楊洋，梅勝，辛龍

骨關(guān)節(jié)炎是最常見的老年慢性疾病之一，隨著社會老齡化的加劇和肥胖率的上升，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率逐年提高，已經(jīng)給我國帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會負(fù)擔(dān)[1]。晚期骨關(guān)節(jié)炎患者可以進(jìn)行關(guān)節(jié)置換手術(shù)治療，然而，由于關(guān)節(jié)置換術(shù)后的功能恢復(fù)可能較差，并且假體有一定的壽命限制[2]，因此更多研究的重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到骨關(guān)節(jié)炎的預(yù)防和早期治療。目前有研究提出了骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的發(fā)病因素，比如遺傳性、衰老、肥胖等，但是骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)理仍不明確[3]。研究表明，細(xì)胞焦亡在骨關(guān)節(jié)炎的病理過程中發(fā)揮著不可忽視的作用[4]。因此，通過藥物抑制細(xì)胞焦亡可能是一種潛在的治療骨關(guān)節(jié)炎方法。我國中醫(yī)藥是治療骨關(guān)節(jié)炎的傳統(tǒng)手段，具有不良反應(yīng)小、藥效緩及多靶向整體作用等優(yōu)勢[5]，為骨關(guān)節(jié)炎現(xiàn)代臨床的藥物治療提供了新的思路。桂枝附子湯是《傷寒路》中的經(jīng)典方劑，臨床常用于骨關(guān)節(jié)炎的治療，但其具體作用機(jī)制尚不明確[6]。因此，本研究通過探究桂枝附子湯調(diào)控TXNIP/NLRP3/caspase-1通路抑制軟骨細(xì)胞細(xì)胞焦亡的作用機(jī)制，以期為桂枝附子湯治療骨關(guān)節(jié)炎的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 試劑 桂枝附子湯由浙江省立同德醫(yī)院提供；軟骨細(xì)胞由浙江省骨骼肌肉退變與再生修復(fù)轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；DMEM/高糖培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自德國Serana公司；MTT試劑盒購自上海MCE公司；LDH試劑盒、Hoechst/PI染色購武漢巴菲爾生物科技有限公司；TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1和-actin購自上海abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 桂枝附子湯制備與質(zhì)控 桂枝附子湯由桂枝12 g、附子15 g、生姜9 g、紅棗12枚及甘草6 g組成，全方水煎，濃縮去渣。以HPLC制備全方指紋圖譜，分別用各味藥對照品進(jìn)行定性定量分析，建立質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 軟骨細(xì)胞培養(yǎng) 軟骨細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素的DMEM/高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，并置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 MTT檢測細(xì)胞活性 取5×104的細(xì)胞接種至96孔板中，分別用0、10、20、50、100及200mol/L濃度的桂枝附子湯干預(yù)軟骨細(xì)胞48h。每孔加入5mg/ml MTT溶液20l，避光培養(yǎng)4 h；棄上清，每孔加入150l DMSO溶液，震蕩10 min，自動酶標(biāo)讀數(shù)儀比色，測定其吸光值（波長490 nm），計算各組軟骨細(xì)胞活性。以未進(jìn)行干預(yù)的軟骨細(xì)胞為對照組，使用不同濃度枝附子湯溶液干預(yù)的軟骨細(xì)胞為試驗(yàn)組。細(xì)胞活性（%）＝實(shí)驗(yàn)組吸光值/對照組吸光度均值×100%。

1.2.4 OGD/R模型建立軟骨細(xì)胞 用Earle's平衡鹽溶液培養(yǎng)，置于37℃，1%O2、5%CO2和94%N2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，然后用DMEM/高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.5 細(xì)胞分組 將軟骨細(xì)胞分為對照組、OGD/R組、低劑量桂枝附子湯組（10mol/L）、高劑量桂枝附子湯組（100mol/L）進(jìn)行研究分組。

1.2.6 微量酶標(biāo)法檢測軟骨細(xì)胞LDH釋放量 各組軟骨細(xì)胞接種于96孔板，進(jìn)行相應(yīng)干預(yù)后。加入60l LDH檢測液混勻，在避光條件下?lián)u床孵育30 min。將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)1 600 r/min離心5 min。分別取各孔的上清液120l，加入到新的96孔板相應(yīng)孔中，酶標(biāo)儀檢測各孔的吸光度（波長490 nm）。分別測定OGD/R組、低劑量桂枝附子湯組、高劑量桂枝附子湯組軟骨細(xì)胞LDH相對釋放量。LDH釋放量=實(shí)驗(yàn)組吸光值/對照組吸光度均值。

1.2.7 Hoechst33342/PI染色法檢測軟骨細(xì)胞細(xì)胞焦亡 將細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，分別對各組細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。PBS洗滌3次，將Hoechst33342溶液、PI溶液和細(xì)胞染色緩沖液以1∶1∶200比例混勻形成工作液，每孔加入1 ml工作液，4°C避光反應(yīng)30 min，PBS洗滌3次后熒光顯微鏡下觀察各組軟骨細(xì)胞焦亡情況。

1.2.8 RT-PCR檢測軟骨細(xì)胞mRNA表達(dá) 按Trizol試劑盒說明書進(jìn)行，在20l反應(yīng)體積中進(jìn)行。42℃固定浴60 min，99℃固定浴5 min，－20℃保存?zhèn)溆?。引物擴(kuò)增設(shè)計：根據(jù)Genebank序列，設(shè)計各個引物序列并合成，引物序列見表1。使用SYRB Premix ExTaqTM和ABI 7900擴(kuò)增儀進(jìn)行熒光擴(kuò)增；分析計算CT值，檢測各組軟骨細(xì)胞TXNIP、NLRP3、caspase-1和IL-1 mRNA的表達(dá)水平。

表1 PCR引物序列

1.2.9 Western Blotting法檢測軟骨細(xì)胞蛋白表達(dá)提取軟骨細(xì)胞蛋白，用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜。在TBS-T液內(nèi)清洗，加5%脫脂奶粉，37℃封閉1h。封閉結(jié)束后，用TBS-T稀釋3次，并置于TBS-T 4℃震蕩過夜。TBS-T液漂洗PVDF膜3次，將膜與TBS-T稀釋二抗孵育，室溫下振蕩1h；TBST漂洗PVDF膜3次，隨后顯影、定影，用圖像分析系統(tǒng)測定蛋白條帶的光密度，進(jìn)行定量分析TXNIP、NLRP3、caspase-1和IL-1蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度桂枝附子湯對軟骨細(xì)胞活性的影響10、20、50及100mol/L桂枝附子湯處理后，軟骨細(xì)胞活性較0mol/L差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），200mol/L桂枝附子湯能明顯降低軟骨細(xì)胞活性（P＜0.05）。見表2。

表2 不同濃度桂枝附子湯對軟骨細(xì)胞活性的影響

2.2 桂枝附子湯降低軟骨細(xì)胞LDH釋放量 OGD/R組軟骨細(xì)胞LDH釋放量較對照組顯著升高（P＜0.05），而低劑量桂枝附子湯組和高劑量桂枝附子湯組軟骨細(xì)胞的LDH釋放量較OGD/R組均明顯降低（均P＜0.05）。見表3。

表3 桂枝附子湯對軟骨細(xì)胞LDH釋放量的影響

2.3 桂枝附子湯降低PI陽性軟骨細(xì)胞數(shù)量 與對照組相比，OGD/R組PI陽性軟骨細(xì)胞數(shù)明顯上升（P＜0.05），而經(jīng)不同濃度桂枝附子湯處理后，PI陽性軟骨細(xì)胞數(shù)較OGD/R組顯著降低（P＜0.05）。見封二彩圖1和表4。

表4 桂枝附子湯對軟骨細(xì)胞細(xì)胞焦亡的影響

2.4 桂枝附子湯抑制TXNIP、NLRP3、caspase-1和IL-1 mRNA的表達(dá) 與對照組相比，OGD/R組軟骨細(xì)胞TXNIP、NLRP3、caspase-1和IL-1 mRNA表達(dá)顯著升高（均P＜0.05）；而低劑量桂枝附子湯組和高劑量桂枝附子湯組軟骨細(xì)胞TXNIP、NLRP3、caspase-1和IL-1 mRNA表達(dá)較OGD/R組顯著降低（均P＜0.05）。見表5。

表5 桂枝附子湯對軟骨細(xì)胞mRNA表達(dá)的影響

2.5 桂枝附子湯抑制TXNIP、NLRP3、caspase-1和IL-1蛋白水平的表達(dá) 與對照組相比，OGD/R組軟骨細(xì)胞TXNIP、NLRP3、caspase-1和IL-1蛋白表達(dá)顯著升高（均P＜0.05）；而經(jīng)不同濃度桂枝附子湯處理后，TXNIP、NLRP3、caspase-1和IL-1蛋白表達(dá)明顯降低（均P＜0.05）。見封二彩圖2、表6。

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎一種常見的高致殘率、低治愈率的慢性關(guān)節(jié)疾病，主要病變是關(guān)節(jié)軟骨的退行性變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生[1]。目前，臨床上常用于治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物有阿片類鎮(zhèn)痛藥、非甾體類抗炎藥、甾體類抗炎藥及解熱鎮(zhèn)痛藥等[7]。然而盡管這類藥物能緩解骨關(guān)節(jié)炎疼痛癥狀，但無法減緩骨關(guān)節(jié)炎的退變進(jìn)程[8]。

中醫(yī)藥是我國治療骨關(guān)節(jié)病的傳統(tǒng)手段，具有不良反應(yīng)小、藥效緩和、多靶向整體作用等優(yōu)勢[5]。骨關(guān)節(jié)炎常以關(guān)節(jié)疼痛、膠著為主要臨床表現(xiàn)，屬于痹證中營衛(wèi)不和、寒濕阻痹證的范疇[9]。桂枝附子湯包含桂枝、附子、生姜、紅棗及甘草成分，具有祛濕通絡(luò)、溫經(jīng)通陽、調(diào)和營衛(wèi)、補(bǔ)益肝腎及活血化瘀等作用[10]。然而由于中醫(yī)藥方和骨關(guān)節(jié)炎病理的復(fù)雜性，桂枝附子湯治療骨關(guān)節(jié)病的具體機(jī)理尚未明確闡明。本實(shí)驗(yàn)通過探究TXNIP/NLRP3/caspase-1通路，表明桂枝附子湯可以抑制軟骨細(xì)胞細(xì)胞焦亡，這可能是桂枝附子湯治療骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制之一。有趣的是，筆者發(fā)現(xiàn)小劑量（10、20mol/L）的桂枝附子湯可以增加軟骨細(xì)胞活性，這表明桂枝附子湯中有成分能促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，然而高劑量的桂枝附子湯卻抑制軟骨細(xì)胞活性，這可能是高濃度藥物的毒副作用導(dǎo)致的。

炎癥和細(xì)胞死亡是骨關(guān)節(jié)炎的兩個主要特性[11]。細(xì)胞焦亡是近年來被證實(shí)的一種伴隨炎癥發(fā)生的程序性細(xì)胞死亡方式。有研究表明，細(xì)胞焦亡在骨關(guān)節(jié)炎的病理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[6]。TXNIP/NLRP3/caspse-1通路是細(xì)胞焦亡的一條重要通路[12]。在骨關(guān)節(jié)炎氧化應(yīng)激的條件下，TXNIP將被激活，從胞核轉(zhuǎn)位到胞質(zhì)，結(jié)合并激活NLRP3受體，促進(jìn)NLRP3炎性小體的形成。NLRP3炎性小體是由NLRP3、pro-caspase-1和凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）所組成的蛋白復(fù)合物，能進(jìn)一步激活caspse-1。活化的caspase-1誘導(dǎo)IL-1成熟、釋放，募集炎癥細(xì)胞聚集，誘發(fā)級聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)[13]。本研究通過ODG/R方法建立軟骨細(xì)胞焦亡模型，分別用10、20mol/L的桂枝附子湯處理軟骨細(xì)胞后，LDH 釋放試驗(yàn)和Hoechst33342/PI染色法均證明桂枝附子湯能抑制軟骨細(xì)胞細(xì)胞焦亡。此外，RT-PCR和westernblot結(jié)果進(jìn)一步表明桂枝附子湯能通過調(diào)節(jié)TXNIP/NLRP3/caspse-1通路抑制細(xì)胞焦亡。

綜上所述，桂枝附子湯能調(diào)控TXNIP/NLRP3/caspase-1通路抑制軟骨細(xì)胞焦亡，為臨床上桂枝附子湯治療骨關(guān)節(jié)炎提供了理論依據(jù)。