求日益增長。玉米的胚和胚乳作為籽粒的主要組成部分, 來自植物雙受精作用, 與玉米產(chǎn)量和營養(yǎng)品質(zhì)密切相關(guān)。玉米籽粒主要是由淀粉、蛋白質(zhì)和油脂組成。其中淀粉和蛋白質(zhì)主要儲存在胚乳中, 油脂主要存在胚中。玉米胚乳由4種不同類型的細胞組成, 包括淀粉胚乳細胞、基部胚乳轉(zhuǎn)移層細胞、糊粉層細胞和胚包圍層細胞[1-2]。8~14 DAP胚乳細胞具有很強的有絲分裂活性, 到20~25 DAP時有絲分裂細胞只在包含糊粉層和亞糊粉層的外周細胞層增殖。淀粉胚乳細胞在胚乳的中央?yún)^(qū)域, 10 DAP淀粉胚乳細胞從有絲分裂轉(zhuǎn)變?yōu)楹藘?nèi)復制[1]。淀粉胚乳細胞儲存籽粒中大部分的淀粉和蛋白質(zhì), 有效地決定籽粒質(zhì)地和營養(yǎng)品質(zhì)。玉米籽粒胚乳的外側(cè)是蛋白體含量較多的透明區(qū)域, 而中心則是由較多淀粉粒和少量蛋白體組成的不透明區(qū)域。淀粉粒和蛋白體之間的比例決定著玉米籽粒的硬度, 也是玉米品質(zhì)的重要影響因素。玉米胚乳蛋白的質(zhì)量也會影響玉米營養(yǎng)品質(zhì)和病蟲害抗性。胚乳蛋白中醇溶蛋白(zein)的含量占籽?？偟鞍琢康?0%左右, 但醇溶蛋白中人體必需的賴氨酸含量低, 極大的降低了玉米的營養(yǎng)價值。因此, 醇溶蛋白和非醇溶蛋白的比例也是決定玉米籽粒品質(zhì)的重要因素之一。

隨著玉米全基因組測序的完成, 玉米籽粒發(fā)育及產(chǎn)量相關(guān)的基因功能研究逐漸成為熱點。玉米具有大量的籽粒突變體, 這些突變體籽粒表型表現(xiàn)異常。根據(jù)遺傳學分析, 可以分為3種不同的類型, 包括: (1) 單基因隱性突變體:突變體[3-6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]和[12]等,突變體影響籽粒胚和胚乳的發(fā)育, 使籽粒產(chǎn)生嚴重缺陷。例如突變體產(chǎn)生小粒的胚致死表型,基因編碼一種線粒體核糖體蛋白L9, 調(diào)節(jié)細胞生長和籽粒發(fā)育[12]。突變體[13]、[14-15]、[16]、[17]、[18]和[19]等,突變體籽粒粉質(zhì)化, 通過改變醇溶蛋白含量從而影響胚乳質(zhì)地和蛋白品質(zhì)。例如突變體基因編碼蛋白影響19-kD和22-kD α-zein以及16-kD γ-zein的合成, 從而引起蛋白體數(shù)量減少和變小, 出現(xiàn)粉質(zhì)胚乳表型[17]。(2) 顯性突變體(Mc)[20]和(De-B30)[21], DeB30突變體籽粒的非醇溶蛋白比正常籽粒增加了約70%。(3) 半顯性突變體[22]和[23],突變體也會引起胚乳粉質(zhì)化。例如由于單個氨基酸的突變使得22 kD α-zein的信號肽不能正常剪切從而導致蛋白體異常[23]。由于玉米基因組大, 且轉(zhuǎn)座子元件較多, 相比水稻等主要糧食作物, 仍有大量籽粒突變基因的功能及分子機制仍然不清楚。

本研究利用EMS處理玉米自交系B73花粉得到一個籽粒缺陷突變體(根據(jù)已發(fā)表的突變體順序命名)。本研究觀察了籽粒形態(tài)學和組織學結(jié)構(gòu), 分析了籽粒相關(guān)生化成分; 通過與Mo17構(gòu)建的F2分離群體對進行了基因定位, 并通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向突變確定了候選基因; 分析了基因在不同組織的時空表達情況及其編碼蛋白結(jié)構(gòu)和同源性比對, 明確了Dek54蛋白的細胞質(zhì)膜定位結(jié)果。該研究解析在玉米籽粒發(fā)育中的分子機制奠定了重要基礎。

1 材料與方法

1.1 dek54突變體獲得和分離群體構(gòu)建

2015年春, 于重慶北碚田間種植玉米自交系B73和Mo17, 收集B73花粉進行EMS (終濃度0.67 mL L–1)誘變處理; 將誘變處理后的花粉與Mo17植株進行雜交。同年下半年, 把獲得的M0代籽粒種植于云南元江, 自交后收獲果穗, 觀察表型, 篩選出了籽粒皺縮突變體。繼續(xù)用為母本與Mo17雜交, 構(gòu)建F2分離群體。提取1566個植株DNA, 鑒定其基因型, 篩選重組單株, 對進行精細定位。

1.2 石蠟切片和掃描電鏡觀察

分別取16 DAP果穗上的野生型和未成熟籽粒, 在福爾馬林-乙酸-乙醇固定液(FAA, 50%乙醇, 0.9 mmol L–1冰醋酸, 3.7%甲醛)中4℃固定過夜。將樣品放置在一系列乙醇和二甲苯梯度溶液中脫水, 在石蠟中進行包埋。將石蠟樣本切成10 μm的厚度,經(jīng)烤片并脫水后, 用1%番紅和固綠(Amresco)染色。熒光顯微鏡下(Leica, D3000)進行觀察。分別取F2果穗上野生型和的成熟籽粒, 經(jīng)臨界干燥、斷面噴金后, 在掃描電鏡下(Hitachi, SU3500)觀察與野生型的籽粒相同部位胚乳形態(tài)結(jié)構(gòu)差異。

1.3 籽粒蛋白、淀粉、氨基酸和全氮含量測定

分別取F2群體中同一個果穗上野生型和的成熟籽粒, 用水浸泡5 min, 并去除種皮和胚。將剩余胚乳部分在液氮中研磨成細粉。將真空抽干粉末各稱取50 mg兩份, 加入1 mL石油醚, 置于37℃搖床1 h; 去除石油醚, 加入硼酸鈉蛋白提取液和巰基乙醇, 37℃搖床過夜。分別提取每個樣品的總蛋白、醇溶蛋白和非醇溶蛋白, 并進行蛋白含量測定[17]?？偟矸酆康臏y量按照總淀粉測定試劑盒(Megazyme, K-TSTA-100A)使用說明進行。將樣品進行蛋白質(zhì)水解, 去除脂質(zhì)、色素等, 使用全自動氨基酸分析儀(Hitachi, L-8900)測定氨基酸含量, 每個樣品3次重復。將樣品用濃硫酸/雙氧水進行消煮, 使用凱氏定氮儀(Alva, KN580)測定全氮含量。

1.4 dek54連鎖標記篩選及精細定位

在F2群體中分別選擇10株野生型和10株突變體, 提取基因組DNA, 并等量混合, 構(gòu)建突變體DNA池(mutant DNA pool, MP)和野生型DNA池(wild-type DNA pool, WP)。利用實驗室已有的覆蓋玉米全基因組, 在B73和Mo17之間有多態(tài)性的432個SSR標記對這2個DNA進行擴增。篩選在2個DNA池之間具有多態(tài)性的分子標記。通過Gramene網(wǎng)站(http://www.gramene.org/)下載玉米基因組DNA序列, 并通過SSRHunter[24]開發(fā)SSR標記; 驗證在B73和Mo17之間具有多態(tài)性后用于的精細定位。

1.5 qRT-PCR

取B73根、莖、葉、未成熟雌穗(1~2 cm)和雄穗(1~2 cm)及12、14、16、18、20 DAP的未成熟籽粒和成熟籽粒, 迅速凍于液氮。提取總RNA, 進行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA[25]。qRT-PCR (quantitative reverse transcription- PCR)中利用玉米基因作為內(nèi)參, 樣品間同一基因的相對表達量通過下例公式計算: 2-DDCt。

1.6 載體構(gòu)建及玉米遺傳轉(zhuǎn)化

通過對候選基因gDNA序列進行分析, 選擇第2個外顯子的19 bp (5'-GCCGAG CTACCTCTGCGAC-3')的靶向序列。合成包括靶向序列和sgRNA在內(nèi)的寡核苷酸引物, 采用單編輯策略將該序列克隆到pCAMBIA3301-Cas9載體, 并將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105菌株。通過農(nóng)桿菌介導的玉米未成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化, 獲得玉米轉(zhuǎn)基因植株。通過測序來確定CRISPR/Cas9編輯玉米植株目標位置附近的編輯位點, 獲得5個獨立的CRISPR/ Cas9基因敲除轉(zhuǎn)基因株系, 選擇2個轉(zhuǎn)基因株系進行后續(xù)實驗。

1.7 基因注釋及系統(tǒng)進化分析

通過NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和MaizeGDB (https://maizegdb.org/)等數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站, 搜索下載相關(guān)基因的基因組、cDNA和蛋白序列。通過BLAST CD-Search (basic local alignment search toolconserved domain search, https://www.ncbi.nlm. nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)比對分析目標蛋白的保守序列。將所有進行比對的氨基酸序列轉(zhuǎn)換成FASTA格式合并導出, 通過CLUSTALW進行多序列比分析, 在使用MEGA6進行N-J (neighbor-joining)進化樹構(gòu)建。

1.8 亞細胞定位

以玉米B73的12 DAP未成熟籽粒cDNA為模板, 通過PCR擴增的全長CDS序列(除去終止密碼子)連接到pAN580載體, 構(gòu)建Dek54-GFP融合表達載體。將含有正確插入片段的載體和質(zhì)膜定位標記載體PM107 (AtPIP1; 2-mCherry)分別通過PEG介導共轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體。在激光共聚焦顯微鏡(LSM800, Carl Zeiss)下觀察熒光。

2 結(jié)果與分析

2.1 dek54表型鑒定與遺傳分析

利用EMS化學誘變技術(shù)獲得了玉米籽粒缺陷突變體。該突變體與Mo17雜交, F1群體表型表現(xiàn)正常, 自交后F2果穗上產(chǎn)生分離(圖1-A)。統(tǒng)計5個F2果穗, 野生型(+/+和/+)與突變型(/)籽粒分別有1549粒和499粒, 適合度測驗結(jié)果顯示, 野生型和突變體籽粒的分離比接近3∶1 (χ2= 0.16 < χ20.05= 3.84), 說明是一個單基因控制的隱性突變體。

與野生型相比表現(xiàn)為, 成熟籽粒變小, 皺縮干癟, 且顏色發(fā)白(圖1-A, B)。對野生型和成熟籽粒進行徒手切片并在體式顯微鏡下觀察籽粒胚和胚乳的形態(tài)。籽?？v切面顯示, 突變體胚的形狀正常, 但顯著小于野生型(圖1-C), 突變體籽粒較野生型萌發(fā)延遲但后續(xù)生長正常(附圖1)。籽粒橫切面顯示, 突變體籽粒胚乳中間不透明的淀粉胚乳面積縮小, 分布在粉質(zhì)胚乳周圍的透明玻璃質(zhì)胚乳面積顯著增大(圖1-D)。野生型和的百粒重分別為31.2 g和10.0 g,僅為野生型的32.0%;十粒長和十粒寬分別為野生型的79.0%和66.7%, 均顯著低于野生型(圖1-E)。由此可見,突變顯著影響了籽粒胚和胚乳的發(fā)育。

2.2 dek54籽粒組織學觀察

取16 DAP的野生型和突變體籽粒進行石蠟切片觀察。結(jié)果顯示,的種皮與胚乳脫離, 胚乳細胞相比野生型發(fā)生了明顯變化, 表現(xiàn)在糊粉層細胞相比野生型層數(shù)增加, 并且淀粉胚乳細胞組織形態(tài)不規(guī)則并且相比野生型排列較密且較小(圖2-A)。說明突變顯著地影響胚乳細胞的發(fā)育。推測由于胚乳細胞發(fā)育的不完全使得突變體籽粒表現(xiàn)出皺縮的表型。對成熟籽粒橫截面的掃描電鏡觀察顯示, 相同位置的野生型胚乳中淀粉粒周圍有密集的蛋白體包圍, 而突變體的淀粉周圍蛋白體數(shù)量較少, 且排列較疏松(圖2-B)。

A: 成熟果穗F2分離群體; B: 籽粒表型; C: 籽粒縱切; D: 籽粒橫切; E: F2分離群體上野生型和突變體籽粒的百粒重、十粒長和十粒寬。標尺為0.5 cm。Em: 胚; En: 胚乳; SE: 粉質(zhì)胚乳; VE: 玻璃質(zhì)胚乳。

A: F2segregating population of mature ear; B: phenotypes of kernels; C: cross section of kernels; D: longitudinally section of kernels; E: 100-kernel weight, ten-kernel length, and ten-kernel width of WT andmutant kernels from F2segregating population. Bar: 0.5 cm. Em: embryo; En: endosperm; SE: starchy endosperm; VE: vitreous endosperm.

A: 16 DAP野生型和突變體籽粒的石蠟切片縱切觀察。標尺為100 μm。AL: 糊粉層; SE: 淀粉胚乳。B: 野生型和突變體成熟籽粒胚乳中心區(qū)域掃描電鏡觀察。標尺為50 μm。SG: 淀粉粒; PB: 蛋白體。

A: longitudinal paraffin sections observation of developing WT andmutant kernels at 16 DAP. Bar: 100 μm. AL: aleurone layer; SG: starch endosperm. B: scanning electron microscopy observation of the central regions of WT andmutant mature kernel endosperm. Bar: 50 μm. SG: starch granule; PB: protein body.

2.3 dek54相關(guān)生化成分檢測

分別提取野生型和成熟籽粒胚乳中的總蛋白、醇溶蛋白和非醇溶蛋白。結(jié)果顯示, 突變體的總蛋白和醇溶蛋白含量相比野生型分別降低了29.2%和27.6%, 而非醇溶蛋白沒有顯著差異(圖3-A)。成熟籽粒胚乳中的淀粉含量測定發(fā)現(xiàn), 突變體的胚乳淀粉含量與野生型沒有顯著差異(圖3-B)?？偘被岷繙y定顯示, 突變體籽粒胚乳中各類氨基酸含量相比野生型均顯著降低, 其中賴氨酸含量僅為野生型的63.0% (圖3-C)。進一步全氮含量測定結(jié)果表明,突變體的成熟籽粒中全氮含量顯著低于野生型, 降低了16.5% (圖3-D)。

2.4 dek54突變體的精細定位

利用432個在B73和Mo17基因組間有多態(tài)性的SSR標記對突變體DNA池和野生型DNA池進行篩選。發(fā)現(xiàn)SSR標記umc2160在2個DNA池中檢測出多態(tài)性(圖4-A), 該標記位于第7號染色體的7.01 bin。使用umc2160檢測33株的基因型, 結(jié)果顯示30株的基因型與表型相一致, 3株(17、25和27)因為染色體重組表現(xiàn)為雜合基因型(圖4-B), 由此證實了該標記與基因連鎖。在umc2160標記鄰近的區(qū)間開發(fā)新的SSR標記(表1)用于定位。利用F2群體中1566個單株將初步定位在與SSR標記SSR23403和SSR0308相鄰的8.52 Mb的物理區(qū)間內(nèi)(圖4-C)。進一步通過重組植株的篩選, 開發(fā)并篩選到8個具有多態(tài)性的SSR標記。在SSR1~8標記位置各篩選到交換單株20、11、11、3、2、2、2和11株。最終,定位在玉米7號染色體標記SSR6和SSR7之間物理距離約為290 kb的區(qū)間內(nèi)(圖4-C)。

野生型和突變體成熟籽粒的蛋白(A)、淀粉(B)、各氨基酸組分(C)和全氮含量(D)。

Protein (A), starch (B), amino acid components (C), and total nitrogen contents (D) of WT andmutant kernels.

A: umc2160的PCR擴增產(chǎn)物在WP和MP之間具有多態(tài)性; B: 通過33個單株的基因分型確定SSR連鎖標記umc2160; C: 通過F2群體1566個單株對進行精細定位。定位標記SSR6和SSR7之間物理距離約為290 kb的區(qū)間內(nèi)。黑色垂直實線上方為分子標記名稱, 下方數(shù)字為該標記鑒定的交換單株數(shù)量。

A: the polymorphic PCR products amplified by umc2160 between WP and MP; B: confirmation of linkage SSR marker umc2160 by genotyping 33mutant plants; C: fine mapping ofusing F2population including 1566 individuals.was mapped to an interval about 290 kb flanked by SSR6 and SSR7. The symbols above and below the black vertical solid lines represent the molecular marker and the number of recombinants, respectively.

表1 dek54定位SSR標記引物序列

表2 dek54定位區(qū)間基因注釋

2.5 候選基因序列及表達分析

Gramene玉米數(shù)據(jù)庫顯示SSR6和SSR7之間物理距離約為290 kb, 定位區(qū)間內(nèi)僅包括3個基因(表2), 通過擴增并測序, 比較這3個基因在與對照B73的DNA序列, 發(fā)現(xiàn)基因第2個外顯子上第351個堿基位點由G突變轉(zhuǎn)換為A, 導致密碼子由TGG變?yōu)門AG, 從而造成蛋白翻譯的提前終止(圖5-A); 而其他2個基因的DNA序列沒有差異。因此推測基因的突變是導致表型產(chǎn)生的原因。

通過qRT-PCR的方法, 檢測基因在玉米自交系B73的不同組織的表達情況, 包括根、莖、葉、雄穗、花絲、12、14、16、18、20 DAP的未成熟籽粒和成熟籽粒。檢測表明,基因在未成熟籽粒(12~20 DAP)中特異性表達; 且在12 DAP未成熟籽粒中表達量最高, 并隨著籽粒發(fā)育表達量逐漸下降, 在其他組織和成熟籽粒中均不能檢測到其表達(圖5-B)?；蛟谖闯墒熳蚜Ｖ械奶禺愋员磉_說明其在籽粒發(fā)育過程中發(fā)揮作用。

2.6 CRISPR/Cas9靶向突變Zm00001d019294基因表型鑒定

利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對基因進行靶向突變。以的第2個外顯子為靶標設計sgRNA間隔序列。獲得了5個獨立的CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因株系, 通過測序確定其中2個(和)含有由目標序列插入或缺失引起的密碼子移位突變(圖6-A)。CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因株系的成熟籽粒與表現(xiàn)出相似的缺陷表型(圖6-B~D)。該結(jié)果表明基因是引起該籽粒突變表型的目標基因。

A:基因結(jié)構(gòu)圖, 紅色箭頭所示為突變位點; B:基因在不同組織及發(fā)育中的未成熟籽粒中的表達分析。

A: gene structure diagram of. The red arrow indicates mutation sites. B: the relative expression level ofin different tissues and developing immature kernel.

A:的CRISPR/Cas9靶位點序列。sgRNA靶序列為綠色, PAM (protospacer-adjacent motif)序列為橙色, 紅色字母和短線分別代表插入和缺失; B:xMo17的F2成熟果穗; C: 成熟的WT和籽粒; D: 成熟的WT和籽粒的縱切。Em: 胚; En: 胚乳。標尺為0.5 cm。

A: the sequence in thelocus targeted using CRISPR/Cas9. The sgRNA target sequence is green. Protospacer-adjacent motif (PAM) is blue. Red letters and dashes represent insertions and deletions, respectively. B: mature F2ear ofxMo17. C: mature WT andkernels. D: longitudinal paraffin sections of mature WT andkernels. Em: embryo; En: endosperm. Bars: 0.5 cm.

2.7 Dek54蛋白預測及亞細胞定位

()由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成。的成熟轉(zhuǎn)錄本編碼序列長1923 bp, 編碼一個由640個氨基酸組成的蛋白。通過BLAST CD-Search比對分析該蛋白的保守序列, 結(jié)果表明, Dek54蛋白序列中包含MFS保守結(jié)構(gòu)域(圖7-A)。蛋白序列比對及系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn), Dek54蛋白與玉米和擬南芥硝酸鹽轉(zhuǎn)運體NRT1類蛋白具有較高的同源性, 且與ZmNRT1.5B和ZmNRT1.5A蛋白序列同源性最高(圖7-B)。通過PEG介導的玉米原生質(zhì)體共轉(zhuǎn)化及熒光顯微鏡觀察顯示, Dek54蛋白的綠色熒光與質(zhì)膜標記蛋白紅色熒光完全重合(圖8), 表明Dek54定位在細胞質(zhì)膜上。推測Dek54可能是一個位于細胞質(zhì)膜的硝酸鹽轉(zhuǎn)運體。

Dek54-GFP載體與mCherry標記的質(zhì)膜標記(mCherry-PM; CD3-1007)共定位。標尺為20 μm。

Dek54-GFP was co-localized with a mCherry-labeled plasma membrane marker (mCherry-PM; CD3-1007). Bar: 20 μm.

3 討論

籽粒缺陷(,)突變體是一類主要的玉米籽粒突變體。突變體表型變化極為顯著, 主要表現(xiàn)為, 胚乳發(fā)育缺陷、籽粒較小、種皮與胚乳分離、種皮顏色較淺, 且表面皺縮等特征[26]。本研究中,突變體具有突變體的典型表型特征, 其胚發(fā)育延遲, 胚乳發(fā)育不良; 相比野生型,籽粒的長、寬和粒重都顯著降低。是一個單基因控制的隱性突變體, 顯示為功能缺失突變。對玉米籽粒缺陷突變體進行精細定位, 并通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向突變實驗確定導致突變表型的基因。測序結(jié)果顯示,突變體在基因的第2個外顯子上有一個堿基突變導致該密碼子突變?yōu)榻K止子, 提前終止了蛋白序列。qRT-PCR結(jié)果表明,基因在未成熟籽粒中特異性表達, 并隨著籽粒的發(fā)育表達降低, 且在成熟籽粒中不表達。說明基因在玉米籽粒發(fā)育過程中起著重要作用。

玉米中突變體種類多, 涉及的機制非常復雜。至今, 超過20個突變體已被鑒定。大部分突變體都是由PPR (pentatricopeptide repeat)蛋白突變所引起[7,9-11,27-29]。PPR蛋白在線粒體和質(zhì)體中特異性作用于RNA編輯、剪輯、穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等重要進程[30], 但也有部分突變體不是PPR蛋白突變引起。例如Dek1編碼一個鈣蛋白酶家族蛋白, 影響籽粒胚和胚乳的糊粉層發(fā)育[3], 可能在陸地植物表面細胞位置傳感和信號傳遞過程中發(fā)揮重要作用[31]; Dek15編碼一個黏連蛋白裝載復合體亞基, 決定染色體分離和籽粒發(fā)育[8]。本研究中,基因編碼一個含有MFS保守結(jié)構(gòu)域的蛋白。MFS是一類廣泛存在細胞膜上的轉(zhuǎn)運蛋白家族, 由協(xié)同轉(zhuǎn)運體、共轉(zhuǎn)運體和反向轉(zhuǎn)運體共同組成, 能夠轉(zhuǎn)運多種底物包括無機和有機離子、核酸、氨基酸、短肽和脂類物質(zhì)[32], 在多種生理生化途徑中起著重要作用。所有的MFS轉(zhuǎn)運體都具有一個典型的MFS折疊。這個折疊包含了2個結(jié)構(gòu)域, 每個結(jié)構(gòu)域都由6個連續(xù)的跨膜基序組成, 分別稱為N端和C端結(jié)構(gòu)域[33]。Dek1蛋白由一個多跨膜結(jié)構(gòu)域(mutispanning tranmembrane domain, MEM)組成[3]。序列分析發(fā)現(xiàn), MFS和DEK1-MEM的第16到22個跨膜基序具有相似性, 推測MFS蛋白在響應化學滲透梯度促進各種溶質(zhì)跨膜運輸?shù)墓δ? 與MEM感知相鄰細胞表面膜和外部環(huán)境差異方面功能的作用是相容的[4]。硝酸鹽轉(zhuǎn)運體NRT1是在高等植物中唯一具有典型的MFS結(jié)構(gòu)的蛋白[34]。由于對氨基酸殘基T101的磷酸化[35], 使得NRT1蛋白對硝酸根離子NO3-具有雙親和力, 即高親和力和低親和力[36]。其中, AtNRT1.5介導NO3-的外排, 并在將NO3-裝載進入木質(zhì)部, 并轉(zhuǎn)運到地上部分起著重要作用[37]。AtNRT1.8負責從根和木質(zhì)部中提取NO3-, 并與AtNRT1.5協(xié)同調(diào)控NO3-的遠距離運輸[38]。將擬南芥和玉米的NRT1家族的蛋白以及Dek54蛋白進行比對及系統(tǒng)分析, Dek54與ZmNRT1.5B、ZmNRT1.5A、AtNRT1.5和AtNRT1.8分在一個組, 且具有最大的序列相似性。進一步研究表明, Dek54蛋白定位在玉米原生質(zhì)體的細胞質(zhì)膜上。組織學觀察顯示,突變體籽粒淀粉胚乳細胞組織形態(tài)不規(guī)則, 并且相比野生型排列較密且較小, 胚乳中心區(qū)域的淀粉粒周圍的蛋白體相比野生型較小, 且數(shù)量較少。突變成熟體籽粒的總蛋白、醇溶蛋白、各類氨基酸及全氮含量均顯著低于野生型。推測突變體可能由于硝酸鹽轉(zhuǎn)運體的缺失, 導致在玉米籽粒發(fā)育過程中不能有效的轉(zhuǎn)運氮, 從而造成胚乳和胚的發(fā)育缺陷。但Dek54如何在玉米籽粒發(fā)育中發(fā)揮功能的具體作用機制仍然不明確。我們發(fā)現(xiàn)新的籽粒突變體豐富了玉米籽粒發(fā)育的研究材料, 為進一步解析該基因在玉米籽粒發(fā)育過程的分子機制奠定了基礎。

4 結(jié)論

通過EMS化學誘變, 鑒定了一個新的玉米籽粒缺陷突變體。被定位在玉米7號染色體標記SSR6和SSR7之間物理距離約為290 kb的區(qū)間內(nèi)。測序發(fā)現(xiàn)基因的第2個外顯子上第351個堿基由G突變轉(zhuǎn)換為A, 從而引起蛋白翻譯的提前終止, 并在玉米未成熟籽粒中特異性表達。CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向突變實驗確定與突變表型相關(guān)的候選基因, 該基因編碼一個MFS家族蛋白并與ZmNRT1.5具有較高的同源性。此外, Dek54蛋白定位在玉米原生質(zhì)體的細胞質(zhì)膜上。突變體為解析玉米籽粒發(fā)育的分子機制提供了新的研究材料和理論依據(jù)。

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附圖1 野生型和成熟籽粒的發(fā)芽測試(發(fā)芽后5 d)

Fig. S1 Germination test of wildtype andmature kernels (5 days after germination)

標尺為1 cm。Bar: 1 cm.

Fine mapping and candidate gene analysis of maize defective kernel mutant

ZHOU Lian, LIU Chao-xian, CHEN Qiu-Lan, WANG Wen-Qin, YAO Shun, ZHAO Zi-Kun, ZHU Si-Ying, HONG Xiang-de, XIONG Yu-han, and CAI Yi-lin*

1Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100087, China;2Beijing Engineering and Technique Research Center for Hybrid Wheat, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences / Municipal Key Laboratory of the Molecular Genetics of Hybrid Wheat, Beijing 100097, China

Maize kernel is closely related to yield and nutritive quality. Study on the function of maize kernel development relative genes provides important basis for the molecular mechanism analysis, yield increasing and nutritive quality improving. B73 pollen was treated with ethyl methylmethanesulfonate (EMS) and a defective maize kernel() was screened.had small mature kernel, wrinkled and whitened seed coat phenotype. Genetic analysis indicated thatis a recessive mutant controlled by a single gene. Paraffin sections showed starchy endosperm cells ofhad irregular shape and dense arrangement at developmental stage. Scanning electron microscopy observation indicated that protein bodies around starch granules in the central region of themature kernel endosperm were fewer and arranged more loosely compare to wild type. Total protein, zein, amino acids components contents and total nitrogen content ofmature kernel were significantly lowered compared with the wild type.was located on chromosome 7 within the interval of the physical distance of about 290 kb between markers SSR6 and SSR7. Sequencing revealed that the 351th base G on the 2nd exon ofgene changed into A, which led to the premature termination of the protein translation.gene was specifically expressed in immature maize kernel, and has the highest expression in 12 DAP (days after pollination) immature kernel. Targeted mutation was performed using CRISPR/Cas9 system to identify that mutantphenotype was caused by candidate gene.encoded an MFS (major facilitator superfamily) protein and had high homology with ZmNRT1.5 (nitrate transporter). Besides, Dek54 protein was localized in the plasma membrane of maize protoplasts. The study oflaid the foundation for the molecular mechanism analysis of maize kernel development.

maize (L.);; kernel development; fine mapping

10.3724/SP.J.1006.2021.03060

本研究由國家自然科學基金項目(31601312)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31601312).

蔡一林, E-mail: caiyilin1789@163.com

E-mail:zhoulianjojo@swu.edu.cn

2020-10-15;

2021-01-13;

2021-03-02.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210301.1612.013.html