陳廷煒 孟憲踴 王鐵成 高玉偉 馮 娜* 夏咸柱*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春，130118；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院，軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春，130122)

犬瘟熱(canine distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV)感染引起的一種急性、熱性、高度接觸性和高致死性的病毒性傳染病。近年來，CDV感染的宿主范圍逐漸擴(kuò)大，包括犬科(Canidae)、貓科(Felidae)、鬛狗科(Hyaenidae)、鼬科(Mustelidae)、浣熊科(Procyonidae)、靈貓科(Viverridae)、熊貓科(Ailuridae)及非人靈長類(Non-human primates，NHPs)等動(dòng)物。1997—2015年累計(jì)7只圈養(yǎng)大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)感染CDV死亡，提示CD已成為威脅大熊貓生命安全的第一大傳染病[1]。經(jīng)過科研人員的不懈努力，全球大熊貓圈養(yǎng)種群數(shù)量已超過600只，可持續(xù)圈養(yǎng)種群基本形成。為了降低大熊貓感染CD的風(fēng)險(xiǎn)，對CD疫苗免疫的需求顯得尤為迫切。

CDV屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)，麻疹病毒屬(Morbillivirus)，是負(fù)鏈單股不分節(jié)段的RNA病毒。CDV基因組的長度為15 690 bp，基因組從3′端到5′端共編碼6種蛋白：核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)、膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝蛋白(H)、大蛋白(L)[2-3]。其中CDV H蛋白基因長度為1 944—1 946 bp，只有1個(gè)開放閱讀框，相對分子質(zhì)量為76 000—85 000。H蛋白位于病毒粒子表面，屬于Ⅱ型糖蛋白，其上分布有許多抗原表位，是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要結(jié)構(gòu)蛋白，發(fā)揮著體液免疫反應(yīng)主要誘導(dǎo)劑的功能[4]。此外，H蛋白還包含細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)表位，可產(chǎn)生特異的CTL活性，通常用作基因工程疫苗的靶標(biāo)基因，以預(yù)防CD[5]。

腺病毒載體是最為常用的疫苗開發(fā)和基因治療的病毒載體[6]，近幾年發(fā)展很快，已經(jīng)在全球數(shù)百個(gè)臨床試驗(yàn)中進(jìn)行了測試，證明該病毒載體具有良好的安全性，宿主的范圍廣泛，產(chǎn)生重組病毒滴度較高[7]，外源蛋白表達(dá)量高，并且還具有高免疫原性[8-10]。本研究選擇缺失了編碼腺病毒早期蛋白的E1區(qū)和E3區(qū)的復(fù)制缺陷型人5型腺病毒作為大熊貓?jiān)慈翢岵《綡蛋白的呈遞表達(dá)系統(tǒng)，獲得的能夠表達(dá)giant panda/SX/2014 H蛋白的重組腺病毒rAd-CDV-H可以為大熊貓犬瘟熱預(yù)防免疫以及同其他載體聯(lián)合免疫提供候選疫苗株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病毒、細(xì)胞和菌株

大熊貓?jiān)慈翢岵《緂iant panda/SX/2014(GenBank：KP793921)，由軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所分離與保存；293A細(xì)胞購自漢恒生物公司；基因工程菌EscherichiacoliDH5α購自TaKaRa公司。

1.1.2 主要試劑

病毒RNA提取試劑盒購自天根公司，TransStart FastPfu DNA Polymerase購自全式金公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自康為世紀(jì)公司，pAd/CMV/V5-DEST腺病毒載體、pENTR/D-TOPO入門載體、Gateway LR ClonaseII Enzyme Mix、Anti-V5抗體、Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑均購自Invitrogen公司，PacⅠ限制性內(nèi)切酶、SuperSignal?West Dura持久性化學(xué)發(fā)光底物購自Thermo Scientific公司，Adeno-X Rapid Titer Kit、Reverse Transcriptase XL(AMV)購自TaKaRa公司，Goat anti-Mouse IgG(H+L)-HRP購自Bioword公司，山羊多克隆抗體購自VMRD公司，Rabbit Anti-Goat IgG(whole molecule)-FITC，購自SIGMA公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 測序引物及基因擴(kuò)增

根據(jù)大熊貓?jiān)慈翢岵《緂iant panda/SX/2014H基因序列，使用Primer premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)上下游引物，引物序列CDVHF為，5′-CACCGCCACCATGCTCTCTTACCAAGA CAAGGT-3′；CDVHR為，5′-AGGTTTTGAACGGTT ACATGAGAAT-3′(ATG前引入增強(qiáng)H基因表達(dá)的Kozak序列(下劃線))；pAd/CMV/V5-DEST腺病毒載體測序引物T7為，5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′；V5(C-term)為，5′-ACCGAGGAGAGGGTTAGGGAT-3′，以上引物由長春庫美公司合成。

使用病毒基因組RNA提取試劑盒提取大熊貓?jiān)慈翢岵《緂iant panda/SX/2014基因組RNA，反轉(zhuǎn)錄后利用CDVHF/CDVHR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2 min；95℃變性20 s，52℃退火 20 s，72℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳后觀察是否正確后回收。

1.2.2 重組腺病毒的構(gòu)建

將1.2.1中膠回收得到的目的片段通過TOPO克隆連接至入門載體pENTR/D-TOPO中，獲得重組入門質(zhì)粒pENTR/D-TOPO-CDV-H，分裝后送至長春庫美公司測序。使用Gateway LR Clonase Ⅱ Enzyme Mix將測序正確的重組入門質(zhì)粒與腺病毒載體pAd/CMV/V5-DEST進(jìn)行LR重組得到重組腺病毒質(zhì)粒pAd-CDV-H，質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定陽性后送至測序公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.2.3 重組腺病毒的包裝

測序驗(yàn)證正確的重組腺病毒質(zhì)粒pAd-CDV-H經(jīng)PacⅠ酶切處理線性化后按Lipofectamine?2000說明書轉(zhuǎn)染至293A細(xì)胞，37℃，體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 d，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的呈葡萄串狀病變但未全部脫落時(shí)，反復(fù)凍融3次收獲培養(yǎng)物，6 000 r/min，4℃離心5 min收集上清液，即為重組腺病毒第1代，命名為rAd-CDV-H，病毒液置于-80℃保存。連續(xù)傳代后鑒定是否將外源基因重組到腺病毒載體中。

1.2.4 重組腺病毒滴度的測定

按照Adeno-X Rapid Titer Kit試劑盒說明書對保存的第7代重組腺病毒rAd-CDV-H進(jìn)行測定。具體步驟為：將10倍連續(xù)稀釋的病毒液50 μL/孔加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的293A細(xì)胞中，每個(gè)稀釋度至少2個(gè)重復(fù)，設(shè)正常細(xì)胞對照，37℃，體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。吸棄培養(yǎng)液，100%冷甲醇-20℃固定細(xì)胞10 min。棄液后用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%BSA的PBS溶液清洗3次。之后孵育Anti-Hexon Antibody(1%BSA，1∶1 000稀釋)，250 μL/孔，37℃孵育1 h；清洗3次后孵育Rabbit Anti-Mouse Antibody(HRP conjugate)(1%BSA，1∶500稀釋)，250 μL/孔，37℃孵育1 h。棄液清洗3次后加入DAB工作液，500 μL/孔，室溫孵育10 min。棄液后加入PBS，500 μL/孔，計(jì)數(shù)20倍顯微鏡至少3個(gè)視野中棕色陽性信號(hào)數(shù)量(以每個(gè)視野包含5—50個(gè)棕色陽性信號(hào)數(shù)量為宜)，以其平均數(shù)根據(jù)公式，計(jì)算病毒滴度。

病毒滴度(IFU/mL)=[(感染細(xì)胞/視野)×(視野/孔)]/[病毒液體積(mL)×稀釋系數(shù)]

1.2.5 間接免疫熒光方法鑒定

先在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中分別接種293A細(xì)胞和Vero細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)70%左右時(shí)，接種重組腺病毒rAd-CDV-H，接毒量為100 MOI(multiplicity of infection，感染復(fù)數(shù))，然后放入37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。吸棄培養(yǎng)液，用體積分?jǐn)?shù)80%的冷丙酮室溫固定細(xì)胞30 min。棄液后使用PBST溶液清洗3次。孵育山羊抗犬瘟熱病毒多克隆抗體(1%BSA，1∶400稀釋)，250 μL/孔，37℃孵育1 h，之后孵育加入伊文思藍(lán)溶液的Rabbit Anti-Goat IgG(whole molecule)-FITC(1%BSA，1∶200稀釋)，250 μL/孔，避光盒內(nèi)37℃孵育 1 h。經(jīng)PBST溶液洗滌3次后置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 Western blot鑒定

在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種293A細(xì)胞，細(xì)胞生長至70%匯合度時(shí)，接種重組腺病毒rAd-CDV-H，接毒量為100 MOI，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生病變且未完全脫離底部時(shí)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用RIPA細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞后收集到1.5 mL離心管中，與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混合，沸水煮樣10 min后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳并將蛋白利用濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)印至NC膜，經(jīng)封閉液封閉后，以Anti-V5抗體為一抗，4℃過夜孵育后，使用Goat anti-Mouse IgG(H+L)-HRP為二抗，室溫孵育，最后在曝光儀中鑒定重組腺病毒H蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定

利用CDVHF/CDVHR引物對重組腺病毒質(zhì)粒pAd-CDV-H進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳顯示可擴(kuò)增出大小約為1 821 bp的片段(圖1)，證明目的片段已成功插入到重組質(zhì)粒中，然后將重組質(zhì)粒分裝后與T7/V5(C-term)引物送至測序公司進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果表明插入的H基因序列與大熊貓?jiān)慈翢岵《綡基因序列一致。

2.2 重組腺病毒的酶切鑒定

重組質(zhì)粒pAd-CDV-H經(jīng)PacⅠ酶切后電泳結(jié)果顯示2個(gè)特異片段，大小分別為約36 kb線性化重組質(zhì)粒pAd-CDV-H和2 028 bp的PacⅠ酶切條帶，結(jié)果正確(圖2)。

2.3 重組腺病毒的包裝

用Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)線性化的重組質(zhì)粒pAd-CDV-H轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后8 d，轉(zhuǎn)染孔293A細(xì)胞圓縮、聚堆明顯，呈典型的葡萄串狀細(xì)胞病變(圖3A)，細(xì)胞對照形態(tài)正常(圖3B)。

2.4 重組腺病毒的滴度測定

DAB顯色后第7代重組腺病毒rAd-CDV-H選擇10-5稀釋度的細(xì)胞孔的陽性信號(hào)數(shù)量最佳(1個(gè)視野內(nèi)有5—50個(gè)棕色信號(hào))，計(jì)算重組腺病毒的滴度(圖4A)；陰性對照細(xì)胞孔無深棕色信號(hào)(圖4B)。根據(jù)1.2.4公式計(jì)算，病毒滴度=(21×313)/(0.05×10-5)=1.31×1010IFU/mL。

2.5 重組腺病毒H蛋白表達(dá)鑒定

2.5.1 間接免疫熒光檢測

以山羊抗犬瘟熱病毒多克隆抗體作為一抗，Rabbit Anti-Goat IgG(whole molecule)-FITC作為二抗進(jìn)行間接免疫熒光染色。倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，接種重組腺病毒的293A細(xì)胞和Vero細(xì)胞均能觀察到特異的綠色熒光信號(hào)(圖5A，圖5C)，而對照組的293A細(xì)胞和Vero細(xì)胞無綠色熒光信號(hào)(圖5B，圖5D)。結(jié)果表明，重組腺病毒rAd-CDV-H能夠穩(wěn)定介導(dǎo)H蛋白在293A細(xì)胞及非包裝復(fù)制細(xì)胞中有效表達(dá)。

2.5.2 Western blot 鑒定

用Anti-V5抗體作為一抗，Goat Anti-Mouse IgG(H+L)-HRP作為二抗，經(jīng)Western blot檢測，在約81 kd位置可見1條特異性的曝光條帶(圖6)，而未感染細(xì)胞無特異性蛋白條帶，進(jìn)一步證明CDV H蛋白在重組腺病毒rAd-CDV-H感染293A細(xì)胞中得到有效表達(dá)。

3 討論

犬瘟熱病毒(CDV)對大熊貓的致死性感染迄今已發(fā)生過2次，分別為1997年重慶市及2014年末至2015年4月陜西省累計(jì)7只大熊貓感染CDV死亡。鑒于感染CDV的大熊貓死亡造成的嚴(yán)重影響，迫切需要疫苗接種來保護(hù)大熊貓種群。目前，我國依賴進(jìn)口CD疫苗進(jìn)行圈養(yǎng)野生動(dòng)物的接種，且無穩(wěn)定有效的大熊貓專用CD疫苗[11]。此外市售CD疫苗中的毒株均為弱毒疫苗株。據(jù)報(bào)道，這種CD疫苗可能會(huì)引起犬只的感染與發(fā)病，特別是一些易受感染的野生動(dòng)物，對大熊貓來說并不安全[12]。因此，急需探索研制新型安全、高效的大熊貓CD專用疫苗。

腺病毒作為一種病毒載體已普遍用于基因疫苗等領(lǐng)域，且優(yōu)點(diǎn)多：首先宿主的范圍很廣泛；其次是基因組背景信息清晰，易于構(gòu)建及包裝，插入的外源基因可以為大片段的[13]；另外，重組病毒滴度高；表達(dá)的產(chǎn)物可以刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫、細(xì)胞免疫[14-15]和黏膜免疫[16-17]反應(yīng)等；還可同其他載體進(jìn)行聯(lián)合免疫[18]；腺病毒載體疫苗還有一大優(yōu)點(diǎn)是可制成不同的劑型延長保存期，如口服[19]、凍干粉等劑型，無需佐劑[20]。大熊貓作為珍稀野生動(dòng)物，CD免疫的候選疫苗研制應(yīng)優(yōu)先思量其安全性。本研究選用了缺失人5型腺病毒復(fù)制必須的E1基因的復(fù)制缺陷型腺病毒載體，使拯救后所得重組病毒無法在機(jī)體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制增殖，大大提高了弱毒疫苗的安全性。

CDV的囊膜是由1個(gè)膜蛋白M和2個(gè)表面糖蛋白H(血凝素)和F(融合)蛋白組成。其中H蛋白是CDV及其動(dòng)物宿主的關(guān)鍵蛋白。H蛋白介導(dǎo)CDV病毒粒子與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合誘發(fā)感染，所以針對H蛋白研究是宿主預(yù)防CDV感染的關(guān)鍵。Ge等[21]構(gòu)建了表達(dá)血凝素(H)或融合蛋白(F)的重組新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)：rLa-CDVH和rLa-CDVF，并選用對CDV易感的動(dòng)物水貂(Neovisonvison)進(jìn)行免疫評估，結(jié)果顯示rLa-CDVH誘導(dǎo)了針對CDV顯著的中和抗體(NA)，并對CDV強(qiáng)毒攻擊提供了有力保護(hù)；相反，rLa-CDVF誘導(dǎo)CDV的NA很低，無法抵抗CDV強(qiáng)毒的攻擊。Wang等[22]利用反向遺傳學(xué)技術(shù)制備1種新的基于狂犬病毒(RV)的疫苗載體，該疫苗載體表達(dá)了CDVH基因，即重組病毒LBNSE-CDV-H。試驗(yàn)選用犬來進(jìn)行LBNSE-CDV-H的免疫評估，結(jié)果顯示接種重組病毒LBNSE-CDV-H的犬無任何疾病現(xiàn)象，且可以抵御致命野生型CDV毒株的攻擊。袁穎爍等[23]使用E1和E3基因缺失的商品化RAPAd?CMV腺病毒表達(dá)載體構(gòu)建表達(dá)了含有CDVH基因的人5型重組腺病毒疫苗，對犬一次免疫后，在體內(nèi)產(chǎn)生CDV的NA滴度最高達(dá)28，強(qiáng)于弱毒疫苗組。上述研究表明，H蛋白產(chǎn)生的免疫應(yīng)答抗CDV攻擊的能力很好。

本研究利用腺病毒作為基因工程表達(dá)載體的優(yōu)勢，成功構(gòu)建了表達(dá)大熊貓?jiān)碈DVH基因的重組腺病毒，有望提供一種安全且有較好免疫原性的疫苗候選株。研究采用的是Invitrogen公司的腺病毒表達(dá)系統(tǒng)聯(lián)合Gateway技術(shù)，獲得了重組腺病毒rAd-CDV-H，相較于傳統(tǒng)的同源重組法和常用的AdEasy包裝系統(tǒng)，研究采用的腺病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建更便捷且高效。構(gòu)建的復(fù)制缺陷型人5型重組腺病毒的滴度為1010IFU/mL，通過免疫熒光方法和Western blot鑒定結(jié)果證明，rAd-CDV-H 感染293A細(xì)胞后成功表達(dá)H蛋白；另外，將rAd-CDV-H接種Vero細(xì)胞后，通過IFA鑒定了其在不能復(fù)制的情況下也可以有效地表達(dá)H蛋白，為其應(yīng)用于多種宿主的免疫提供數(shù)據(jù)支撐。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了攜帶大熊貓?jiān)碈DV分離株giant panda/SX/2014H基因的復(fù)制缺陷型人5型重組腺病毒rAd-CDV-H，并證實(shí)了重組腺病毒rAd-CDV-H能夠在體外有效表達(dá)CDV H蛋白。考慮到國寶大熊貓這一物種的特殊性和重要性，考慮可先通過小鼠、兔與狗等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評估其安全性和免疫原性，進(jìn)一步證明該疫苗的有效性與安全性后，再向國家主管部門申報(bào)開展免疫大熊貓的臨床試驗(yàn)，若證明其安全有效，則可將其納入免疫大熊貓的候選疫苗株。