王小杰，柏友蘭，劉明偉，王新杰，李宏偉，李 欣*

（1.承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000；2.承德市中心醫(yī)院腫瘤科；3.承德市圍場滿族蒙古族自治縣醫(yī)院消毒供應(yīng)中心）

胃癌是全球最為常見的惡性腫瘤之一，在我國的發(fā)病率及死亡率較高[1]，由于其早期癥狀不明顯，加之當(dāng)前缺乏簡易靈敏的篩查標志物，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時便已經(jīng)是晚期，給人們的健康和生活帶來嚴重威脅，因此，尋找早期診療標志物已經(jīng)非常必要。膜聯(lián)蛋白A7（annexin A7,ANXA7）是第一個被分離出來的Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白超家族的一員[2]，在細胞水平上發(fā)揮著胞外分泌、膜運輸以及鈣離子動態(tài)平衡等多種功能[3]。除此之外，大量研究表明，ANXA7在多種惡性腫瘤組織中都有異常的表達。在胃癌組織中，ANXA7表達異常增高[4]，這提示，ANXA7與胃癌的發(fā)生發(fā)展存在某種關(guān)聯(lián)，本研究通過在胃癌MGC-803細胞過表達ANXA7，觀察MGC-803細胞增殖和凋亡的改變，從而為胃癌診療標志物的尋找提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌MGC-803細胞（賽百慷上海生物公司）；細胞培養(yǎng)基1640及胎牛血清（Gibco公司，美國）；CO2培養(yǎng)箱（賀利公司，德國）；pcDNA3.1-ANXA7重組質(zhì)粒及空質(zhì)粒購自Sino Biological公司，轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000（lipo2000）（Invitroden公司產(chǎn)品，美國）；ANXA7、PCNA、CyclinD1、Casepase-3、Cleaved casepase-3及β-actin鼠源單克隆抗體均（Epitomics公司，美國），羊抗鼠二抗（KPL公司，美國），CCK-8（APExBIO公司，美國），細胞凋亡試劑盒（BD公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人胃癌MGC-803細胞于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，置于5%二氧化碳的37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細胞分為ANXA7過表達組（pcDNA3.1-ANXA7）、陰性對照組（pcDNA3.1-NC）。其中ANXA7過表達組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ANXA7重組質(zhì)粒，陰性對照組轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒。取處于對數(shù)生長期的MGC-803細胞，轉(zhuǎn)染前24h接種于6孔板中，每孔細胞2.5×105個，每孔加入2ml完全培養(yǎng)基，細胞達到60%～70%匯合度時，進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，每孔質(zhì)粒用量為2.5μg，lipo2000為5μg，無血清培養(yǎng)基稀釋混合后室溫靜置15min，將混合物加入6孔板中。柔和混勻，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于48h收集細胞進行后續(xù)相關(guān)檢測。

1.2.2 Western blot檢測ANXA7過表達情況 收集各組細胞，每孔加入100μl細胞裂解液，提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測總蛋白濃度，100℃處理10min使蛋白變性，每個泳道加入30μg蛋白，80V穩(wěn)壓電泳，2.5mA/cm2穩(wěn)流轉(zhuǎn)膜，封閉過夜，ANXA7單抗（1:1000）室溫孵育2h，TBST洗膜3次，二抗（1:5000）室溫孵育1h，TBST洗膜3次，ECL超敏發(fā)光，使用化學(xué)發(fā)光儀顯影并保存條帶。Quantity One 4.6.2軟件計算條帶灰度值，計算ANXA7/β-actin數(shù)值，即ANXA7的相對表達量。

1.2.3 CCK-8實驗 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染12h后將細胞消化成細胞懸液，按5×103個/孔的密度接種于96孔板，每組5個副孔，每孔細胞懸液100μl，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h時每孔加入10μl CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中放置2h，用酶標儀測定450nm處的吸光度值。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h后，用不含EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化細胞，制成單細胞懸液，每組計數(shù)5×105個，加入Annexin Ⅴ-FITC和PI各5μl進行雙染，室溫避光5min后上流式細胞儀檢測。

1.2.5 Western blot檢測增殖、凋亡及通路相關(guān)蛋白表達情況 收集各組細胞，每孔加入100μl細胞裂解液，提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測總蛋白濃度，100℃處理10min使蛋白變性，每個泳道加入30μg蛋白，80V穩(wěn)壓電泳，2.5mA/cm2穩(wěn)流轉(zhuǎn)膜，封閉過夜，PCNA、CyclinD1、Casepase-3、Cleaved casepase-3單抗（1:1000）室溫孵育2h，TBST洗膜3次，二抗（1:5000）室溫孵育1h，TBST洗膜3次，ECL超敏發(fā)光，于化學(xué)發(fā)光儀顯影并保存條帶。Quantity One 4.6.2軟件計算條帶灰度值，計算目的蛋白/β-actin數(shù)值，即目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各實驗組ANXA7的表達情況

與陰性對照組相比，pcDNA3.1-ANXA7組ANXA7蛋白的表達顯著升高（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1）。

圖1 ANXA7表達情況

2.2 ANXA7過表達促進MGC-803細胞的增殖

與陰性對照組相比，pcDNA3.1-ANXA7組細胞的增殖活力明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Western blot進一步檢測各組細胞中增殖相關(guān)蛋白PCNA、CyclinD1的表達，發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1-ANXA7組中PCNA和CyclinD1均升高（P＜0.05）,如圖2：

圖2 ANXA7過表達促進胃癌MGC-803細胞的增殖

2.3 ANXA7過表達抑制MGC-803細胞的凋亡

與陰性對照組相比，pcDNA3.1-ANXA7組細胞凋亡率顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。采用Western blot進一步檢測各組細胞凋亡相關(guān)蛋白Casepase-3、Cleaved casepase-3的表達，發(fā)現(xiàn)ANXA7過表達組中，Cleaved caspase-3的表達降低（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義；Casepase-3的表達變化不大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖3）。

圖3 ANXA7過表達抑制MGC-803細胞的凋亡

3 討論

胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，早期難發(fā)現(xiàn)，易轉(zhuǎn)移。其發(fā)病率及死亡率在全球范圍內(nèi)一直位居前列，其手術(shù)及放化療治療效果差，預(yù)后不良[5]，尋找有效的診療標志物迫在眉睫。

ANXA7是一類具有廣泛生物學(xué)功能的磷脂結(jié)合蛋白，與細胞的生長、分化、增殖及凋亡等環(huán)節(jié)密切相關(guān)[6,7]。很多研究發(fā)現(xiàn)ANXA7在多種腫瘤組織中存在著異常的表達[8,9]，Yuan等[10]發(fā)現(xiàn)ANXA7在胃癌組織中的表達較癌旁正常組織明顯增高。在本課題組之前的研究中，我們通過免疫組化檢測了ANXA7在細胞中的定位，Western blot和RT-PCR分別從蛋白和mRNA水平檢測了胃癌組織及癌旁組織中ANXA7的表達，發(fā)現(xiàn)ANXA7 主要定位于細胞質(zhì)中，在正常胃組織中胃腺上皮細胞胞質(zhì)呈淺黃色，在胃癌細胞中呈深黃色，ANXA7在胃癌組織中的表達明顯增高，差異顯著[11]。葉衛(wèi)華等通過檢測ANXA7在胃癌患者癌組織及外周血液中的變化情況發(fā)現(xiàn)ANXA7在胃癌組織中的表達升高，其表達水平與胃癌的惡性程度與進展密切相關(guān)，且胃癌患者外周血液中ANXA7的水平能較好反映其在癌組織中的表達水平[12]。以上研究表明，ANXA7與胃癌的發(fā)生發(fā)展可能存在某種關(guān)聯(lián)。本研究通過在人胃癌MGC-803細胞中過表達ANXA7，檢測其對胃癌細胞增殖和凋亡的影響，進一步明確ANXA7在胃癌的發(fā)生發(fā)展中的作用。

CyclinD1是一個由人類CCND1基因所編碼的蛋白質(zhì)，是細胞周期G1期和S期的轉(zhuǎn)換開關(guān)，研究表明CyclinD1可正向調(diào)控細胞周期，其增高可促進腫瘤細胞惡性增殖[13]。增殖核抗原PCNA是僅在增殖細胞中合成與表達的一種酸性非組胺核蛋白，該蛋白在DNA復(fù)制合成修復(fù)過程中必不可少。PCNA可反映腫瘤細胞的增殖活性，是評估細胞增殖狀態(tài)的黃金指標[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌MGC-803細胞中過表達ANXA7之后，細胞增殖活力增強，CyclinD1和PCNA蛋白表達升高，表明ANXA7促進了胃癌MGC-803細胞的增殖。

Caspase-3為天冬酞胺特異酶切的半胱氨酸蛋白酶，在細胞凋亡早期階段，其常常作為關(guān)鍵酶被激活，Caspase-3在細胞凋亡過程中承前啟后，是目前已知的凋亡最終執(zhí)行因子，被稱為死亡蛋白酶[15]。Caspase-3在細胞中通常以無活性的Caspase-3前體存在，只有當(dāng)細胞接收到凋亡信號指令或受到外界刺激時，Caspase-3才能轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘腃aspase-3，又稱為裂解的Caspase-3,即Cleaved Caspase-3，其具有成熟酶的性質(zhì)，可通過酶切割特異性底物，DNA依賴性蛋白激酶等參與細胞凋亡的發(fā)生[16]。因此，人們常把Caspase-3的激活作為判斷細胞凋亡嚴重性的黃金指標之一。若Caspase-3蛋白的激活受到抑制，則凋亡明顯減少。本研究顯示，在MGC-803細胞中將ANXA7過表達后，ANXA7過表達組Cleaved caspase-3蛋白表達低于陰性對照組，提示ANXA7的過表達可能抑制了Caspase-3前體的激活而導(dǎo)致Cleaved caspase-3表達減少，從而減輕了胃癌細胞凋亡的產(chǎn)生，流式細胞術(shù)的檢測結(jié)果正好與之吻合，過表達組細胞凋亡率顯著降低。

綜上，ANXA7在胃癌MGC-803細胞中過表達可促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，有望為臨床胃癌診療備選標記物的篩選提供一定的參考。