劉曹彤 陸依琳 徐慧 彭學

摘要：對羥基苯甲酸（4-Hydroxybenzoate，4HBA）應用廣泛，在工業(yè)領(lǐng)域上被當作前體合成各種芳香族化合物，其中包括液晶材料、農(nóng)藥等;在食品和化妝品等領(lǐng)域上被當作防腐劑。微泡菌屬（Microbulbifer sp.） A4B-17是一種能將葡萄糖合成4HBA的海洋細菌，為了提高4HBA的合成效率對合成莽草酸途徑前體的2個關(guān)鍵酶：GM004356編碼的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）和GM0031333編碼的烯醇化酶（Enolase）進行研究。通過構(gòu)建蛋白系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)，PEPCK與Microbulbifer sp. GL-2的PEPCK相似度為95.15%，Enolase與Microbulbifer variabilis的Enolase相似度為98.13%。利用低溫表達載體在大腸桿菌中對2個酶進行高效表達，提取和純化后，采用BCA法蛋白定量計算后得到純化后的PEPCK和Enolase分別占各自粗酶液的1.304%和1.123%。酶活采用PK/LDH（丙酮酸激酶/乳酸脫氫酶）偶聯(lián)檢測法檢測NADPH的減少量。根據(jù)米氏常數(shù)雙倒數(shù)法求得PEPCK和Enolase的Km值分別為0.041 mmol/L和0.056 mmol/L，PEPCK反應的最適溫度為30 ℃，最適pH值為7，Enolase的最適溫度為 30 ℃，最適pH值為7。以上結(jié)果為高效生產(chǎn)4HBA提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：對羥基苯甲酸;磷酸烯醇式丙酮酸;烯醇化酶;磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶

中圖分類號：S188+.3 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）12-0045-06

收稿日期：2020-11-04

基金項目：江蘇師范大學科研創(chuàng)新計劃校立項目（編號：2020XKT485）。

作者簡介：劉曹彤（1996—），女，江蘇淮安人，碩士研究生，主要從事環(huán)境微生物學研究。E-mail：3220859786@qq.com。

通信作者：彭學，博士，教授，主要從事環(huán)境微生物學研究。E-mail：pengxue@jsnu.edu.cn。

對羥基苯甲酸（4-Hydroxybenzoate，4HBA）及其酯類物質(zhì)，不僅能抑制真菌和細菌的生長，還能調(diào)節(jié)一些酶的代謝，應用非常廣泛[1]，覆蓋了衣食住行各個方面，比如用于食品與化妝品的防腐劑、農(nóng)業(yè)中的殺菌劑與化肥、手機電腦等的液晶制品等方面[2-6]。4HBA的毒性較低，抑菌效果也好，所以在2002年，對羥基苯甲酸酯類物質(zhì)已經(jīng)被我國批準作為食品防腐劑添加使用[7]。

目前大部分4HBA通過石油分餾[8]得到，也有報道利用植物[9]或者重組大腸桿菌[10]合成4HBA，但是這些方法存在很多的缺陷，植物合成得到的4HBA提純難度大[11]。微泡菌屬（Microbulbifer sp.） A4B-17菌株是能將葡萄糖合成4HBA及其酯類的海洋細菌，筆者所在課題組已經(jīng)完成了A4B-17菌株的基因組測序和注釋[12]。合成4HBA的途徑有2條：葡萄糖降解途徑和莽草酸途徑，在后者途徑中磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和4-磷酸赤蘚糖縮合反應生成3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶（DAHP），PEP的合成量較低成為莽草酸途徑的限速步驟。A4B-17菌株合成PEP的途徑有2條：2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸途徑（ED途徑）和糖酵解途徑（EMP途徑）。在ED途徑中，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）將草酰乙酸（OAA）脫羧生成PEP;在EMP途徑中烯醇化酶（Enolase）將2-磷酸甘油酸（OAA）脫水生成PEP。EMP途徑和ED途徑[13]的共同點是將合成PEP作為通路的最后一步反應。同時在之后的合成途徑中，PEP作為起始物質(zhì)，4HBA及其酯類合成多少完全取決于它的積累量[14]?？梢哉f要想大量合成4HBA及其酯類，就需要大量合成PEP。A4B-17菌株的PEPCK和Enolase這2個酶分別由編號為GM004356和GM001333的基因編碼，而且在該細菌體內(nèi)，有且只有這2種酶能夠合成PEP，因此對這2個基因編碼的蛋白酶的研究是非常有必要的。對這2個酶的研究不僅能了解它們的理化性質(zhì)，還能夠為提高PEP的產(chǎn)量提供理論基礎(chǔ)，從而為提高4HBA的產(chǎn)量打下基礎(chǔ)[15]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

Microbulbifer sp. A4B-17菌株（由筆者所在課題組從海水中分離得到，并保存于江蘇師范大學生命科學學院）;大腸桿菌DH5α（筆者所在實驗室長期保存于 -80 ℃ 超低溫冰箱中）;pET-21a（+）載體（購買自武漢淼靈生物科技有限公司）。

1.2 試驗試劑

Q5 High-Fidelity DNA Polymerase，5×Q5 High GC Enhancer（optional），5×Q5 Reaction Buffer，dNTP Mix，dd Water，LB肉湯，100 mg/mL Ampicillin（Amp）母液，50×TAE Buffer（pH值8.5），1%瓊脂糖凝膠，DNA marker，DNA loading buffer，GoldView核酸染料，質(zhì)粒提取相關(guān)試劑[16]，磷酸緩沖液PBS母液（0.2 mol/L），0.1 mol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），30% （質(zhì)量濃度）丙烯酰胺溶液（Acr-Bis），10%（質(zhì)量濃度）過硫酸銨，5×Tris-Glycine Buffer（電泳緩沖液），1 mol/L Tris-HCl（pH值為6.8），1.5 mol/L Tris-HCl（pH值為8.8），10% SDS考馬斯亮藍R-250染色液，考馬斯亮藍脫色液，5×SDS-PAGE loading Buffer，β-巰基乙醇（β-ME），蛋白純化試劑盒等。

1.3 GM004356和GM001333編碼基因的克隆與鑒定

1.3.1 目的片段的擴增

首先分別設計GM004356和GM001333這2個目的基因的引物，引物設計見表1，引物序列交由上海捷瑞生物工程有限公司合成。設計PCR反應體系，加入PCR管中，混勻，放入PCR儀，設置好反應條件，運行程序。35次循環(huán)。

1.3.2 載體酶切

選擇pET-21a（+）載體，大小為5 443 bp，酶切位點為BamHⅠ和XhoⅠ，采用雙酶切，載體酶切后，需要將目的基因與載體進行連接，形成重組質(zhì)粒。選擇的酶連試劑盒為Ready-to-Use Seamless Cloning Kit?？偡磻w系為 50 μL，混合均勻后于37 ℃水浴5 min。

1.3.3 陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒提取

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，培養(yǎng)結(jié)束后，挑取部分單菌落進行液體培養(yǎng)，然后利用十二烷基硫酸鈉（SDS）堿裂法提取質(zhì)粒。

1.3.4 陽性轉(zhuǎn)化子酶切鑒定

將酶切體系加到PCR管中，混合均勻，放入37 ℃水浴鍋中孵育5～10 min，然后瓊脂糖凝膠電泳驗證結(jié)果。

1.4 PEPCK和Enolase的表達與酶活探究

1.4.1 粗酶提取

將活化好的菌落接入含氨芐青霉素（Amp）的LB三角瓶中，37 ℃，180 r/min，培養(yǎng)至吸光度為0.4～0.6，再加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）低溫低速誘導培養(yǎng)12～24 h，使目的蛋白充分表達。將培養(yǎng)好的菌液5 000 r/min，低溫離心10 min，棄上清，用pH值為7.4的PBS緩沖液（磷酸緩沖鹽溶液）重懸細胞，再離心，再重懸，用超聲波破碎儀破碎細胞，4 ℃ 離心，上清即為粗酶混合液。

1.4.2 蛋白純化

提取出的粗酶中，絕大部分是不需要的雜蛋白，想要研究目的蛋白的性質(zhì)，需要將目的蛋白提取出來，選擇蛋白純化試劑盒進行純化。為了給后續(xù)試驗提供一個定量結(jié)果，需要計算出粗酶中PEPCK和Enolase的含量。采用BCA（聚氰基丙烯酸正丁酯）蛋白定量法，根據(jù)吸光度與蛋白濃度成正比，繪制蛋白濃度標準曲線，從而能夠計算出目的蛋白占粗酶的百分比。

1.4.3 PEPCK和Enolase酶活檢測方法

PEPCK和Enolase酶活檢測方法采用PK（丙酮酸激酶）/LDH（乳酸脫氫酶）偶聯(lián)檢測法，即將不方便檢測的磷酸烯醇式丙酮酸，經(jīng)PK和LDH催化后，生成丙酮酸，然后與還原型輔酶Ⅱ（NADPH）反應生成NADP+，而NADPH容易被檢測，NADPH濃度的減少量與PEPCK和Enolase的活性成正相關(guān)，通過測定在340 nm處NADPH吸光度的減少，來反映酶的活性。

根據(jù)PK/LDH偶聯(lián)檢測法探究2個酶的最適溫度和最適pH值。研究PEPCK的最適溫度，要控制pH值、反應時間、調(diào)控劑不變。設置不同反應溫度，固定pH值不變;研究PEPCK最適pH值時，要控制溫度、反應時間、調(diào)控劑不變，各反應成分與研究最適溫度時一致，只是改變緩沖液的pH值不同。用同樣的方法來探究Enolase的最適溫度和最適pH值。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)進化樹分析

在Microbulbifer sp. A4B-17菌株中找到編號為GM004356和GM001333的全部堿基序列，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對分析，確定這2個基因分別編碼PEPCK和Enolase。GM004356編碼的PEPCK與Microbulbifer sp. GL-2、Microbulbifer sp. THAF38和Microbulbifer variabilis編碼的PEPCK相似度較高，相似度都為95.15%，系統(tǒng)進化樹見圖1。GL-2菌株分離自硬骨魚腸道中[17]，是一個新的降解纖維素的菌株。Microbulbifer variabilis分離自太平洋海藻，能夠產(chǎn)生抗癌吩嗪抗生素[18]。關(guān)于THAF38菌株還沒有相關(guān)報道。GM001333編碼的Enolase與Microbulbifer variabilis和Microbulbifer sp. THAF38的Enolase相似度較高，相似度都為98.13%，系統(tǒng)進化樹見圖2。

2.2 高效表達質(zhì)粒的構(gòu)建

2個目的基因GM004356和GM001333分別進行PCR，瓊脂糖凝膠成像分析（圖3）。選用pET-21a（+）載體，采用雙酶切，與目的基因相連，構(gòu)成重組質(zhì)粒，導入大腸桿菌體內(nèi)。通過驗證，獲得陽性轉(zhuǎn)化子，并測序，與原始目的基因比對，發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒中的目的基因未發(fā)生突變或缺失，與原始基因完全一致，可以利用該菌落進行后續(xù)的蛋白研究。

2.3 蛋白質(zhì)的提取和純化

低溫低速誘導目的蛋白表達，提取粗酶，電泳初步判斷轉(zhuǎn)入大腸桿菌的目的基因成功表達，接著對粗酶進行純化，電泳驗證純化結(jié)果，發(fā)現(xiàn)目的蛋白PEPCK和Enolase均能被純化，且效果明顯，可以進行后續(xù)的定性分析，具體結(jié)果見圖4和圖5。

將粗酶液稀釋10倍后用BCA法測得樣品吸光度為2.526 4，通過標準曲線， 計算出粗酶液中蛋白總濃度為3.298 mg/mL。純化之后目的蛋白PEPCK吸光度為0.337，根據(jù)標準曲線，計算出純化后的PEPCK濃度為0.043 mg/mL，占粗酶液的1.304%。同樣的方法，得到Enolase占粗酶液的1.123%。

2.4 PEPCK和Enolase米式常數(shù)的研究

米氏常數(shù)（Km）定義為當酶促反應達最大速度（vm）一半時底物（S）的濃度。對Km的研究，能揭示其在參加反應時的重要性質(zhì)，為該酶應用到工業(yè)生產(chǎn)中提供重要的理論依據(jù)。根據(jù)米氏常數(shù)雙倒數(shù)求法的計算公式：1/v=Km/（vmax[S]）+1/vmax，可以看成y=ax+b的形式，需要做出初始反應速率的倒數(shù)，以及反應底物濃度的倒數(shù)，設定反應時間為 2 min，底物濃度足夠大。因為當y=0時，橫截距即為-1/Km，得到PEPCK的Km值為0.041 mmol/L，如圖6-A所示。Enolase的Km值為0.056 mmol/L，如圖6-B所示。2個Km值都較低，說明PEPCK與OAA，Enolase與底物2-磷酸甘油（PGA）的酶促反應很容易進行，從而轉(zhuǎn)化生產(chǎn)磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），因此更有利于重要中間產(chǎn)物PEP在菌體中的積累。

2.5 最適溫度和最適pH值

探究PEPCK的最適溫度，設置不同反應溫度，固定pH值保持不變，反應結(jié)束后測定NADPH的吸光度，結(jié)果見圖7，發(fā)現(xiàn)在30 ℃左右時，PEPCK活性最高。探究最適pH值時，設置不同pH值，保持溫度為30 ℃，發(fā)現(xiàn)pH值為7時酶活最高（圖8）。

同樣的方法，分別設置Enolase的反應溫度和緩沖液pH值，發(fā)現(xiàn)Enolase的最適反應溫度為30 ℃，最適pH值為7，結(jié)果如圖9和圖10所示。

3 討論與結(jié)論

Microbulbifer sp. A4B-17菌株的特點是本身就可以合成對羥基苯甲酸及其酯類，而且產(chǎn)量較高，不會產(chǎn)生對人體有毒有害的物質(zhì)。本研究對細菌細胞內(nèi)編號為GM004356和GM001333的2個目的基因進行轉(zhuǎn)化克隆，高效表達PEPCK和Enolase，通過提取純化計算出純化之后目的蛋白PEPCK占粗酶液的1.304%，純化后的Enolase占粗酶液的1.123%。PEPCK酶反應的最適溫度為30 ℃。最適pH值為7;Enolase的最適溫度為30 ℃，最適pH值為7。PEPCK和Enolase的米氏常數(shù)分別是0.041、0.056 mmol/L，較低的Km值更有利于酶促反應的快速進行。通過蛋白系統(tǒng)進化樹分析，PEPCK與Microbulbifer sp. GL-2的PEPCK相似度為95.15%;Enolase與Microbulbifer variabilis的Enolase相似度為98.13%。本研究對PEPCK和Enolase 2種酶進行深入研究，為將來2個酶的優(yōu)化研究建立標準。筆者所在課題組期望通過對該菌株的深入研究，改變傳統(tǒng)的生產(chǎn)方式，利用可再生資源合成4HBA等工業(yè)原料。

本試驗所采用的酶活性研究方法均為PK/LDH酶偶聯(lián)法，該方法雖操作簡單，思路清晰，但是在偶聯(lián)法中，PK以及LDH的活性會對整個試驗結(jié)果產(chǎn)生較大影響，而且最終得到的米氏常數(shù)其實是目的蛋白酶與PK、LDH共同作用的結(jié)果。目前對PEP的檢測暫無有效可行的方法，開辟一種新的檢測方法還需要大量工作，后續(xù)可以在本研究的基礎(chǔ)上進行拓展研究。

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