伍革民，朱麗莉，韓 雪，唐繼高

(貴州省農業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005)

【研究意義】荔波瑤山雞原產于貴州省荔波縣，具有耐粗飼、抗逆性強、適應性強、飼料報酬高、肉質鮮美細嫩等特點，是貴州地方雞生長發(fā)育較快的雞種之一。荔波瑤山雞年產蛋量90枚左右，就巢性強，散養(yǎng)就巢性達95%。經筆者所在項目組經過多個世代的常規(guī)選育，荔波瑤山雞產蛋量提高到110枚左右，但后期常規(guī)選育進展緩慢，而探索關鍵基因標記輔助選擇，可能成為荔波瑤山雞產蛋性能進一步快速提高的一種有效途徑?！厩叭搜芯窟M展】血管活性腸肽(Vasoactive intestinal peptide,VIP)屬于胃泌素/分泌素/胰高血糖素家族的分泌型多肽，由28個氨基酸組成,并與有不同結構特點的G蛋白偶聯(lián)受體VIP受體1(VIPR-1)及VIP受體2(VIPR-2)結合。VIP/VIPR系統(tǒng)的激活可介導血管擴張、血漿外滲、肥大細胞脫顆粒、免疫調節(jié)等多方面的生理過程[1]。在家禽繁殖周期調節(jié)中，VIP作用于垂體，通過其受體介導，與垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽參與下丘腦-垂體-性腺軸的相關功能，刺激和調控催乳素的分泌和釋放，調控家禽就巢行為和產蛋性能[2-3]。有研究表明，VIP、VIPR-1和VIPR-2基因多態(tài)性豐富，個別位點與雞就巢性、蛋形指數(shù)呈顯著或極顯著相關[3-7]?！颈狙芯壳腥朦c】探明VIP及VIP受體基因與荔波瑤山雞產蛋性能、就巢性的關聯(lián)情況，從數(shù)據庫及文獻中選擇基因變異位點進行PCR測序檢測并開展位點關聯(lián)分析?！緮M解決的關鍵問題】找出可作為荔波瑤山雞繁殖性狀選育的重要標記。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用荔波瑤山雞為120日齡母雞，60只，由貴陽市烏當區(qū)百宜鄉(xiāng)洛壩村種雞場提供，均采用常規(guī)飼養(yǎng)管理方式，個體籠養(yǎng)，群體一致性較好，性能穩(wěn)定。翅下靜脈采血1.0～1.5 mL，加EDTA-Na2抗凝，-20 ℃保存。

1.2 性狀測定

120 日齡母雞轉入產蛋舍單個籠養(yǎng)至300日齡，測定開產日齡、產蛋性能、就巢性等繁殖性狀，測定方法按照NY/T 823-2004[8]進行。

1.3 基因組DNA提取及引物設計

采用TIANamp Blood DNA Kit試劑盒提取血樣DNA。VIP根據GenBank該基因7個外顯子和部分內含子設計引物，VIPR-1和VIPR-2根據GenBank和文獻中的變異位點，在GenBank中在線設計引物，引物由天根生化科技有限公司合成。PCR檢測變異位點在荔波瑤山雞中的基因型遺傳變異情況。檢測的位點、引物序列、擴增長度以及檢測方法見表1。

1.4 PCR擴增及測序

PCR反應體系：DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×TaqPCR MasterMix 試劑10 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反應參數(shù)：95 ℃預變性6 min；95 ℃變性30 s，特定溫度(表1)退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物委托諾賽基因組研究中心有限公司測序，即利用30只個體組成的混合DNA池作DNA模板，進行PCR擴增并測序，分析序列多態(tài)性；針對存在多態(tài)位點的引物，逐一對60個樣本進行單獨測序。

1.5 數(shù)據統(tǒng)計分析

使用DNAstar對測序結果進行校正，進入基因庫網站采用BLAST分析序列SNPs，采用DNAMAN軟件分析SNPs變異導致蛋白質編碼變異的情況。以Excel統(tǒng)計基因分型，利用SPSS 18.0采用單因子方差分析法分析基因型與繁殖性狀的相關性。

2 結果與分析

2.1 多態(tài)位點和遺傳多樣性

從表2看出，VIP基因P4引物檢測出1個多態(tài)位點，VIPR-1基因P6、P7、P8引物共檢測出16個多態(tài)位點，VIPR-2基因P10、P11引物檢共測出3個多態(tài)位點。VIPR-1基因16個多態(tài)位點包括1個編碼區(qū)突變、1個10 bp(AAAATGTCTT)插入/缺失突變和14個內含子替換突變；編碼突變位于VIPR-1基因68 817位置(mRNA 327位置，第4外顯子區(qū)域，T→C)，導致該蛋白質第109個氨基酸纈氨酸發(fā)生同義突變(V：GUU→GUC)；10 bp(AAAATGTCTT)插入/缺失突變位于基因39 114位置，其余14個內含子替換突變分布于第2和10內含子中。VIPR-2基因3個多態(tài)位點，包括1個編碼區(qū)突變和2個內含子替換突變；編碼區(qū)突變位于基因位置49 246(mRNA位置1050，第11外顯子，T→C)，導致第350個氨基酸脯氨酸發(fā)生同義突變(P：CCU→CCC)；內含子突變分別位于第2內含子基因位置3784(G→A)和基因位置3739(A→G)。另外，GenBank數(shù)據庫檢索發(fā)現(xiàn)，荔波瑤山雞VIPR-2基因序列相對于數(shù)據庫序列具有5個獨特的突變，分別為基因位置49 246(mRNA位置1050，第11外顯子，T→C)，導致該蛋白第350個氨基酸-脯氨酸發(fā)生同義突變(P：CCU→CCC)，基因位置49 248(mRNA位置1052，第11外顯子,A→G)以及基因位置49 249(mRNA位置1053，第11外顯子，C→G),2個變異位置位于同一密碼子內，導致該蛋白質第351個氨基酸發(fā)生錯義突變(天冬氨酸D→甘氨酸G)(GAC→GGG)，基因位置49 388(mRNA位置1103，第12外顯子，G→A)，導致第371個氨基酸-亮氨酸發(fā)生同義突變(L：UUG→UUA)，以及基因位置3664和3665之間插入17 bp(AGAATAAAATAAGTAAA)的序列變異。

表2 荔波瑤山雞VIP及其受體基因的多態(tài)位點

2.2 多態(tài)位點與繁殖性狀的相關性

從表3可知,①VIP基因檢測出1個多態(tài)位點5010，但該位點各基因型間300日齡產蛋量及各就巢性狀差異均不顯著。②VIPR-1基因檢測出的16個多態(tài)位點中，與300日齡產蛋量或就巢性狀顯著關聯(lián)的多態(tài)位點有6個。其中，位點39 109各基因型間差異顯著的性狀有開產日齡、首次就巢至重新開產間隔及300日齡就巢次數(shù)，差異極顯著的性狀有300日齡產蛋量和首次就巢日齡；位點39 114插入純合基因型300日齡產蛋量比插入雜合基因型、缺失純合基因型顯著降低，其余性狀間差異不顯著；位點39 227各基因型間300日齡產蛋量差異極顯著，基因型GG首次就巢持續(xù)時間顯著高于其他兩種基因型，基因型TT300日齡就巢次數(shù)顯著低于其他兩種基因型；位點68 817各基因型間，差異顯著的性狀有開產日齡、首次就巢至重新開產間隔及首次就巢持續(xù)時間，差異極顯著的性狀有300日齡產蛋量、首次就巢日齡和300日齡就巢次數(shù)；位點69 061各基因型間差異顯著的性狀有300日齡產蛋量和首次就巢日齡，差異極顯著的性狀是300日齡就巢次數(shù)；位點97 123各基因型間差異顯著的性狀有首次就巢持續(xù)時間，差異極顯著的性狀有300日齡產蛋量、首次就巢日齡、首次就巢至重新開產間隔和300日齡就巢次數(shù)。③VIPR-2基因檢測出的3個多態(tài)位點3739、3184、49 246各基因型間300日齡產蛋量呈顯著或極顯著相關，位點3739和位點49 246各基因型間首次就巢持續(xù)時間、首次就巢至重新開產間隔呈顯著或極顯著相關。

表3 VIP及其受體基因多態(tài)位點與繁殖性狀的相關性

3 討 論

雞VIP基因定位于3號染色體上，包括7個外顯子和6個內含子。VIP的mRNA目前發(fā)現(xiàn)有2種轉錄本，轉錄本1轉錄了所有1個外顯子，編碼200個氨基酸，而轉錄本2比轉錄本1少外顯子4的拼接，編碼165個氨基酸[9]。周敏等[10]研究發(fā)現(xiàn)，江西寧都三黃雞VIP基因4個SNP突變位點與不同日齡的雞冠高度存在極顯著或一定程度的相關；黃孫平等[11]研究表明，四明香雞B系VIP基因A-3458G位點各基因型間65周體重差異達顯著水平(P<0.05)，與產蛋量相關不顯著。杜穎軍[12]發(fā)現(xiàn)，5′-UTR的3個突變(A-1784G、-2648-2650缺失和C-3143T)和1個外顯子突變(G+780T)4個位點均與雞的繁殖性狀相關。ZHOU等[13]研究發(fā)現(xiàn)，寧都三黃雞-2648-2650缺失顯著影響90～300日齡產蛋量、C+338T對就巢持續(xù)時間影響顯著。楊恒[5]研究發(fā)現(xiàn)，欣華雞E系VIP基因5′-UTR存在1個顯著影響蛋形指數(shù)的位點A-3458G。本研究重點篩查荔波瑤山雞VIP基因7個外顯子區(qū)域的突變，引物圍繞7個外顯子設計，結果表明，在荔波瑤山雞檢測到的7個外顯子區(qū)域均未發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點，僅在第6內含子(基因5010位置)發(fā)現(xiàn)1個多態(tài)位點C→A，但各基因型間產蛋量及就巢性狀均差異不顯著，這與以上研究結果不太一致，可能與雞品種有關。另外，試驗中沒有檢測到的其他內含子區(qū)域是否存在影響荔波瑤山雞繁殖性狀的多態(tài)位點還有待進一步研究。

VIPR-1是一種與G蛋白偶聯(lián)的7次跨膜糖蛋白，屬于促胰泌素/VIP受體亞族[14]。雞VIPR-1基因定位于 2號染色體短臂(2p3.2)，全長104 263 bp，包括13個外顯子，12個內含子[15]。ZHOU等[16]以寧都三黃雞第4代群體進行標記與就巢性的關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，位點C+598T與C+53327T對寧都三黃雞的就巢行為有顯著影響(P<0.05)。周敏等[6]通過對VIPR-1基因5′(-496～-1 bp)調控區(qū)多態(tài)性與清遠麻雞就巢性狀的相關性研究結果表明，VIPR-1基因G-359T、G-266T、A-134-、A-94G、C-72G突變與18～43周齡就巢持續(xù)天數(shù)顯著相關，且A-94G突變還與雞就巢率顯著相關，12個多態(tài)位點構成的單倍型與就巢持續(xù)天數(shù)極顯著相關。周敏等[17]研究發(fā)現(xiàn)，位于內含子6的位點C+42913T與寧都三黃雞300日齡總產蛋數(shù)和300日齡的總正常蛋數(shù)顯著相關(P<0.05)，與清遠麻雞40周齡、43周齡以及54周齡的總產蛋數(shù)和總正常蛋數(shù)顯著相關(P<0.05)。內含子8的位點C+53327T與寧都三黃雞開產日齡極顯著相關(P<0.01)、與300日齡就巢持續(xù)天數(shù)呈顯著相關(P<0.05)。以雞VIPR-1基因作為雞冠高度和體重的候選基因，周敏等[18]選取了12個多態(tài)位點對586只寧都三黃雞進行基因型檢測并分析其與這2個性狀的相關性研究表明，位于內含子2的位點C+598T與84日齡體重顯著相關(P<0.05)；位于內含子8的位點C+53327T與77日齡體重和 91日齡體重呈極顯著相關(P<0.01)，但此12個位點與不同日齡的雞冠高度不相關。趙振華[19]研究表明，VIPR-1基因C73352T突變位點，TT基因型個體冠高、冠面積和肉垂面積顯著大于CC基因型個體(P<0.05)，T68818C位點各基因型個體間冠高、冠面積和肉垂面積差異顯著(P<0.05)。

VIPR-1基因DNA序列全長104 263 bp，該基因外顯子短，內含子序列很長，對全基因測序耗費高，從文獻及數(shù)據庫中檢索SNP及缺失/插入突變，共檢索到該基因1210個變異位點，說明該基因序列多態(tài)性豐富，但大部分變異位點位于內含子區(qū)域。本研究針對荔波瑤山雞該基因的調控區(qū)、外顯子及插入/缺失突變檢測出16個多態(tài)位點，其中6個位點與300日齡產蛋量或就巢性狀顯著關聯(lián)，6個位點包括位于內含子2區(qū)域的39 109、39 114、39 227位點，外顯子4區(qū)域的68 817位點以及內含子4區(qū)域的69 061、97 123位點。外顯子4的68 817位點T→C變異，導致該蛋白質第109個氨基酸-纈氨酸發(fā)生同義突變(V：GUU→GUC)；趙振華[19]研究表明，該同義突變位點與雞冠高、冠面積和肉垂面積顯著相關；本研究發(fā)現(xiàn)，該同義突變與荔波瑤山雞的300日齡產蛋量、開產日齡、就巢性狀呈顯著或極顯著相關，說明該基因位點可以作為雞的繁殖性狀選育標記，用于雞的輔助選育。設計引物P4是為檢測出NCBI數(shù)據庫查詢到的39 114位點的10 bp(AAAATGTCTT)插入/缺失突變，在荔波瑤山雞中檢測到了該變異位點，同時發(fā)現(xiàn)該位點插入純合基因型300日齡產蛋量顯著降低；另外，利用該引物還檢測到了位于該插入/缺失位點兩側的新變異位點39 109和39 227與產蛋量或就巢性狀顯著相關。上述位點可用于荔波瑤山雞繁殖性狀的輔助選育。

VIPR-2基因位于雞2號染色體上，DNA序列全長50 748 bp，包括13個外顯子和12個內含子，對該基因與雞繁殖性狀的關聯(lián)研究相對較少。趙振華[19]研究表明，VIPR-2基因A36127G位點GG基因型個體冠高、冠面積和肉垂面積顯著大于AA和AG基因型個體(P<0.05)。從數(shù)據庫及文獻中共檢索到該基因變異位點655個，說明該基因變異多態(tài)性豐富。本研究表明，荔波瑤山雞VIPR-2基因檢測到3個多態(tài)位點，包括1個編碼區(qū)突變和2個內含子替換突變。研究還發(fā)現(xiàn)，荔波瑤山雞品種相對于數(shù)據庫序列獨特的變異位點5個，包括4個編碼區(qū)變異和1個17 bp(AGAATAAAATAAGTAAA)插入突變。4個編碼區(qū)變異分別導致該基因編碼蛋白質第350個氨基酸發(fā)生同義突變(脯氨酸P：CCU→CCC)、第351個氨基酸發(fā)生錯義突變(天冬氨酸D→甘氨酸G，GAC→GGG)以及第371個氨基酸發(fā)生同義突變(亮氨酸 L：UUG→UUA)，這些變異可能是荔波瑤山雞的品種特征，其功能情況有待進一步分析。關聯(lián)分析表明，檢測到的荔波瑤山雞VIPR-2基因的3個多態(tài)位點3739、3184、49 246各基因型間300日齡產蛋量或就巢性狀呈顯著或極顯著相關，這些位點可作為荔波瑤山雞繁殖性狀選育的標記開展進一步研究分析。

4 結 論

荔波瑤山雞VIP及其受體VIPR-1和VIPR-2共檢測20個多態(tài)位點。VIP基因檢測的范圍廣，包括所有外顯子區(qū)域及部分內含子區(qū)域，但變異少，僅檢測到1個多態(tài)位點，且該多態(tài)位點與產蛋和就巢性狀均無顯著關聯(lián)。VIP受體基因VIPR-1和VIPR-2僅對其部分區(qū)域進行選擇性檢測，但檢測到的位點多態(tài)性豐富，VIPR-1檢測到16個多態(tài)位點，VIPR-2檢測到3個多態(tài)位點，另外VIPR-2檢測到5處品種獨特突變。VIPR-1的6個多態(tài)位點以及VIPR-2的3個多態(tài)位點與產蛋量、就巢性狀呈顯著或極顯著關聯(lián)。說明，VIP受體基因VIPR-1和VIPR-2可作為荔波瑤山雞繁殖性狀選育的候選基因，該結果為利用分子標記輔助選擇提高荔波瑤山雞的繁殖性能奠定一定的基礎。