宋凝曦 李 霞,3,* 王 凈 吳博晗 曹 悅 楊 杰 謝寅峰

大環(huán)內酯類和高表達玉米C4基因對水稻耐旱性的影響

宋凝曦1,2李 霞1,2,3,*王 凈1,2吳博晗1,4曹 悅1,5楊 杰1,3謝寅峰2

1江蘇省農業(yè)科學院糧食作物研究所 / 江蘇省優(yōu)質水稻工程技術研究中心 / 國家水稻改良中心南京分中心, 江蘇南京 210014;2南京林業(yè)大學生物與環(huán)境學院, 江蘇南京 210037;3江蘇省糧食作物現(xiàn)代產業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇揚州 225009;4江蘇大學環(huán)境與安全工程學院, 江蘇鎮(zhèn)江 212013;5南京農業(yè)大學生命科學學院, 江蘇南京 210095

為揭示可變剪接機制參與植物耐旱性的內在機制, 以高表達轉玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)基因(C4)水稻(PC)和受體“Kitaake” (WT)為材料, 通過盆栽和水培試驗, 研究外施可變剪接抑制劑大環(huán)內酯類(pladienolide B, PB)聯(lián)合干旱處理下, 功能葉片的光合參數、總可溶性糖及其組分、主要抗氧化酶活性以及抗氧化物質含量、Ca2+、NO、H2O2、ABA含量、與蔗糖非發(fā)酵1 (sucrose nonfermenting-1, SNF1)相關蛋白激酶(SNF1-related protein kinase 3s, SnRK3s)以及剪接因子基因表達的變化。結果表明: 在盆栽試驗中,與單獨自然干旱處理(drought stress, DS)相比, 在孕穗期外施0.5 μmol L–1PB聯(lián)合干旱處理(DS+PB), 顯著下降了供試水稻的產量及其構成因子的數值, 其中, 在DS+PB處理下, PC的株高、穗數、每穗實粒重和單株產量均顯著高于WT。在水培試驗中, 與10% PEG-6000模擬干旱處理(PEG)相比, 外施0.5 μmol L–1PB和10% PEG-6000模擬干旱處理(PEG+PB), 均顯著降低了供試水稻功能葉片的凈光合速率(n)、相對含水量、總可溶性糖含量、脯氨酸含量、SOD酶活性、POD酶活性、CAT酶活性、PEPC酶活性、糖組分(蔗糖、葡萄糖、果糖含量)、Ca2+、NO和H2O2的含量, 其中, PC中3個糖組分以及鈣離子含量始終高于WT。與PEG處理相比, PEG+PB處理也導致水稻葉片內糖信號基因(和)和3個基因表達量下降, 其中PC的和表達均高于WT; 進一步10 mmol L–1EGTA鈣離子螯合劑引入實驗證明, 鈣離子通過調節(jié)剪接因子相關基因的表達參與水稻干旱響應。相關性分析也表明, PC中鈣離子含量分別與葉片可溶性蛋白含量、ABA含量以及剪接因子的表達水平呈顯著或極顯著相關。綜上, 可變剪接參與水稻干旱響應, 水稻可通過葉內糖信號SnRK1s和SnRK2s基因以及鈣離子, 參與調節(jié)剪接因子相關基因的表達, 對水稻耐旱起積極的作用。與WT相比, PC的增益效果更強, 這與其內源高鈣離子和糖組分含量密切相關。

水稻; 可變剪接; 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶; 大環(huán)內酯; 干旱

水稻作為世界上最重要的糧食作物之一, 是全世界一半以上人口的主糧[1]。近年來高溫和干旱等極端天氣頻發(fā), 水稻受到不利影響而減產[2]。在非生物脅迫中, 干旱是影響全球農業(yè)最重要的環(huán)境因素[3]。然而, 耐旱性是一個復雜的性狀, 涉及一系列生理、形態(tài)、細胞和分子適應途徑, 導致世界范圍內抗旱性遺傳改良的進展緩慢[4-5]。在低濃度CO2、高溫、強光以及干旱等逆境條件下, C4植物具有較高的水分、氮素利用和光合效率以及較高的生物學產量[6]。并已通過基因工程將C4光合基因如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)基因(C4)引入C3植物, 獲得了高表達玉米C4型轉基因作物, 提高了其光合效率和產量[7-10],耐旱性也得到改善[11-15]。與未轉基因的野生型水稻(以下簡稱WT)相比, 高表達玉米C4轉基因水稻(以下簡稱PC)在干旱條件下表現(xiàn)更強的光合優(yōu)勢[11-15]、更多的有效穗數、千粒重以及產量[15,17-18], 因此, 通過增強C3植物的C4光合特性作為一項重要的提高作物耐旱性改良技術途徑, 已被廣泛重視[19]。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)是重要的胞質代謝酶, 也是C4植物和CAM植物光合作用的關鍵酶, 并在非光合組織中發(fā)揮重要的作用[20]。已有研究表明, 磷脂酸[21]、H2O2[17]、NO[22]、鈣離子[15,18]以及ATP[23]等第二信使分子, 均參與調節(jié)了PC水稻C的表達和酶活性的發(fā)揮, 通過調節(jié)氣孔運動, 參與干旱響應, 而且這些調節(jié)過程與其內源糖水平的差異密切相關[24]。與WT相比, PC的內源糖代謝活躍[25]。通過葡萄糖激活糖信號-蔗糖非發(fā)酵1 (sucrosenonfermenting-1, SNF1)相關蛋白激酶(sucrosenonfermenting-1-related protein kinase,SnRKs)家族中SnRK3s家族基因, 并與B類鈣調磷酸酶(calcineurin-B-like,CBL)作用誘導NO參與葉片氣孔調節(jié), 從而增強葉片的保水能力[26]。PC還通過蔗糖參與SnRK2糖信號調節(jié), 增強花青素調節(jié)因子和合成相關基因的表達水平, 增加了花青素代謝以快速響應干旱[27], 綜上, PC存在多種對干旱逆境響應和適應的策略, 但其內在的生理調節(jié)機制還需要深入研究。

表觀遺傳機制調控植物應答外界脅迫是近年來發(fā)現(xiàn)的重要機制之一, 它是DNA序列不改變的前提下, 通過基因轉錄、基因轉錄后以及蛋白翻譯水平上參與植物逆境響應[28], 其中可變剪接(alternative splicing, AS)是一種生物體基因轉錄后調控的表觀遺傳方式[29]。在植物中的許多基因均被發(fā)現(xiàn)存在AS,并廣泛參與對非生物脅迫逆境的轉錄調控, 為植物提供了一條迅速應對環(huán)境變化的有效調控方案[30]。磷酸化蛋白組學研究已鑒定了糖信號SnRK2的底物蛋白包括RNA剪接相關的重要蛋白質[31]?？勺兗艚拥囊种苿┐蟓h(huán)內酯類(pladienolide B, PB)可以模擬非生物脅迫信號, 包括鹽、干旱和脫落酸(abscisic acid, ABA), 激活擬南芥中的非生物脅迫和ABA響應基因和, 并誘導了SnRK2s相關酶基因的表達水平, 通過ABA參與了對擬南芥氣孔孔徑的調節(jié), 抑制擬南芥的可變剪接過程[32]。PC水稻在響應干旱逆境時C4的啟動子有去甲基化現(xiàn)象發(fā)生, 增強了C4的表達[18]。已有證據表明DNA甲基化可調節(jié)可變剪接[33], 那么可變剪接是否參與PC水稻的干旱響應, 這是值得深入研究的一個科學問題。

本研究通過引用可變剪接的抑制劑PB, 聯(lián)合自然干旱和PEG模擬干旱處理, 分別通過盆栽和水培試驗, 在水稻水分敏感時期——孕穗期至齊穗期, 進行自然干旱和PB聯(lián)合處理, 在收獲期考種, 分析可變剪接機制對其產量的影響; 同時, 通過水培實驗, 在四葉一心期, 通過PEG-6000模擬干旱和PB聯(lián)合, 測定其倒二葉的光合參數, 并分析葉片中相對含水量、總可溶性糖及其組分、Ca2+、NO、H2O2、ABA含量、SnRKs亞家族基因、剪接因子基因表達、抗氧化酶以及非酶促的抗氧化分子的變化, 探究可變剪接機制在水稻應對干旱響應的作用。本研究旨在豐富可變剪接機制參與水稻耐旱的內在生理機制, 并為通過表觀遺傳機制改良水稻耐旱性提供新依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用水稻()為高表達玉米C4轉基因水稻(以下簡稱PC), 其由Ku等[7]以日本粳稻Kitaake為受體, 將完整的玉米C4基因導入水稻創(chuàng)制; 未轉基因野生型水稻Kitaake (以下簡稱WT)為對照。選擇連續(xù)種植20代的同年收獲的大小一致、顆粒飽滿的供試種子, 經過75%乙醇消毒15 min, 用清水沖洗5次。然后將種子放入黑暗30°C培養(yǎng)箱中, 浸種催芽3 d后, 待幼苗長到二葉期時, 轉移至國際水稻研究所標準水稻培養(yǎng)營養(yǎng)液[34]中, 置人工氣候箱以30℃/25℃ (晝/夜)、14 h/10 h (光/暗)培養(yǎng)。待秧苗長到四葉一心時, 選擇株型、長勢和葉片均一的植株, 于晴天的傍晚進行處理, 并統(tǒng)一測定生理指標。

1.2 試驗設計

1.2.1 水培試驗處理 參照張金飛等[26]方法, 將植株分為4組, 在晴天的傍晚葉面噴施0.5 μmol L–1PB溶液、0.5 μmol L–1PB +10 mmol L–1EGTA (鈣離子螯合劑)溶液, 以清水噴施作為對照, 處理后轉移到30℃/25℃ (晝/夜)人工氣候箱中先暗處理10 h, 再光照處理2 h, 隨后測定植株處理前倒二葉的光合參數。之后將植株轉移到含有10% PEG-6000培養(yǎng)液中(PEG模擬干旱脅迫, 簡稱PEG處理; 單獨PEG處理, 簡稱PEG; PB噴施聯(lián)合PEG處理, 簡稱PEG+PB; PB和EGTA噴施并聯(lián)合PEG處理, 簡稱PEG+PB+EGTA), 在光照處理2 h后, 再測定植株處理后倒二葉的光合參數。之后取下不同處理的倒二葉, 迅速在?80℃液氮中保存, 用于測定其他生理指標。同時測定處理前后葉片的相對含水量(relative water content, RWC), 在苗期以RWC 作為耐旱性指標。

1.2.2 盆栽試驗處理 于2019年4月25日至9月10日在江蘇省農業(yè)科學院專用網室中進行。盆栽用土為稻田黏壤土, 盆缽隨機區(qū)組排放, 進行常規(guī)水肥和病蟲管理。在孕穗期, 待盆缽土中的水自然落干后, 對水稻葉片噴施0.5 μmol L–1PB溶液, 以噴清水為對照。一組為正常灌溉處理(對照, CK), 另一組自然干旱處理(drought stress, DS)。外源PB處理是在水稻開花前5 d開始處理, 再將如上每個處理隨機分成2組, 水稻植株每5 d噴施0.5 μmol L–1PB溶液1次, 共處理5次, 每株共噴施50 mL溶液(CK+PB和DS+PB處理), 另外2組水稻植株噴施同體積的清水(CK和DS處理)。5次處理結束后, 所有處理均恢復正常灌溉, 開花后50 d收獲, 考察產量及其構成因子, 以單株產量作為耐旱性指標。

1.3 測定方法

1.3.1 光合參數 參照Li等[21]方法, 使用LI-6400 (Li-Cor, Lincoln, NE, USA)便攜式光合作用測定系統(tǒng), 采用紅藍光源葉室(LI-6400-40), 設置光量子通量密度(photosynthetic photon quanta flux density, PPFD) 1000 μmol m–2s–1, 流速500 μmol s–1。室外溫度28~30℃, 相對濕度68%~79%, CO2濃度為(390.0±10.5) μmol mol-1, 上午9:00—10:00, 選取水稻倒二葉測定凈光合速率(net photosynthesis rate,n)、氣孔導度(stomatal conductance,s)和胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration,i)等, 通過CE=n/i, 計算出羧化效率(carboxylation efficiency,CE)。每個處理測定5張葉片, 室外進行, 每個處理5次重復。

1.3.2 相對含水量的測定 參照Smart等[35]的方法測定。

1.3.3 可溶性總糖、糖組分以及可溶性蛋白 參考蒽酮比色法[36]測定植株葉片可溶性總糖; 參照文獻中方法[37]測定蔗糖、葡萄糖和果糖; 參照考馬斯亮藍G-250法[38]測定可溶性蛋白。

1.3.4 抗氧化酶活性及其抗氧化物質 總SOD活性測定根據Giannopolitis等[39]方法測定; POD活性根據Smith等[40]方法測定; CAT活性根據Havir等[41]方法測定; 脯氨酸含量參考Walter等[42]方法測定; 谷胱甘肽參照Wang等[43]方法測定; 抗壞血酸參照Doulis等[44]方法測定。

1.3.5 Ca2+、NO、H2O2和ABA含量測定 葉片總Ca2+含量參照Yang等[45]方法測定; NO參照Murphy與Noack[46]方法測定; H2O2參照Ren等[17]方法測定; ABA含量的測定參照Xiong等[47]方法測定。

1.3.6 總RNA提取和qRT-PCR 總RNA的提取和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)參照Jung等[48]方法制備, 參考Chen等[22]方法反轉錄, Real-time PCR采用TB Green Premix ExTliRNaseH Plus試劑盒進行。qRT-PCR反應條件為95℃ 10 min; 94℃ 30 s, 58℃ 40 s和68℃各1 min, 共32次循環(huán), 重復3次。采用Primer 3設計引物, 以水稻組成性表達的基因作為內部參照, 引物序列見表1, 所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.4 統(tǒng)計與分析方法

使用SPSS 25.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析, 采用TB tool軟件對數據進行作圖及相關性分析, 使用2-ΔΔCt方法分析qRT-PCR數據。

表1 qRT-PCR的基因和引物

Act: 肌動蛋白; SnRK: 蔗糖非發(fā)酵相關蛋白激酶;: SnRK1s亞家族基因;: SnRK2s亞家族基因; C4: C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因;: C3型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因;: 絲氨酸/精氨酸富集蛋白基因。

Act: actin; SnRK: sucrose nonfermenting-1-related protein kinase;: gene of SnRK1s;: gene of SnRK2s; C4-: the gene of C4phosphoenolpyruvate carboxylase;: the gene of C3phosphoenolpyruvate carboxylase;: genes of serine/arginine-rich protein.

CK: 正常灌溉和葉面噴施清水; CK+PB: 正常灌溉和葉面噴施0.5 μmol L–1PB溶液; DS: 干旱脅迫+葉面噴施清水; DS+PB: 干旱脅迫+葉面噴施0.5 μmol L–1PB溶液。不同的小寫字母表示在5%水平差異顯著, 每個參數下面的百分比是同一個株系處理數據和清水對照(CK)比值的百分數。

CK: irrigation and leaf spray application of water; CK+PB: irrigation and leaf spray application of 0.5 μmol L–1PB; DS: drought stress and leaf spray application of water; DS+PB: drought stress and leaf spray application of 0.5 μmol L–1PB. Values followed by different lowercase letters are significantly different at the 5% probability level. Values below each parameter are the percentage of the ratio between the treated data and that of the water control (CK) in the same line in rice.

2 結果與分析

2.1 孕穗期干旱脅迫下噴施PB對水稻產量及其構成因子的影響

如表2所示, 與CK相比, 單獨PB處理, 對水稻產量構成因子沒有產生顯著影響; 但與CK相比, 在單獨自然干旱(DS)處理下, 供試材料的產量構成因子均降低, 但PC的株高(79.03 cm/90.14%)、穗長(11.04 cm/82.70%)、每穗實粒數(24.58個/73.42%)、千粒重(23.38 g/90.83%)以及單株產量(2.83 g/ 68.52%)的下降程度均小于WT (株高: 72.35 cm/82.80%; 穗長: 10.75 cm/92.12%; 每穗實粒數: 21.38個/68.88%; 千粒重: 20.74 g/81.89%; 單株產量: 2.06 g/53.93%)。而與DS處理相比, DS+PB處理使供試材料產量構成因子的降低得更多, PC主要產量構成因子的下降程度小于WT, 如PC的千粒重 (19.95 g/77.51%)、干物質重(葉: 2.45 g/65.16%和穗: 2.47 g/36.48%)以及單株產量(2.54 g/61.50%)均顯著高WT的(千粒重: 17.87 g/70.63%; 葉重: 2.03 g/57.02%; 穗重: 2.14 g/34.57%; 單株產量: 1.71 g/44.76%), 提示增強可變剪接水平可顯著緩解孕穗期干旱脅迫對水稻產量造成的損失, 而且對PC的效果更顯著。

2.2 噴施PB聯(lián)合10%PEG-6000模擬干旱脅迫對水稻葉片光合參數的影響

如表3所示, 與CK相比, 在PEG模擬干旱處理下, PC和WT的凈光合速率(n)、氣孔導度(s)、胞間CO2濃度(i)、蒸騰速率(r)和羧化效率(CE)均降低, 但該處理下PC的n(16.73 μmol CO2m–2s–1/83.03%)、s(0.45 mol m–2s–1/61.64%)、i(345.18 μmol mol–1/94.26%)和CE(0.048 mol m–2s–1/76.19%)始終高于WT (n: 13.46 μmol CO2m–2s–1/73.87%;s: 0.33 mol m–2s–1/44.00%;i: 343.04 μmol mol–1/92.97%; CE: 0.039 mol m–2s–1/76.47%); 與PEG處理相比, PEG+PB處理進一步加重了干旱對水稻的n(PC: 15.60 μmol CO2m–2s–1/77.46%; WT: 10.68 μmol CO2m–2s–1/58.62%)的抑制, 但是s、i和r則差異不顯著, WT的CE(0.032 mol m–2s–1/62.75%)與其n的變化類似, 顯著低于其PEG處理的, 而PC (CE: 0.046 mol m–2s–1/73.01%)的則與其PEG處理的沒有顯著差異。值得關注的是, 在PEG+PB處理下, PC的n、s和CE始終高于同樣處理下WT, 說明外施PB顯著地加重了干旱脅迫導致的水稻光合能力下降, 反證增強可變剪接水平可以緩解干旱脅迫導致的水稻光合能力下降, 尤其對PC有益。

CK: 培養(yǎng)液和葉面噴施清水; PEG: 10% PEG培養(yǎng)液和葉面噴施清水; PEG+PB: 10% PEG水稻培養(yǎng)液和葉面噴施0.5 μmol L–1PB溶液。不同的小寫字母表示在5%水平差異顯著。每個參數下面的百分比與表2的一致。

CK: rice culture solution and leaf spray application of water; PEG: 10% PEG rice culture solution and leaf spray application of water; PEG+PB: 10% PEG rice culture solution and leaf spray application of 0.5 μmol L–1PB. Values labeled with different lowercase letters are significantly different at the 5% probability level. The percentages below each parameter are consistent with those in Table 2.

2.3 噴施PB聯(lián)合10% PEG-6000模擬干旱脅迫對水稻葉片相對含水量、滲透調節(jié)物質含量、抗氧化酶活性以及PEPC酶活性的影響

由表4看出, 與CK相比, PEG處理顯著降低了PC和WT葉片的相對含水量和可溶性蛋白, 而滲透調節(jié)物質可溶性總糖和脯氨酸的含量則誘導增加; 而與PEG處理相比, PEG+PB的4個參數均顯著下降, 并且在PEG和PEG+PB處理下, PC的相對含水量、可溶性蛋白、可溶性總糖以及脯氨酸含量都顯著高于WT。不同處理下水稻葉片超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化物酶(peroxidase, POD)和過氧化氫酶(catalase, CAT)活性也發(fā)生了變化。同樣地, PEG處理下PC和WT葉片SOD和POD活性均上升; PEG+PB處理下PC和WT的SOD、POD和CAT酶活性均下降; 另外, PEG處理下PC和WT的抗氧化物質抗壞血酸(ascorbic acid, AsA)含量均上升; 而PEG+PB處理則下降了AsA和谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量下降, 同步地, PEPC酶活性也顯示了與可溶性總糖等滲透調節(jié)物質類似的變化, 說明PC因C4-的導入使其耐旱性更強,表現(xiàn)為滲透調節(jié)物質積累和抗氧化防護能力的增強, 而且與可變剪接水平有關。

2.4 噴施PB聯(lián)合10% PEG-6000模擬干旱脅迫對水稻葉片可溶性糖組分以及Ca2+、NO、H2O2含量的影響

由表5可知, 與CK相比, 單獨PEG處理顯著提高了PC的蔗糖和葡萄糖含量, 而PEG+PB則顯著下降了2個供試材料的蔗糖和葡萄糖含量; 而果糖含量則不論是PEG處理還是PEG+PB處理均導致其含量下降。值得注意的是, PEG+PB處理下, PC的3個糖組分含量始終高于WT; 與CK相比, 單獨PEG處理上調了水稻葉片內的鈣離子濃度水平, 而PEG+PB處理則下調了其含量, 且PC始終高于WT, 它的變化趨勢與糖組分含量的變化一致; 單獨PEG處理則下調2個供試材料的NO含量, 而且PEG+PB處理則進一步下調, 但是2個供試材料的變化則沒有差異; 與CK相比, PEG處理只上調了WT的H2O2含量, 而對PC則不影響。與PEG處理相比, PEG+PB處理也同時下調了H2O2含量, 但是2個材料則無顯著差異。看來, 可變剪接機制參與了水稻干旱響應, 其中PC和WT的差異可能與蔗糖、葡萄糖和鈣離子含量等信號關系更大。

表4 不同處理對水稻葉片相對含水量、滲透調節(jié)物質、抗氧化酶活性以及PEPC酶活性的影響

CK、PEG和PEG+PB處理與表3的相同。不同小寫字母表示在5%水平差異顯著, 每個參數下面的百分比與表2的一致。

CK, PEG, and PEG+PB treatments are the same as those in Table 3. Different lowercase letters indicate significant differences at the 5% probability level. The percentages below each parameter are consistent with those in Table 2.

2.5 噴施PB和EGTA聯(lián)合10% PEG-6000模擬干旱脅迫對水稻葉片相對含水量、PEPC、SnRK2s和SnRK1s相關基因表達的影響

由于PB施用, 我們觀察到了水稻葉片內鈣離子的差異, 推測鈣離子作為信號在可變剪接機制響應水稻干旱中可能起到積極的作用。為了驗證這一假設, 本研究選用了鈣離子的鏊合劑EGTA, 由表6可知, 葉片相對含水量在PEG、PEG+PB、PEG+PB+EGTA處理后逐漸降低, 其中PC相對含水量始終高于WT, 可知鈣離子的確對水稻干旱條件下的保水能力起正效應, 但PC的效果仍大于WT。與此同時, PEG+PB處理后, 供試材料ABA含量降低, 但在PEG+PB+EGTA處理后, 與PEG+PB處理相比, 2個供試材料的ABA含量又升高, 且PC的高于WT, 推測, 鈣離子受抑后, PC內ABA的誘導增強可能對其耐旱性有益。PC既包括內源的C3型PEPC基因(), 也包括外源導入的玉米C4-基因。與CK相比, PEG處理上調PC中C4表達量, 而PEG+PB下調PC中C4表達量, 而PEG+PB+EGTA處理下PC中C4-表達水平與PEG+PB處理下無差異; 與CK相比, PEG處理上調了水稻內源表達水平; PEG+PB處理下調表達量; PEG+PB+ EGTA處理上調了供試材料表達水平, 表明鈣離子正調節(jié)可變剪接機制響應水稻干旱, 影響外源導入C4表達量; 而當水稻內源的鈣離子被鏊合后, ABA含量顯著增加, 有利于誘導水稻內源表達水平的增加, 且PC的誘導程度顯著大于WT。

表5 不同處理對水稻葉片蔗糖、葡萄糖、果糖、鈣離子、NO和H2O2含量的影響

CK、PEG和PEG+PB處理與表3的相同。不同小寫字母表示在5%水平上差異顯著, 每個參數下面的百分比與表2的一致。

CK, DS, and DS+PB treatments are the same as those in Table 3. Values labeled with different letters are significantly different at the 5% probability level, the percentages below each parameter are consistent with those in Table 2.

進一步研究結果觀察到, 與CK相比, PEG處理下PC和WT的和表達量升高; PEG+PB處理下均導致3個水稻的SnRK2表達量下降, 可見, 可變剪接對水稻的干旱響應起正效應, 其中PC的、和表達量顯著高于WT; PEG+PB+EGTA處理進一步降低了供試水稻的3個基因表達量, 但是2個供試材料的基因表達水平變化不一致, 其中PC中和仍高于WT, 但是則相反; 與CK相比, PEG處理下PC和WT的、和表達量升高; 與CK相比, PEG+PB處理下則均導致其基因表達量下降, 其中PC的和表達量均高于WT。而PEG+PB+EGTA處理后水稻的和表達量均低于PEG+PB處理, 表明鈣離子也在可變剪接機制中通過能量代謝參與水稻干旱響應調節(jié), 其中PC的作用仍高于WT, 可見, 鈣離子可通過糖信號SnRK1和SnRK2家族相關基因的表達水平, 參與水稻干旱響應中的可變剪接過程, 其中PC相關表達基因的表達水平與WT存在差異。

2.6 噴施PB和EGTA聯(lián)合10% PEG-6000模擬干旱脅迫對水稻葉片剪接因子相關基因表達的影響

表7所示, 與對照CK相比, 單獨PEG處理下PC和WT的剪切因子相關基因和均表達增加, 且PC高于WT。與對照CK相比, PEG+PB處理下PC和WT的和表達量升高, 且PC高于WT。與對照CK相比, PEG+ PB+ EGTA處理下表達水平降低, 且PC下降程度小于WT。PB抑制了部分剪接因子基因的表達量, 而誘導了另外一部分剪接因子基因表達量的增加。值得關注的是, 進一步加入鈣離子螯合劑(EGTA), 即PEG+PB+EGTA處理則誘導了水稻和表達水平的增加, 這些基因的表達水平在PEG+PB處理下則是被抑制的, 說明鈣離子也參與了干旱脅迫下剪接因子基因表達水平的調節(jié)。

表6 不同處理對水稻葉片ABA含量、相對含水量、PEPC以及SnRKs相關基因表達量的影響

CK、PEG和PEG+PB處理與表3的相同。PEG+PB+EGTA: 10% PEG水稻培養(yǎng)液, 并同時葉面噴施0.5 μmol L–1PB和10 mmol L–1EGTA溶液。WT中沒有外源導入的玉米C4-的表達。不同小寫字母表示在5%水平差異顯著.

CK, PEG, and PEG+PB treatments are the same as those in Table 3. DS+PB+EGTA: 10% PEG rice culture solution treatment with leaf spraying both 0.5 μmol L–1PB and 10 mmol L–1EGTA solutions. There is no exogenous expression of C4in WT. Different lowercase letters indicate significant differences at the 5% probability level.

CK、PEG、PEG+PB和PEG+PB+EGTA處理與表6的相同。不同字母表示在5%水平差異顯著。

CK, PEG, PEG+PB, and DS+PB+EGTA treatments are the same as those in Table 6. Different lowercase letters indicate significant differences at the 5% probability level.

2.7 噴施PB聯(lián)合干旱脅迫下PC和WT的各個指標的相關性

由圖1-A可知PC各指標存在相關性, 可溶性蛋白分別與Ca2+含量呈極顯著相關, 與基因表達呈顯著相關, Glu與顯著相關, Ca2+分別與ABA和顯著相關, ABA與顯著相關, C4與顯著相關,與顯著相關,與極顯著相關。在圖1B中, WT的Su與顯著相關, Glu與顯著相關,與顯著相關,與顯著相關。

A: PC各指標相關性; B: WT各指標相關性。*< 0.05;**< 0.01。RWC: 相對含水量; Su: 可溶性糖; Sp: 可溶性蛋白; Suc: 蔗糖; Glu: 葡萄糖; Fru: 果糖。

A: relevance in PC; B: relevance in WT.*< 0.05;**< 0.01. RWC: relative water content; Su: soluble sugar content; Sp: soluble protein content; Suc: sucrose content; Glu: glucose content; Fru: fructose content.

3 討論

在干旱脅迫下, 與C3植物相比, C4植物表現(xiàn)出較高的凈光合速率和產量[49]。PC水稻不僅光合效率提高, 而且具有多重非生物脅迫的耐性[50], 尤其是耐旱性顯著改善[11-15]。本文通過施用可變剪接的抑制劑PB觀察到, 可變剪接過程在水稻干旱逆境響應和適應機制中發(fā)揮了積極的作用, 其中PC的效應大于WT, 這與PC株系內源較高的鈣離子和糖組分含量密切相關, 即PC水稻通過鈣離子調節(jié)部分剪接因子基因的表達量, 增強植株葉片的保水能力、光合能力和氧化防護能力, 維持產量穩(wěn)定, 從而表現(xiàn)更強的耐旱性。

糖作為信號分子參與了植物對非生物脅迫的響應, 其中SnRK作為聯(lián)系糖和非生物逆境的樞紐而發(fā)揮重要的作用[51]。植物SnRK家族基因根據結構不同,可以分為3個亞家族, 分別為SnRK1、SnRK2和SnRK3[52]。擬南芥剪接因子功能喪失突變體含有更高的能量感應水平, 通過自身的AS, 調節(jié)SnRK1感受糖信號; 與此同時, SR45還可調節(jié)擬南芥一個肌醇多磷酸-5-磷酸酶(myoinositolpolyphosphate 5-phoshatase, 5PTase13)基因()的AS, 通過與SnRK1相互作用以穩(wěn)定SnRK1的蛋白, 從而增強了SR45的葡萄糖超敏性,建立了SR45與糖信號感受器 / 能量傳感器SnRK1降解調節(jié)之間的機制聯(lián)系[53]。本研究也觀察到在干旱脅迫下, 水稻葉片內葡萄糖含量增加, 伴隨SnRK1基因表達量增加, 而且PC的誘導能力大于WT。ABA與其受體PYR/PLY/RCAR結合, 再與PP2C作用形成復合物, 可解除PP2C對SnRK2激酶活性的抑制作用, 活性形式的SnRK2磷酸化AREB/ABF、離子通道蛋白和NADPH氧化酶等下游底物, 進而誘導ABA響應基因的表達[54]。PB處理就是通過抑制PP2C磷酸酶的剪接來激活ABA信號轉導途徑, 同時仍然在一定程度上維持ABA激活的SnRK2激酶活性[32]。本研究觀察到PB影響了干旱處理下水稻SnRK1s和SnRK2s基因的表達, 如SnRK1s相關基因和SnRK2s相關基因表達降低, 且對PC的作用更明顯?？梢? 水稻糖信號SnRKs基因的表達差異, 可能是可變剪接過程對其干旱逆境的響應表現(xiàn)差異的內在因素。

在植物中, Ca2+是第二信使, 廣泛參與脅迫反應,快速反應不斷變化的環(huán)境來靈活適應植物的生長發(fā)育, 為固著生物提供了一條不可缺少的快速反應和適應機制[55]。胞外Ca2+通過鈣感受體(calcium-sensing receptor, CAS)信號通路, 誘導保衛(wèi)細胞H2O2和NO積累, 激活胞內Ca2+瞬時增加, 最終引起氣孔關閉[31]。與未轉基因水稻相比, PC水稻Ca2+緩沖能力強, PC含有比野生型水稻更多的游離Ca2+ [21]。外源施入鈣離子試驗和抑制劑試驗均表明內源鈣離子通過調節(jié)PEPC酶活性和基因表達而參與PC干旱逆境響應[56,18]。并且Ca2+參與了NO調控PEPC酶活性和基因表達量, 促進PC光合作用的提高[22]。本研究的PB聯(lián)合干旱處理, 顯著降低剪接因子基因、和表達量, 仍未消除2個供試水稻材料內源鈣離子含量的差異, 其中PC仍具有較高的鈣離子含量, 且部分剪接因子的基因表達水平也較高。鈣離子螯合劑的藥理實驗進一步驗證, PC的內源鈣離子含量的降低的確下調了部分剪接因子基因的表達, 但是同時誘導了內源ABA含量的增加。通常干旱脅迫是通過Ca2+誘導ABA生物合成[57], 值得關注的是, 本研究觀察到PC則在抑制了鈣離子之后誘導了ABA的含量增加。推測, ABA在鈣離子被抑制后作為補償機制, 參與PC對干旱的響應, 相關假設尚需要進一步研究驗證。

植物可通過剪接因子或者轉錄因子發(fā)生AS響應干旱脅迫, 獲得了對環(huán)境脅迫的耐受性[58], 為植物提供了一條迅速應對環(huán)境變化的有效調控方案[59]。其中剪接因子是一種反式作用因子, 它們能識別或結合一些在內含子或外顯子上的剪接增強子或剪接抑制子順式作用元件, 導致選擇不同的剪接位點, 以產生不同的剪接模式[60]。精氨酸/絲氨酸豐富蛋白家族(arginine/serine-rich proteins, SR proteins)是真核生物中的一類剪接因子, 在前體mRNA的組成性和選擇性剪接中起作用[61]。根據其結構特點分成6個不同亞家族, 即: SR、RSZ、SC、SCL、RS2Z及RS家族[62]。其中SCL和RS2Z亞家族相關基因已觀察到在植物響應多種非生物脅迫條件下表達水平及剪接方式發(fā)生明顯變化[63]。研究發(fā)現(xiàn)剪接因子的上游區(qū)域均有ABA的順式響應元件, 對ABA有顯著反應, 并明確了剪接因子SR34、SR34b、SCL30a、SCL28、SCL33、RS40、SR45和SR45a, 均是參與ABA介導應激反應的潛在候選者[64]。本研究觀察到可變剪接抑制劑也顯著降低了與ABA相關的SnRK2基因表達, 當水稻葉片中游離鈣離子減少可誘導葉內ABA含量部分恢復, 其中PC的含量顯著高于WT, 并伴隨糖信號基因表達的恢復, 幫助PC維持其剪接因子相關基因的表達水平, 參與ABA介導應激反應。在水稻對干旱的響應過程中, PC通過內源鈣離子以及ABA的補償機制參與調節(jié)可變剪接過程的內在生理機制還需深入研究。

磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的磷酸化在控制高等植物的中樞代謝中起重要作用, 它參與了干旱脅迫下C4植物保持高光合作用、氮素和水分利用效率的機制[65]。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶激酶(phosphoenolpyruvate carboxylase kinases, PPCK)在PEPC磷酸化過程中起關鍵作用。在番茄中鑒定了2種PPCK基因, 即1和, 其中是由于可變剪接保留了第二內含子的轉錄本, 并只在果實成熟期表達顯著增加, 而在成熟后子房和種子僅包含正確剪接的, 從而參與了PEPC酶的磷酸化過程, 而且這種組織特異性調節(jié)也在馬鈴薯、茄子和煙草中觀察到, 而且剪接的內含子序列在所報告的4個物種間高度保守[67]。前期研究已經觀察到, 在干旱條件下, PC中的PPCK酶活性及其基因(和)均誘導增強, 而且與信號分子鈣離子、NO和H2O2的調節(jié)有關[18]。本研究觀察到PB聯(lián)合干旱處理, 降低了PC內源和外源導入C-PEPC的表達水平, 鈣離子鏊合劑聯(lián)合PB和PEG處理, 加劇了PC的C-PEPC表達水平和酶活性的抑制, 而誘導了其內源表達水平的提高, 提示外源導入C4, 增加PC中PEPC基因的多樣性, 有利于Ca2+調節(jié)PEPC基因和酶活性, 保持葉片水分含量, 維持光合能力穩(wěn)定, 增強氧化防護能力, 表現(xiàn)耐旱。是否不同類型的PEPC基因在水稻響應干旱脅迫中能夠發(fā)生自身的可變剪接, 還需深入研究。

綜上, 可變剪接機制參與水稻干旱耐性, 并起積極的作用。外施PB聯(lián)合干旱處理實驗表明: 水稻可通過糖信號SnRK1s、SnRK2s基因以及鈣離子, 參與調節(jié)剪接因子相關基因的表達水平而響應干旱。與WT相比, PC的增益效果更強, 且與PC內源高鈣和糖含量密切相關。本研究的結果將為今后進一步從可變剪接機制研究PC的耐旱生理機制提供新思路, 從而豐富表觀遺傳機制參與水稻干旱耐性調節(jié)機理的信息。未來, 通過調節(jié)可變剪接的水平將可作為改良水稻耐旱性的一條新策略。

4 結論

可變剪接參與水稻干旱響應, 水稻可通過糖信號SnRK2s和SnRK3s基因以及鈣離子, 參與調節(jié)剪接因子相關基因的表達水平, 對水稻耐旱起積極的作用。與WT相比, PC的增益效果更強, 與其內源高鈣離子含量和糖信號的差異表現(xiàn)密切相關。

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Effects on drought tolerance by pladienolide B and rice with high expression of C4-

SONG Ni-Xi1,2, LI Xia1,2,3,*, WANG Jin1,2, WU Bo-Han1,4, CAO Yue1,5, YANG Jie1,3, and XIE Yin-Feng2

1Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Jiangsu High Quality Rice Engineering Technology Research Center, Nanjing Branch of National Center for Rice Improvement, Nanjing 210014, Jiangsu, China;2College of Biology and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, Jiangsu, China;3Collaborative Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops of Jiangsu Province, Yangzhou 225009, Jiangsu, China;4School of the Environment and Safety Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, Jiangsu, China;5School of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China

To investigate the intrinsic mechanism of alternative splicing (AS) participated in drought tolerance in plants, the effects of macrolides pladienolide B (PB, one of the AS inhibitors) were studied using the phosphoenolpyruvate carboxylase (C4-) rice (PC) and “Kitaake” (WT) rice lines in pot experiments and hydroponics experiments, respectively. The changes of photosynthetic parameters, total soluble sugar and sugar components contents, some main antioxidant enzyme activities and antioxidant contents, Ca2+, NO, H2O2, ABA contents, transcript levels of sucrose nonfermenting-1 (SNF1)-related protein kinases (SnRKs), arginine/serine-rich proteins (SR proteins), and PEPC both in C4and C3type of the functional leaves in rice lines were measured. Agronomic traits of the WT and PC were recorded in the mature period. In pot experiment, compared with the natural drought treatment alone, the treatment of 0.5 μmol L–1PB with drought at booting stage had a significant decline on agronomic traits of the tested rice. Among them, plant height, panicle number per plant, filled grain number per panicle, and grain yield per plant in PC were significantly higher than those of WT. In the hydroponics experiment with 0.5 μmol L–1PB combined with 10% mmol L–1polyethylene glycol 6000 (PEG-6000) to simulate drought stress, compared with PEG treatment, net photosynthetic rate, relative water content, total soluble sugar content, proline content, SOD activity, POD activity, CAT activity, and PEPC activity were significantly increased in PC than those of WT. Similarly, the contents of sucrose, glucose, fructose, and Ca2+of leaves in PC lines were significantly higher than those of WT. It was noteworthy that the relative gene expression levels of C4,, SnRK2s (and), SnRK1s (,, and), and SR proteins (,,,, and) under PEG+PB treatment were significantly lower than those under PEG treatment. It was further verified by using 10 mmol L–1EGTA experiments [Ethylene glycolbis (aminoethylether)-tetra-acetic acid, a chelate solution of calcium ions] that Ca2+were involved in the drought response by regulating the transcript levels of SR proteins genes in rice. In addition, the Ca2+content in PC lines was significantly correlated with soluble protein content, ABA content, andtranscript level, respectively. In conclusion, AS participated in drought response by regulating the expression of SR related genes through sugar signal both SnRK1s and SnRK2s, and calcium ion as well, which played a positive role in drought tolerance in rice. Compared with WT, PC had a stronger positive effect, which was closely related to its high endogenous Ca2+content and the contents of sucrose, glucose, fructose.

rice; alternative splicing; phosphate phosphoenolpyruvate carboxylase; macrolides pladienolide B; drought

10.3724/SP.J.1006.2021.03064

本研究由國家自然科學基金項目(31571585)和國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0300501-03)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31571585) and the National Key Research and Development Program of China (2016YFD0300501-03).

李霞, E-mail: jspplx@jaas.ac.cn

362600124@qq.com

2020-10-25;

2021-03-19;

2021-04-08.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210408.0929.002.html