冷 彥，王 靜，吳文斗，沈曉靜，陳立佼，楊賀凱，吳 奇，王白娟*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650201; 2.云南省有機(jī)茶產(chǎn)業(yè)智能工程研究中心, 云南 昆明 650201; 3.云南省高校智能有機(jī)茶園建設(shè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201)

【研究意義】國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《地理標(biāo)志產(chǎn)品 普洱茶》(GB/T 22111-2008)中，將普洱茶定義為“普洱茶是以地理標(biāo)志保護(hù)范圍內(nèi)的云南大葉種曬青茶為原料，并在地理標(biāo)志性保護(hù)范圍內(nèi)采用特定的加工工藝制成，具有獨(dú)特品質(zhì)特征的茶葉”[1]。研究表明，普洱茶具有抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、降脂[4-5]、降血糖[6]、抗疲勞[7]、提高免疫力[8]等多種保健功效，其中其抗氧化活性與多酚類(lèi)化合物密切相關(guān)[9]。【前人研究進(jìn)展】國(guó)內(nèi)外普洱茶活性物質(zhì)如茶多酚[10]、茶多糖、茶色素、茶皂素[11]等的化學(xué)特性與結(jié)構(gòu)不斷被闡明，但普洱熟茶的體內(nèi)抗氧化研究的報(bào)道相對(duì)較少?；钚匝?reactive oxygen species，ROS)是指生物體內(nèi)與氧代謝有關(guān)的含氧自由基和不以自由基形式存在的具有高活性的中間產(chǎn)物，具有活潑和代謝迅速的特質(zhì)[12]。ROS在生物體內(nèi)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控、免疫反應(yīng)等過(guò)程，是機(jī)體有效防御系統(tǒng)的重要組成部分，但過(guò)量的ROS亦可對(duì)生物膜以及蛋白質(zhì)、脂類(lèi)等生物大分子造成氧化損傷[13]。田華燕[14]，徐麗娟[15]，王天祿[16]等通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)茶褐素對(duì)DPPH自由基、ABTS+自由基和羥自由基均有顯著的清除效果，具有較好的抗氧化活性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，活性氧作為信號(hào)分子的研究大多集中在其如何影響模式植物營(yíng)養(yǎng)器官的生長(zhǎng)發(fā)育，但對(duì)其在動(dòng)物體內(nèi)水平的調(diào)節(jié)機(jī)制尚未有報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】高壓脈沖電場(chǎng)(high voltage pulsed electric field，HPEF)處理技術(shù)是對(duì)位于2個(gè)電極板之間的物料不間歇地施加高壓脈沖波進(jìn)行處理的過(guò)程，研究表明，適當(dāng)?shù)腍PEF條件可以提高普洱熟茶中茶多糖的提取速率和抗氧化活性[17]，提高茶多酚的抗氧化活性[18]。本研究以云南臨滄三級(jí)普洱熟茶為材料，以適宜的高壓脈沖電場(chǎng)及真空冷凍干燥技術(shù)處理后獲得普洱熟茶速溶茶粉，采用DCFH-DA(2,7-dichlorofuorescin diacetate)細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè)探針檢測(cè)飼喂SD大鼠體內(nèi)過(guò)氧化物水平變化，探究高壓脈沖電場(chǎng)預(yù)處理普洱熟茶對(duì)SD大鼠體內(nèi)過(guò)氧化物水平的影響及維持體內(nèi)代謝平衡的可行性，為普洱茶中天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

云南臨滄三級(jí)普洱熟茶(散茶)(云南福茶茶葉有限公司生產(chǎn))；茶褐素，純度≥0.7 g·g-1(云南十草木生物科技有限公司生產(chǎn))；ROS試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn))；SPF級(jí)雌性SD大鼠(昆明楚商科技有限公司提供)，8周齡，體質(zhì)量(245±20)g。

DMC-200型高壓脈沖電源及處理箱(大連鼎通科技發(fā)展有限公司生產(chǎn))；多功能熒光酶標(biāo)儀(上海閃譜生物科技有限公司生產(chǎn))；熒光顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠生產(chǎn))。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 確定HPEF預(yù)處理?xiàng)l件 將HPEF處理時(shí)間設(shè)置為55 min，頻率分別為80、99、121、139、162 Hz，電壓在12～22 kV，通過(guò)正交方式組合成55組，各組參數(shù)條件詳見(jiàn)表1。按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《茶葉感官審評(píng)方法》(GB/T 23776-2018)中的審評(píng)方法進(jìn)行HPEF處理茶樣的感官審評(píng)[19]。感官審評(píng)結(jié)果：第45組(HPEF：12 kV/162 Hz/55 min)的感官品質(zhì)最好，收斂性最好。因此，選擇12 kV/162 Hz/55 min條件下HPEF處理的普洱熟茶作為動(dòng)物試驗(yàn)材料。

表1 HPEF電壓、頻率的設(shè)置

1.2.2 制備速溶茶粉 采用真空冷凍干燥技術(shù)制備茶粉，分別取普洱熟茶和經(jīng)過(guò)HPEF預(yù)處理過(guò)的普洱熟茶1 kg，沸水浸提3次(各次茶水比為1∶20、1∶20、1∶100)，浸提時(shí)間分別為10、20、25 min，合并3次浸提液，放入真空冷凍干燥箱進(jìn)行干燥，待冰晶完全消失后，將干燥后的茶粉刮下并放入自封袋中密封保存，茶粉的得率約為25%。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)陳宗道等人研究推薦成人每日平均用茶量6 g，中國(guó)男女總平均體重60 kg，則成人每日用茶量為每千克體重0.1 g[20]。根據(jù)《保健食品功能評(píng)價(jià)》要求，本試驗(yàn)采用SD大鼠按人體推薦量的5倍作為最低劑量，中、高劑量分別為人體推薦量的10倍和20倍，即高、中、低劑量組分別給予普洱熟茶2.0、1.0和0.5 g·kg-1。取大鼠160只，按體重隨機(jī)分為8組，每組20只。設(shè)置處理1，HPEF預(yù)處理高劑量組(2.0 g·kg-1·bw)；處理2，HPEF預(yù)處理中劑量組(1.0 g·kg-1·bw)；處理3，HPEF預(yù)處理低劑量組(0.5 g·kg-1·bw)；處理4，未預(yù)處理普洱熟茶高劑量組(2.0 g·kg-1·bw)；處理5，未預(yù)處理普洱熟茶中劑量組(1.0 g·kg-1·bw)；處理6，未預(yù)處理普洱熟茶低劑量組(0.5 g·kg-1·bw)；處理7(CK1)，空白對(duì)照組，飼喂清水；處理8(CK2)，陽(yáng)性對(duì)照組，飼喂茶褐素(1.0 g·kg-1·bw)。采用灌胃給藥，空白組的大鼠給以相當(dāng)量的飲用水，灌胃時(shí)間為每天17:00-19:00時(shí)。分別在4周和8周后，檢測(cè)大鼠肝、腎、心、腦組織內(nèi)ROS水平。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定 按ROS測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)操作，活殺老鼠，取肝、腎、心、腦，在預(yù)冷的PBS中清洗血跡和其他污染物，用眼科剪將組織塊剪碎，將組織放300目尼龍網(wǎng)上輕搓，邊搓邊用PBS沖洗，直至將組織搓完。收集細(xì)胞懸液，500 r/min離心10 min取上清液，并用PBS清洗1～2次，并重懸制備單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)。

Q=(M÷4)×104×N

式中：Q表示細(xì)胞數(shù)，個(gè)·mL-1；M表示顯微鏡視野中細(xì)胞總數(shù)，個(gè)·mL-1；N表示溶液稀釋倍數(shù)。

向Q≤106的單細(xì)胞懸液中加入DCFH-DA，濃度為10 μmol/L，37 ℃孵育細(xì)胞30 min，1000 r/min離心收集細(xì)胞沉淀物用于熒光檢測(cè)。熒光檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為500 nm，發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)置為525 nm。結(jié)果用熒光強(qiáng)度/組織鮮重(f·mg-1)表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0和DPS 9.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析與多重比較，Excel 2016軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ROS檢測(cè)結(jié)果

如表2所示，4周后各組織中處理1～6的ROS水平均低于處理7(CK1)，表明普洱熟茶能降低大鼠肝、腎、心、腦組織中的ROS水平，且同一條件下的3個(gè)不同處理ROS水平隨普洱熟茶劑量的增加而降低。各組織中ROS水平處理1均低于處理8(CK2)，表明HPEF高劑量處理能達(dá)到茶褐素對(duì)ROS的抑制效果。各組織中未預(yù)處理組的ROS水平均比處理8(CK2)高，表明未預(yù)處理的普洱熟茶達(dá)不到茶褐素對(duì)ROS的抑制效果。

表2 大鼠肝、腎、心、腦組織中ROS水平(4周后)

肝臟組織ROS水平處理1、處理2極顯著低于處理7(CK1)，分別降低了23.48%、19.62%；處理3、處理4顯著低于處理7(CK1)，分別降低了15.21%、13.26%；處理2極顯著低于處理5，處理3顯著低于處理6，表明肝臟組織中HPEF預(yù)處理組效果優(yōu)于未預(yù)處理組。腎臟組織ROS水平處理1—處理4均極顯著低于處理7(CK1)，分別降低了59.81%、57.74%、53.36%、40.92%，處理5比處理7(CK1)顯著降低了27.06%；處理2顯著低于處理5，處理3極顯著低于處理6，表明腎臟組織中HPEF預(yù)處理組效果優(yōu)于未預(yù)處理組。相比于處理7(CK1)，心臟組織ROS水平處理1極顯著降低了29.38%，處理2顯著降低了25.71%，表明心臟組織中HPEF高、中劑量組能較好地降低ROS水平。腦組織ROS水平處理1～5均極顯著低于處理7(CK1)，分別降低了64.07%、58.84%、53.48%、35.26%、29.21%；處理1極顯著低于處理4，處理2極顯著低于處理5，處理3極顯著低于處理6，表明腦組織中HPEF預(yù)處理組效果明顯優(yōu)于未預(yù)處理組(P<0.01)。

如表3所示，8周后各組織中處理1～6的ROS水平均低于處理7(CK1)，表明普洱熟茶能降低大鼠肝、腎、心、腦組織中的ROS水平，且同一條件下的3個(gè)不同處理的ROS水平隨劑量的增加而降低。8周后，腎臟和腦組織的HPEF預(yù)處理組優(yōu)于同劑量的未預(yù)處理組。腎臟、心臟和腦組織中處理1和處理2 ROS水平均低于處理8(CK2)，表明在腎臟、心臟和腦組織中HPEF高、中劑量處理能達(dá)到茶褐素對(duì)ROS水平的抑制效果；未預(yù)處理組ROS水平均比處理8(CK2)高，表明未預(yù)處理普洱熟茶達(dá)不到茶褐素對(duì)ROS的抑制效果。

表3 大鼠肝、腎、心、腦組織中ROS水平(8周后)

肝臟組織ROS水平處理1、處理2極顯著低于處理7(CK1)，分別降低了24.51%、20.67%；處理3、處理4顯著低于處理7(CK1)，分別降低了16.90%、15.09%，表明在肝臟組織中HPEF預(yù)處理組和未預(yù)處理組的高劑量處理可以較好的降低ROS水平。腎臟組織ROS水平處理1～5均極顯著低于處理7(CK1)，分別降低了63.20%、60.41%、55.91%、44.14%、30.91%；處理2極顯著低于處理5，處理3極顯著低于處理6，表明腎臟組織中HPEF預(yù)處理組效果優(yōu)于未預(yù)處理組。心臟組織ROS水平處理1、處理2顯著低于處理7(CK1)，分別降低了37.91%、31.97%，表明心臟組織中HPEF預(yù)處理組高、中劑量處理可以較好的降低ROS水平(P<0.05)。腦組織ROS水平處理1～6均極顯著低于處理7(CK1)，分別降低了68.24%、64.17%、57.67%、45.97%、36.21%、20.58%；處理1極顯著低于處理4，處理2極顯著低于處理5，處理3極顯著低于處理6，表明腦組織中HPEF預(yù)處理組效果明顯優(yōu)于未預(yù)處理組(P<0.01)。

2.2 ROS水平隨時(shí)間變化差異

如圖1所示，各組織中處理7(CK1)的ROS水平隨著處理時(shí)間的增加而逐漸增加，處理1～處理6和處理8(CK2)隨著處理時(shí)間的增加則均有不同程度的降低。各組織中，只有腦組織中處理7(CK1)的ROS水平8周的顯著高于4周的，高5.49%，其余組織中4周和8周的ROS水平均無(wú)顯著差異，表明只有腦組織中處理7(CK1)ROS水平隨時(shí)間變化差異顯著(P<0.05)。

不同小寫(xiě)字母表示同一處理4周和8周差異顯著(P < 0.05)，不同大寫(xiě)字母表示同一處理4周和8周差異極顯著(P<0.01)，4周時(shí)差異性標(biāo)注在上，8周時(shí)差異性標(biāo)注在下

3 討 論

高壓脈沖電場(chǎng)是非熱處理領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，適當(dāng)?shù)腍PEF條件可以顯著降低普洱茶中的細(xì)菌總數(shù)[21]、提高普洱茶茶水浸出物含量[22]、降低總灰分含量[23]、降低咖啡堿含量[24]、提高氨基酸含量[25]、提高香氣主要成分含量[26-27]，提高普洱熟茶的體外抗氧化活性[28]。ROS是生物系統(tǒng)中產(chǎn)生的化學(xué)活性分子，是基本代謝過(guò)程的自然產(chǎn)物，然而，過(guò)量ROS的存在可導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA損傷，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[29]。組織中ROS水平已被用作疾病標(biāo)志物，而控制ROS水平可能是ROS誘導(dǎo)損傷的一種有希望的治療策略[30]。王迪[31]研究了普洱茶水提取液對(duì)大鼠肝臟組織中ROS水平的影響，發(fā)現(xiàn)普洱茶水提取液可以降低肝臟組織中ROS水平，且呈劑量依賴(lài)降低型。陳曉揚(yáng)等[32]探討了茶多酚對(duì)腦組織中ROS的影響，發(fā)現(xiàn)茶多酚可以降低腦組織中ROS的水平。

本試驗(yàn)采用檢測(cè)大鼠體內(nèi)ROS的方法評(píng)價(jià)不同HPEF條件處理的普洱熟茶的抗氧化功效，與王亞男等[33]檢測(cè)方法類(lèi)似。大鼠肝、腎、心、腦組織內(nèi)ROS水平檢測(cè)結(jié)果表明，HPEF預(yù)處理組和未預(yù)處理組的ROS水平均較空白組低，且劑量越高ROS水平越低，表明普洱熟茶具有降低SD大鼠體內(nèi)ROS的作用，這可能與普洱茶中含有的多酚類(lèi)化合物有關(guān)，多酚類(lèi)化合物可清除體內(nèi)過(guò)量自由基，避免生物大分子損傷，可捕獲氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中產(chǎn)生的活性氧，減少鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的長(zhǎng)度，插入或減慢緩慢過(guò)氧化地進(jìn)行，這與王蕊等[34]的研究結(jié)果類(lèi)似。HPEF預(yù)處理后的普洱熟茶降低ROS水平的功效均優(yōu)于未預(yù)處理的普洱熟茶，這可能是由于HPEF能夠引起細(xì)胞破損，使普洱熟茶中有效成分增加，這與梁榮[35]的研究結(jié)果類(lèi)似。處理?xiàng)l件相同的茶樣組都以灌胃時(shí)間久的ROS水平更低，可能是因?yàn)槠斩觳柚械亩喾宇?lèi)化合物經(jīng)氧化發(fā)酵衍生為較大分子，該大分子具有一定活性的聚合物所致。4周后的肝臟、腎臟組織和8周后的腎臟組織中，HPEF預(yù)處理高劑量組和未預(yù)處理高劑量組無(wú)顯著差異，可能是因?yàn)镠PEF預(yù)處理高劑量組達(dá)到了肝臟和腎臟的耐受力，其抗氧化能力達(dá)到了最高，當(dāng)超過(guò)這個(gè)耐受力值有可能產(chǎn)生促氧化作用[36]，肝臟和腎臟組織的具體耐受力值有待進(jìn)一步探究。8周后的肝臟組織HPEF預(yù)處理組和未預(yù)處理組無(wú)顯著差異，可能是隨著處理時(shí)間的增加，普洱熟茶中的多酚類(lèi)物質(zhì)減少[37]。4和8周后的心臟組織，僅有HPEF高、中劑量組明顯低于空白組，其余組別無(wú)顯著差異，且HPEF預(yù)處理組和未預(yù)處理組無(wú)顯著差異，這可能是對(duì)于心臟組織而言試驗(yàn)組的劑量較低，后續(xù)可以增加心臟組織的劑量濃度，進(jìn)一步探究不同劑量對(duì)SD大鼠心臟組織ROS水平的影響。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)中，HPEF預(yù)處理組、未預(yù)處理組與空白對(duì)照組相比ROS水平均下降，并在一定條件下差異性達(dá)到顯著或極顯著水平。因此，HPEF預(yù)處理組和未預(yù)處理組均能增強(qiáng)大鼠體內(nèi)的抗氧化能力，且HPEF預(yù)處理后的普洱熟茶在降低ROS水平的功效優(yōu)于未預(yù)處理的普洱熟茶，劑量越高ROS水平越低。