馬繼瓊 孫一丁 楊奕 許明輝

摘要：為了解水稻稻瘟病抗性與土壤根際真菌之間的關(guān)系，利用ITS高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)7個(gè)不同抗稻瘟病水稻品種土壤根際真菌ITS1序列進(jìn)行分析。結(jié)果表明，共檢測(cè)到根際真菌ITS1有效片段486 250個(gè)，以97%的相似度聚為1 178分類操作單位（operational taxonomic unit，簡稱OTU）;物種查詢顯示，歸為12個(gè)門（含1個(gè)未分類的真菌群），35個(gè)綱（含8個(gè)未分類的菌群），82個(gè)目（含12個(gè)未分類的菌群），146個(gè)科（含34個(gè)未分類的菌群），248個(gè)屬（含63個(gè)分類地位未定或未分類的菌群）和362個(gè)種（含63個(gè)未分類種）。7個(gè)土樣真菌門類相似，子囊菌門（Ascomycota）是最大的優(yōu)勢(shì)菌門，相對(duì)豐度為67.04%?？购透械疚敛∑贩N群土樣在稻綠核菌屬（Ustilaginoidea）和稻綠核菌（Ustilaginoidea sp.）上存在顯著性差異（P<0.05），其相對(duì)豐度平均數(shù)分別為5.09%、7.31%，即在稻瘟病病菌侵染條件下抗稻瘟病品種對(duì)稻曲病病原菌稻綠核菌具有抑制作用。結(jié)果可為探尋水稻抗稻瘟病機(jī)制提供土壤微生物的線索。

關(guān)鍵詞：稻瘟病;根際真菌;ITS1序列;測(cè)序

中圖分類號(hào)：S182;S435.111.4+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）12-0075-05

收稿日期：2020-09-23

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金（編號(hào)：31860369）。

作者簡介：馬繼瓊（1969—），女，云南永平人，碩士，副研究員，主要從事作物種質(zhì)資源研究，E-mail：mjq_503@163.com;共同第一作者：孫一?。?979—），男，云南個(gè)舊人，博士，副研究員，主要從事作物種質(zhì)資源研究，E-mai：3182335606@qq.com。

通信作者：許明輝，博士，研究員，主要從事種質(zhì)資源與遺傳育種研究。E-mail：ynxuminghui@163.com。

土壤微生物是土壤中最活躍的部分，在促進(jìn)土壤物質(zhì)、能量轉(zhuǎn)化和地球生物化學(xué)循環(huán)方面發(fā)揮著重要作用[1]。稻田是世界上最大的人工濕地，大量研究表明，稻田土壤微生物的多樣性受到土質(zhì)[2]、耕作方式[3]、施肥[4-7]、農(nóng)藥[8-9]等環(huán)境因素的顯著影響，作物不同的基因型[10-13]甚至同一基因型不同的發(fā)育階段均會(huì)影響土壤微生物的多樣性[14]。在稻田土壤生態(tài)系統(tǒng)中，水稻根系分泌物是影響根際微生物種類及豐度的重要因素。水稻根系分泌物包括有機(jī)酸、維生素、酶、植物生長調(diào)節(jié)劑和氨基酸，為植物根際微生物的生長和繁殖提供了良好的生長環(huán)境和充足的養(yǎng)分，分泌物組成或某些成分?jǐn)?shù)量的變化可能會(huì)改變根際微生物的種類和數(shù)量[11-12]。隨著微生物的生長，根際微生物又會(huì)對(duì)水稻的磷和氮利用效率、化感作用和稻米品質(zhì)產(chǎn)生影響[10，15]。真菌是土壤微生物的重要組成部分，參與植物殘?bào)w的分解，推動(dòng)土壤養(yǎng)分的循環(huán)[16]，對(duì)環(huán)境污染物有指示作用[17]，同時(shí)也受到植物的影響[18]。因此，植物土壤根際真菌的多樣性是研究植物與土壤微生物之間關(guān)系的重要內(nèi)容之一。

微生物多樣性的研究方法可大致分為2類：一種是傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離方法，其主要通過不同的培養(yǎng)基來分離微生物。另一種是分子鑒定方法，利用磷脂脂肪酸、RNA或DNA等指示劑分子的特征來分析微生物的生態(tài)多樣性[19]。目前環(huán)境中能培養(yǎng)的微生物僅占總微生物的1%～10%[20-21]，傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法僅反映在此條件下存活的這部分微生物的具體信息，因此傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法用于反映土壤微生物的多樣性具有一定的局限。分子鑒定方法克服了傳統(tǒng)分離方法的局限性，在分子水平上揭示了土壤微生物種類和遺傳多樣性。 ITS基因存在于所有真菌的基因組中，分布于18S、5.8S、80S間，包含ITS1和ITS2區(qū)，中度保守，已被廣泛應(yīng)用于土壤微生物的遺傳多樣性分析[22-25]。

稻瘟病由稻瘟病原菌引起，在水稻全生育期中均可發(fā)病，該病遍布于全世界稻區(qū)，是稻作生產(chǎn)中最具破壞性的病害之一。在稻田生態(tài)系統(tǒng)中，環(huán)境條件的變化可能會(huì)影響微生物群落的多樣性，微生物群落的生長也會(huì)在一定程度上改變環(huán)境并影響水稻。水稻對(duì)葉稻瘟的抗性是包括葉面附生微生物在內(nèi)的許多因素相互作用的結(jié)果[26]。但水稻抗病性與土壤微生物之間的關(guān)系鮮有報(bào)道。分析不同抗性水稻品種根際微生物群落的結(jié)構(gòu)和豐度，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)一些抗性機(jī)制的線索。本研究利用ITS高通量測(cè)序技術(shù)分析7種不同抗稻瘟病水稻品種根際土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和豐度。

1 材料與方法

1.1 水稻品種和稻瘟病的自然誘發(fā)

田間試驗(yàn)于2019年4—10月在云南省昆明市宜良縣進(jìn)行，試驗(yàn)田為肥力均勻的水田，前茬作物為大白菜。根據(jù)多年的鑒定，選擇7個(gè)對(duì)葉瘟具有不同抗性的水稻品種（表1）在同一田塊種植，以確保每個(gè)品種的試驗(yàn)條件相同。試驗(yàn)小區(qū)面積為20 m2（4 m×5 m），每個(gè)小區(qū)種植1個(gè)品種。通過重施氮肥（525 kg/hm2 尿素）、密集種植行距（20 cm×10 cm），不使用任何殺菌劑，并在小區(qū)四周種植易感品種蒙古稻進(jìn)行葉瘟的自然誘發(fā)。到孕穗期葉瘟病癥充分顯現(xiàn)后，按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)查分級(jí)（GB/T 15790—2009稻瘟病測(cè)報(bào)調(diào)查規(guī)范）品種抗性劃分標(biāo)準(zhǔn)）。

1.2 土壤樣品采集

在水稻種植之前，從試驗(yàn)田的5個(gè)點(diǎn)（梅花狀）采集混合土壤樣品，并在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與測(cè)試技術(shù)研究所對(duì)土壤的基本特性進(jìn)行測(cè)試。土壤較為肥沃，基本特征如下：pH值為7.35，有機(jī)質(zhì)含量為23.31 g/kg，堿性氮含量為85.31 mg/kg，速效磷含量為89.13 mg/kg，速效鉀含量為46.21 mg/kg。

水稻移栽后一直在土壤淹水條件下種植，為便于取土壤樣品，在水稻孕穗期（8月12日）采集土壤樣品時(shí)放干水。在每個(gè)品種試驗(yàn)小區(qū)中，帶土取5個(gè)水稻植株，用刀削去四周土壤，保留植株根系周圍5 cm土壤，在離表層約10 cm處取土樣，將5個(gè)水稻植株土樣均勻混合。后將樣品置入液氮中保存，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行土壤DNA提取，并進(jìn)行測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。

1.3 DNA提取和PCR擴(kuò)增

使用E.Z.N.A. soil DNA Kit （Omega Bio-tek，Norcross，GA，美國） 土壤DNA提取試劑盒，按照說明書對(duì)7個(gè)土壤樣品微生物群落基因組DNA進(jìn)行提取。在1%瓊脂糖凝膠上檢查DNA質(zhì)量，并用Nano Drop 2000紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度和純度。使用引物ITS1-F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2-R（5′-TGCGTTCTTCATCGATGC-3′）[27]在ABI Gene Amp9700 PCR儀上擴(kuò)增真菌rDNA 的ITS1序列。具體擴(kuò)增程序如下：95 ℃變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 45 s，擴(kuò)增程序包括34個(gè)循環(huán);最后于72 ℃延伸10 min，并于4 ℃保存。 PCR混合物包含4 μL 5×Trans Start Fast Pfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL正向引物（5 μmol/L），0.8 μL反向引物（5 μmol/L），0.4 μL Trans Start Fast Pfu DNA聚合酶，模板1 μL DNA（10 ng/μL），最后添加ddH2O至總體積40 μL。該反應(yīng)體系重復(fù)3次。

1.4 Illumina Miseq測(cè)序

將來自相同樣本的PCR產(chǎn)物混合，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后純化回收?；厥债a(chǎn)物經(jīng)Quantus Fluorometer （Promega，美國） 定量檢測(cè)合格后，使用NEXTFLEXRapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫：（1）接頭鏈接;（2）利用磁珠吸附篩選，去除接頭自連片段;（3）對(duì)文庫模板利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行富集;（4）利用磁珠進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收，得到文庫。然后在Miseq PE300（Illumina，美國）平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.5 測(cè)序數(shù)據(jù)的處理

將原始的ITS1測(cè)序讀段通過Trimmomatic進(jìn)行質(zhì)量過濾并通過FLASH合并，并遵循以下標(biāo)準(zhǔn)：（1）在50 bp滑動(dòng)窗口中，任何平均質(zhì)量得分小于20的位點(diǎn)均截短了300 bp讀段，并且短于50 bp截短的讀段將被丟棄，包含歧義字符的讀段也將被丟棄;（2）根據(jù)重疊序列，針對(duì)長于10 bp的重疊序列進(jìn)行組裝，無法組裝的讀物將被丟棄;（3）根據(jù)條形碼和引物區(qū)分樣品，并調(diào)節(jié)序列方向，精確的條形碼匹配，引物匹配中的2個(gè)核苷酸錯(cuò)配，使用UPARSE（7.1版，http：//drive5.com/uparse/）對(duì)具有97%相似性截止值的操作分類單位（OTU）進(jìn)行聚類，鑒定并去除了嵌合序列。利用RDP分類器（http：//rdp.cme.msu.edu/）在數(shù)據(jù)庫UNITE（version 8.0）中依次對(duì)單個(gè)OTU代表序列進(jìn)行查詢分類，置信度閾值為0.7。使用DPS軟件進(jìn)行顯著性測(cè)試。

2 結(jié)果與分析

2.1 7個(gè)水稻品種葉瘟抗性

孕穗期對(duì)7個(gè)水稻品種進(jìn)行葉瘟抗性調(diào)查，由表1可知，誘發(fā)品種蒙古稻表現(xiàn)高感（HS），說明稻瘟病誘發(fā)成功，其他6個(gè)品種具有高抗（HR）到高感（HS）不同的抗性，抗性鑒定結(jié)果與以往結(jié)果一致，說明這幾個(gè)品種抗性穩(wěn)定。根據(jù)葉瘟抗性可將7個(gè)品種分為抗感2群，其中岫粳12號(hào)（HR）、濟(jì)稻8號(hào)（HR）、楚粳42號(hào)（MR）為抗性群，松遼5號(hào)（MS）、藤系144號(hào)（HS）、蒙古稻（HS）、南29（HS）為易感群。

2.2 7個(gè)土壤樣品的多樣性指數(shù)

7個(gè)樣品測(cè)序覆蓋度均超過 99.95%，表明測(cè)序深度足夠，滿足后續(xù)分析。通過過濾和連接等步驟，從7個(gè)土壤樣品中獲得了486 250（個(gè)）有效片段，以97%的相似度聚為1 178分類操作單位OTU，平均長度為219 bp。其中有很大一部分OUT豐度小，僅在部分樣品中出現(xiàn)，每個(gè)樣本只能檢測(cè)到其中一部分OUT，范圍為312～567個(gè)（表1：Sob指數(shù)）。樣品間Shannon指數(shù)數(shù)值相似，Simpson（1-D）指數(shù)非常低（表1），表明樣品間多樣性并不存在較大的差異，根際真菌群落是多樣的。

物種注釋顯示，在7個(gè)土壤樣品中檢測(cè)到12個(gè)門（包含1個(gè)未分類的真菌群），35個(gè)綱（包含8個(gè)未分類的菌群），82個(gè)目（包含12個(gè)未分類的菌群），146個(gè)科（包含34個(gè)未分類的菌群），248個(gè)屬（包含63個(gè)分類地位未定或未分類的菌群）和362個(gè)種（包含63個(gè)分類地位種）?？梢?，本試驗(yàn)中稻田土壤真菌多樣性較為豐富。

2.3 真菌群落的結(jié)構(gòu)和豐度差異

門水平上，各樣品真菌群落結(jié)構(gòu)組成較相似（圖1）。子囊菌門（Ascomycota）是最大的優(yōu)勢(shì)菌門，平均相對(duì)豐度為67.04%，其他門相對(duì)豐度依次為羅茲菌門（Rozellomycota） 8.78%、被孢霉門（Mortierellomycota）5.41%、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）1.45%、梳霉門（Kickxellomycota）1.16%、油壺菌門（Olpidiomycota）0.96%、壺菌門（Chytridiomycota）0.64%、球囊菌門（Glomeromycota）0.52%、捕蟲霉門（Zoopagomycota）0.09%、芽枝霉門（Blastocladiomycota）0.07%、單毛壺菌門 （Monoblepharomycota）0.01%。其中，球囊菌門、芽枝霉門、單毛壺菌門并未在所有樣品中檢測(cè)到，僅在3～5個(gè)樣品中出現(xiàn)。未分類的真菌（p__unclassified_k__Fungi）豐度為13.88%，占比較大。

綱水平上，其中相對(duì)豐度大于1%的有糞殼菌綱（Sordariomycetes）56.21%、 未分類的真菌菌群（unclassified_k__Fungi）13.86%、未分類的隱真菌門菌群（unclassified_p__Rozellomycota）7.51%、被孢霉綱（Mortierellomycetes）5.39%、散囊菌綱（Eurotiomycetes） 3.97%、 座囊菌綱（Dothideomycetes）2.71%、 錘舌菌綱 （Leotiomycetes） 2.16%、分類地位未定羅茲菌群（Rozellomycotina_cls_Incertae_sedis）1.27%、Harpellomycetes 1.16%、未分類的子囊菌群體（unclassified_p__Ascomycota）1.04%;在相對(duì)豐度小于1%的綱或菌群中有17個(gè)相對(duì)豐度極低，范圍在0.000 775%～0.500 000%之間，僅在部分樣品中（1～6個(gè)）出現(xiàn)。經(jīng)平均數(shù)顯著性測(cè)驗(yàn)，抗感稻瘟病品種群間在門、綱、目、科水平上相對(duì)豐度均沒有顯著性差異。

屬水平上，相對(duì)豐度大于1%的共有12個(gè)屬（其中含有3個(gè)未分類菌群）（表2）。在相對(duì)豐度小于1%的236個(gè)屬（含分類地位未定或未分類菌群）中有185個(gè)相對(duì)豐度極低，僅在部分樣品中（1～6個(gè)）出現(xiàn)。經(jīng)顯著性測(cè)驗(yàn)，抗稻瘟病和感稻瘟病品種群間在稻綠核菌屬（Ustilaginoidea）上存在顯著性差異（P<0.05），其相對(duì)豐度平均數(shù)分別為5.09%、7.31%。進(jìn)一步分析表明，7個(gè)樣品檢測(cè)到362個(gè)種（包含95個(gè)分類地位未定或未分類菌種），抗稻瘟病和感稻瘟病品種群間僅在稻綠核菌上存在顯著性差異（圖2）（P<0.05）。

3 討論與結(jié)論

已有的研究表明，我國不同生態(tài)區(qū)水稻土壤真菌不僅在門類上存在差異，各菌門比例（豐度）上也存在差異，土壤功能肯定也存在差異。重慶[22]、湖南[23]、江蘇[24]等地稻田土壤真菌門類相對(duì)簡單，僅含有3～5門的菌群;子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）是共有的，其中子囊菌門是最大的菌門，一般占比在42.59%以上;而烏魯木齊市水稻根際土壤共檢測(cè)出11 個(gè)門的真菌，種類較為豐富，子囊菌門也是最大的菌門，但卻沒有上述3個(gè)地區(qū)中共有的接合菌門[25]。本研究田塊7個(gè)土壤樣品檢測(cè)到11門和1個(gè)未分類的真菌群，門類相對(duì)上述地區(qū)較為豐富，子囊菌門也是優(yōu)勢(shì)門，其中隱真菌門（Rozellomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、梳霉門（Kickxellomycota）、油壺菌門（Olpidiomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、捕蟲霉門（Zoopagomycota）、芽枝霉門（Blastocladiomycota）、單毛壺菌門（Monoblepharomycota）是江蘇、湖南、重慶等地水稻土沒有的，而梳霉門、捕蟲霉門、芽枝霉門是烏魯木齊市也沒有的，但該田塊卻沒檢測(cè)到接合菌門菌群，也未檢測(cè)到烏魯木齊市有的輪形動(dòng)物門（Rotifera）。造成這種水稻土壤菌門差異的原因有很多，其中生態(tài)區(qū)不同和土質(zhì)不同可能是最大的影響因素，而輪作、施肥等措施一般僅改變菌門的豐度比例[22-25]。值得一提的是，真菌檢測(cè)方法可能是造成這種差異的原因之一;上述研究均基于ITS1的研究，檢測(cè)方法基本相同，但分類查詢的真菌ITS數(shù)據(jù)庫版本不同也可能造成檢測(cè)結(jié)果的差異。本研究用真菌ITS1序列進(jìn)行真菌種類和豐度分析，可將大多數(shù)真菌進(jìn)行分類，但在各水平上仍有一定比例未分類的菌群，說明本試驗(yàn)田塊真菌種類較為豐富，可能存在一些未知的菌群，但也反映出ITS1序列的局限。本研究中，稻綠核菌屬只檢測(cè)到一個(gè)OUT，且比例高達(dá)真菌總量的6.36%，查詢結(jié)果為Ustilaginoidea sp.，序列與稻曲病病原菌稻綠核菌（U. virens）和稻白色綠核菌（U. albicans）相應(yīng)序列均100%相同，而這是2個(gè)不同的種[28]，無法將2個(gè)種分開。可見，需要其他序列如ITS2加入或其他方法補(bǔ)充才能進(jìn)行更為精確的分類研究。

該稻田多年以來均是由筆者進(jìn)行水稻資源鑒定，每年稻曲病均有不同程度的發(fā)生，稻曲病病菌落入土中越冬，所以土壤中檢測(cè)到稻曲病病菌不足為奇，證明稻曲病病原菌主要來源于土壤中。有趣的是抗感稻瘟病品種群之間存在顯著性差異，抗稻瘟病品種具有抑制稻綠核菌的作用。參試品種均種植在同一田地上，所有環(huán)境條件均相同，只是水稻基因型不同，即對(duì)葉瘟的抗性不同。所以筆者推測(cè)水稻品種對(duì)稻瘟病和稻曲病存在某些共同的抗菌機(jī)制，品種在受到稻瘟病病菌侵襲的情況下，其根系可能分泌某些特殊成分，選擇性地抑制了稻曲病菌，并改變了它們的豐度。作為回報(bào)，稻曲病病菌可能對(duì)水稻品種對(duì)葉瘟的抗性具有促進(jìn)或抑制作用。這是一個(gè)值得進(jìn)一步研究的課題。試驗(yàn)中未能檢測(cè)到主要真菌性病害的紋枯病菌（Thanatephorus cucumeris）、稻瘟病菌（Pyricutaria orazae）、惡苗病菌（Fusarium moniliforme），說明這3種主要病害的病原物不存在土壤來源。

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