黃鳳羽，張海玲，王永鵬，王 哲,*，易發(fā)成，曾 錚

(1.西南科技大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621010；2.中國(guó)工程物理研究院 材料研究所，四川 江油 621700)

鈾礦開(kāi)采和礦山尾礦會(huì)對(duì)鄰近地下水造成鈾污染，其鈾含量高達(dá)50 mg/L[1]。由于鈾的重金屬毒性和放射性危害，含鈾地下水的處理一直以來(lái)都受到廣泛關(guān)注。傳統(tǒng)的處理方式主要是物理化學(xué)方法(混凝沉淀法[2]、離子交換法[3]、吸附法[4]、膜分離法[5]等)，在去除含鈾地下水的同時(shí)通常有難以再生或二次污染等缺點(diǎn)[6-7]。微生物原位處理技術(shù)有原料充足、成本低、處理效率高、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到人們的重視[8-10]。微生物對(duì)鈾的去除已有廣泛的研究，厭氧顆粒污泥[11]、硫酸鹽還原菌、希瓦氏菌和假單胞菌等[12-14]都被證明對(duì)降低地下水中的鈾濃度具有長(zhǎng)期有效性。微生物固定鈾的4個(gè)基本機(jī)制為：1) 微生物將U(Ⅵ)還原沉淀為U(Ⅳ)；2) 細(xì)胞對(duì)U(Ⅵ)的吸收和積累；3) 微生物細(xì)胞表面對(duì)鈾的吸附；4) 細(xì)胞釋放的無(wú)機(jī)磷酸鹽與U(Ⅵ)配位沉淀[15-17]。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 主要試劑與儀器

腐敗希瓦氏菌(22940)，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；DOWEX MARATHON C陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(CER，20～50目)、乳酸鈉(99.0%)，美國(guó)Sigma-Aldrich；UO2SO4·3H2O(99.99%)，湖北楚盛威化工有限公司，配制成2 200 mg/L U(Ⅵ)儲(chǔ)備液。其他試劑均為市售分析純，所有溶液均采用Milli-Q水制備。

模擬地下水溶液的配制參照文獻(xiàn)[11]，包括礦物元素和微量元素，具體如下：NH4HCO3，5 mg/L；K2HPO4，2 mg/L；MgCl2，2.1 mg/L；Ca(OH)2，1 mg/L；酵母提取物，0.33 mg/L；H3BO3，0.5 μg/L；FeSO4·7H2O，28 μg/L；ZnSO4·7H2O，1.1 μg/L；CuSO4·5H2O，1.6 μg/L；MnSO4·H2O，2.5 μg/L；(NH4)6Mo7O24·4H2O，2.0 μg/L；KAl(SO4)2·12H2O，1.75 μg/L；CoSO4·7H2O，23.6 μg/L；NiSO4·6H2O，1.13 μg/L；Na2SeO3·5H2O，1 μg/L；Na2WO4·2H2O，5.2 μg/L；EDTA，10 μg/L。將模擬地下水溶液壓力滅菌20 min，冷卻至室溫后加入1 g/L NaHCO3溶液，將pH值調(diào)至7.0。U(Ⅵ)在地下水中的絡(luò)合形態(tài)主要是碳酸氫鹽結(jié)合態(tài)，因此用NaHCO3溶液作為模擬地下水溶液的緩沖溶液[13]，最后充氮?dú)?0 min除去溶解氧。

NEXION 350電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、Nicolet-5700傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)，美國(guó)Perkin Elmer公司；D3024臺(tái)式高速微量離心機(jī)，美國(guó)賽洛捷克。

1.2 腐敗希瓦氏菌培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下將保存的腐敗希瓦氏菌液按2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接到盛有培養(yǎng)基(組成為：胰蛋白胨，15 g；酵母提取物，5 g；氯化鈉，5 g；水，1 L)的錐形瓶?jī)?nèi)，再置于恒溫振蕩器中(30 ℃，150 r/min)培養(yǎng)18 h，培養(yǎng)好的菌液以8 000 r/min離心5 min，之后用0.1 mol/L NaCl溶液洗滌2次。

1.3 腐敗希瓦氏菌對(duì)U(Ⅵ)的固定

所有實(shí)驗(yàn)均在氮?dú)鈼l件下進(jìn)行。具體步驟如下：1) 向50 mL血清瓶中加入20 mL模擬地下水溶液，再加入0.27 mL U(Ⅵ)儲(chǔ)備溶液，使體系U(Ⅵ)最終濃度為30 mg/L；2) 在上述溶液中依次加入腐敗希瓦氏菌和乳酸鈉，濃度分別為6×108mL-1和10 mmol/L；3) 充高純氮驅(qū)氧，用丁基橡膠塞和鋁密封件密封，溫度控制在(30±1) ℃；4) 在厭氧條件下定期用注射器從血清瓶中抽取0.5 mL菌體樣液進(jìn)行分析。反應(yīng)結(jié)束后，取10 mL混合液進(jìn)行EPS提取分析。每組實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，并設(shè)置不加腐敗希瓦氏菌的空白對(duì)照組。

1.4 分析方法

反應(yīng)后腐敗希瓦氏菌體中U(Ⅵ)和U(Ⅳ)的含量根據(jù)文獻(xiàn)[24-25]的方法，采用NaHCO3-HNO3連續(xù)萃取法對(duì)腐敗希瓦氏菌中固定的鈾進(jìn)行提取，其原理如圖1所示。在該方法中，NaHCO3萃取的是吸附/絡(luò)合的U(Ⅵ)，而HNO3萃取的是不溶性U(Ⅳ)沉淀。在厭氧條件下定期用注射器從血清瓶中抽取0.5 mL菌體溶液，8 000 r/min離心分離5 min后，上清液過(guò)0.22 μm濾膜，記為U上清。剩余菌體細(xì)胞用厭氧0.1 mol/L NaCl溶液洗滌2次，去除菌體表面殘留的U(Ⅵ)后，再加入0.5 mL 1 mol/L厭氧NaHCO3溶液提取菌體中的U(Ⅵ)，厭氧條件下放置過(guò)夜后離心分離，上清液記為UNaHCO3。最后，再加入0.5 mL 10% HNO3提取菌體中的U(Ⅳ)，放置4 h后離心分離，上清液記為UHNO3。所有樣品均在5%HNO3中酸化保存，然后用ICP-MS測(cè)各組分濃度。

圖1 腐敗希瓦氏菌中U的NaHCO3-HNO3萃取法提取原理Fig.1 Extraction principle of U from Shewanella putrefaciens by NaHCO3-HNO3 fractionation method

1.5 EPS提取

采用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(CER)法、超聲波法和離心法3種方法提取EPS。反應(yīng)后的腐敗希瓦氏菌用0.1 mol/L厭氧NaCl溶液(使用前煮沸并通入氮?dú)怛?qū)氧)清洗2次，去除細(xì)胞表面的可溶性殘留物質(zhì)，再用0.1 mol/L厭氧NaCl溶液懸浮至10 mL。所有EPS提取過(guò)程均在厭氧條件下進(jìn)行。

CER法：離子交換樹(shù)脂可除去EPS和細(xì)胞之間的二價(jià)橋接離子，促使EPS從細(xì)胞表面脫附。取4 mL洗滌后的細(xì)胞懸浮液，按照70 g/g 的可揮發(fā)性懸浮物(VSS)標(biāo)準(zhǔn)稱(chēng)取CER量，600 r/min攪拌提取1 h，以14 510 r/min離心20 min，上清液過(guò)0.22 μm濾膜。

超聲波法：超聲波法提取EPS的原理是利用超聲波產(chǎn)生的壓力沖擊使EPS和細(xì)胞分離。取4 mL洗滌后的細(xì)胞懸浮液，置于超聲清洗器(150 W)中提取10 min，14 510 r/min離心20 min，上清液過(guò)0.22 μm濾膜。

離心法：離心法提取EPS的原理主要是利用高速離心產(chǎn)生的重力場(chǎng)作用，使EPS和細(xì)胞分離。取2 mL洗滌后的細(xì)胞懸浮液，以14 510 r/min的速度離心20 min，上清液過(guò)0.22 μm濾膜。

1.6 SP-ICP-MS分析EPS中的U

用單顆粒ICP-MS(SP-ICP-MS)對(duì)過(guò)0.22 μm濾膜后的EPS提取液中的可溶性U和顆粒U進(jìn)行定量分析，并對(duì)顆粒U的粒徑分布進(jìn)行分析。在單顆粒模式下，可溶性鈾酰離子的信號(hào)與含鈾粒子的信號(hào)明顯不同。因此，EPS中礦物U的含量為總U濃度與可溶性U濃度的差值。為表征納米級(jí)鈾粒子的粒徑分布，用已知粒徑和顆粒濃度的納米銀(nanoComposix公司)作為標(biāo)準(zhǔn)粒子。單個(gè)膠體粒子進(jìn)入后會(huì)在等離子體焰矩內(nèi)被粒子化為離子簇，以瞬時(shí)信號(hào)的形式被質(zhì)譜檢測(cè)到。其中信號(hào)強(qiáng)度反映顆粒粒徑，信號(hào)頻率反映顆粒濃度。

1.7 EPS反應(yīng)前后FT-IR分析

將反應(yīng)前后的EPS冷凍干燥后進(jìn)行FT-IR分析，采用KBr壓片法，掃描波數(shù)為400～4 000 cm-1，掃描次數(shù)為10，分辨率為4 cm-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐敗希瓦氏菌對(duì)U(Ⅵ)的固定

在腐敗希瓦氏菌固定U(Ⅵ)反應(yīng)過(guò)程中，對(duì)上清液中U的濃度(U上清)進(jìn)行測(cè)定，并分析實(shí)驗(yàn)各階段菌體中的U含量(U菌體=UNaHCO3+UHNO3)和系統(tǒng)的物質(zhì)平衡(U系統(tǒng)=U上清+U菌體)，結(jié)果示于圖2。UNaHCO3和UHNO3分別為吸附的U(Ⅵ)(如U(Ⅵ)離子、U(Ⅵ)-碳酸鹽礦物)和還原的U(Ⅳ)的濃度。由圖2可知，未加腐敗希瓦氏菌的空白組的U含量沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明U在實(shí)驗(yàn)體系中沒(méi)有發(fā)生沉淀。上清液中U(Ⅵ)濃度隨時(shí)間的增加不斷下降，在0～28 h內(nèi)腐敗希瓦氏菌對(duì)鈾的去除速度最快，之后逐漸趨于平穩(wěn)，最終的去除率為90.9%。由圖2還可看出，系統(tǒng)的U含量(U系統(tǒng))在反應(yīng)過(guò)程中沒(méi)有明顯變化，表明溶液中的U被腐敗希瓦氏菌固定，系統(tǒng)有很好的物質(zhì)平衡。由于碳酸氫鹽是地下水系統(tǒng)中廣泛存在的無(wú)機(jī)配體[26]，所以本文著重模擬地下水碳酸氫根的體系。體系的初始pH值設(shè)定為7.0，但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，pH值隨反應(yīng)的進(jìn)行因腐敗希瓦氏菌消耗底物而有所下降，從7.0下降至6.2，處于弱酸性。對(duì)于酸度更大的環(huán)境(pH<6)，這些材料可能也會(huì)適用，后續(xù)會(huì)進(jìn)行相關(guān)研究。

圖2 腐敗希瓦氏菌固定U(Ⅵ)過(guò)程中U上清、U菌體和U系統(tǒng)隨時(shí)間的變化Fig.2 Usupernatant, Ucells and Usystem in U(Ⅵ) immobilization process by Shewanella putrefaciens

NaHCO3-HNO3連續(xù)提取反應(yīng)過(guò)程中腐敗希瓦氏菌體的U(Ⅳ)和U(Ⅵ)含量的變化示于圖3。由圖3可知，UNaHCO3和UHNO3隨時(shí)間的增加而增加，說(shuō)明腐敗希瓦氏菌至少可通過(guò)吸附/絡(luò)合和還原兩種方式固定U(Ⅵ)。菌體中的鈾含量由最初的(0.89±0.09) mg/L增加到(20.70±0.71) mg/L，與上清液中U減少的濃度大體一致，表明溶液中的U(Ⅵ)已被腐敗希瓦氏菌固定。在初始厭氧條件下(t<8 h時(shí))，UHNO3較低，這是由于腐敗希瓦氏菌在反應(yīng)初期對(duì)缺氧體系的適應(yīng)性調(diào)整，還原率較低，而隨著反應(yīng)的進(jìn)行表現(xiàn)出較好還原效果。UHNO3從最初的(0.11±0.03) mg/L增加到反應(yīng)結(jié)束時(shí)的(4.02±0.38) mg/L。以上結(jié)果表明，腐敗希瓦氏菌除吸附作用外還具有還原U(Ⅵ)的能力，可有效將地下水中的U(Ⅵ)還原為U(Ⅳ)。

圖3 腐敗希瓦氏菌固定U(Ⅵ)過(guò)程中UNaHCO3和UHNO3隨時(shí)間的變化Fig.3 UNaHCO3 and UHNO3 in U(Ⅵ) immobilization process by Shewanella putrefaciens

反應(yīng)過(guò)程菌體中U(Ⅳ)/U(Ⅵ)比的變化示于圖4。U(Ⅳ)/U(Ⅵ)比隨時(shí)間的推移逐漸增加，表明隨著反應(yīng)的進(jìn)行，腐敗希瓦氏菌對(duì)U的還原活性逐步被激發(fā)。此外，還說(shuō)明大多數(shù)U(Ⅵ)在還原成U(Ⅳ)之前先與腐敗希瓦氏菌發(fā)生吸附反應(yīng)，U(Ⅵ)與腐敗希瓦氏菌的吸附反應(yīng)較生物還原反應(yīng)快得多。

圖4 腐敗希瓦氏菌固定U(Ⅵ)過(guò)程中U(Ⅳ)/U(Ⅵ)比的變化Fig.4 Variation of ratio of U(Ⅳ)/U(Ⅵ) in U(Ⅵ) immobilization process by Shewanella putrefaciens

2.2 EPS中的鈾含量

從腐敗希瓦氏菌中提取的EPS中U的含量在很大程度上取決于提取過(guò)程中EPS的提取效率和不溶性U(Ⅳ)的再溶解程度。采用CER法、超聲波法和離心法3種方法提取的EPS中U的含量和UEPS/TUcells比示于圖5。從圖5可看出，離心法和超聲法所得EPS中鈾含量(UEPS)較低，離心法中UEPS為(0.42±0.09) mg/L，超聲法中UEPS為(0.85±0.15) mg/L，這一結(jié)果與EPS提取效率[27]一致，由于其對(duì)EPS提取效率較低導(dǎo)致UEPS的含量低。對(duì)于CER法，UEPS在很大程度上取決于萃取時(shí)間。但隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，不溶性U(Ⅵ)的再溶解也變得嚴(yán)重，在本研究小組之前的研究中，當(dāng)萃取時(shí)間為1 h、轉(zhuǎn)速為600 r/min時(shí)，U(Ⅵ)再溶解的程度是可接受的[24]，CER法中UEPS為(2.91±0.22) mg/L，占腐敗希瓦氏菌固定總鈾量(TUcells=(20.7±0.71) mg/L)的(14.0±1.0)%。對(duì)比3種方法，離心法和超聲法的鈾提取效率低，不適用于EPS中鈾的種類(lèi)和含量的測(cè)定，CER法得到的結(jié)果可能更接近EPS中的實(shí)際鈾含量。以上結(jié)果表明，用腐敗希瓦氏菌固定鈾時(shí)，EPS具有很強(qiáng)的富集能力，EPS中的鈾含量不可忽略。

圖5 從腐敗希瓦氏菌中提取的EPS中的鈾含量和UEPS/TUcells比Fig.5 UEPS and UEPS/TUcells ratio of EPS solution extracted from Shewanella putrefaciens

2.3 EPS中的顆粒鈾

CER法適合用于表征EPS中的鈾含量及形態(tài)。EPS中可溶性鈾和顆粒鈾的百分比，以及顆粒鈾的粒徑分布列于表1。EPS中可溶性鈾的百分比在初始階段(t=8 h)明顯上升，然后隨著鈾固定反應(yīng)的進(jìn)行逐步下降，說(shuō)明初始階段EPS中主要發(fā)生鈾酰離子的吸附，然后溶解態(tài)粒子逐步發(fā)生生物還原或生物礦化轉(zhuǎn)化為鈾顆粒。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到44 h時(shí)，顆粒鈾占EPS中固定總鈾量的66.6%，表明反應(yīng)結(jié)束時(shí)顆粒鈾是EPS中鈾的主要形式。這一結(jié)果與William等[28]的研究結(jié)果一致，ShewanellaoneidensisMR-1的EPS與U(Ⅵ)反應(yīng)形成了約3.0 nm的鈾礦。CER法提取的EPS中顆粒鈾較超聲法和離心法多，進(jìn)一步說(shuō)明CER法對(duì)鈾的萃取效率較高。

表1 EPS中可溶性鈾和顆粒鈾的百分比及顆粒鈾的粒徑Table 1 Fraction of soluble and particulate U and size of particulate U in EPS

CER法提取的EPS中鈾顆粒的粒徑分布示于圖6。由圖6可見(jiàn)，鈾粒子隨時(shí)間的推移逐漸形成鈾顆粒并增大，顆粒數(shù)從3 144 mL-1增加到87 460 mL-1，平均粒徑從13.5 nm增加到126.9 nm。在腐敗希瓦氏菌固定U(Ⅵ)的初期，EPS中鈾顆粒的數(shù)量減少，平均粒徑增大，但EPS中鈾含量略有增加，表明較小的鈾粒子聚集并長(zhǎng)大，在EPS中隨時(shí)間積累。需要注意的是，ICP-MS得到的鈾粒子的直徑以鈾原子計(jì)，不是含鈾粒子的真實(shí)直徑。然而由于鈾原子遠(yuǎn)大于磷、氧等原子，所以該直徑非常接近實(shí)際粒子的真實(shí)尺寸。

圖6 CER法提取的EPS中鈾顆粒的粒徑分布Fig.6 Size distribution of nano-sized U particles in EPS extracts by CER method

上述結(jié)果表明，腐敗希瓦氏菌的EPS在與U(Ⅵ)反應(yīng)后，含有鈾酰離子和鈾礦物，說(shuō)明EPS固定U(Ⅵ)過(guò)程中發(fā)生了生物吸附和生物礦化作用。

2.4 EPS對(duì)U(Ⅵ)的吸附機(jī)理

圖7 EPS與鈾作用前后的紅外光譜Fig.7 FT-IR spectra of EPS before and after reaction with U(Ⅵ)

3 結(jié)論

1) 在處理過(guò)含鈾地下水的腐敗希瓦氏菌EPS中發(fā)現(xiàn)大量鈾，占腐敗希瓦氏菌固定鈾總量的(14.0±1.0)%(CER提取法)。

2) SP-ICP-MS分析表明，EPS結(jié)合的鈾有兩種形態(tài)：溶解態(tài)和顆粒態(tài)。除生物吸附外，生物礦化也有助于腐敗希瓦氏菌的EPS固定鈾。

3) FT-IR分析結(jié)果說(shuō)明，EPS吸附U(Ⅵ)時(shí)主要與EPS中的羧基官能團(tuán)結(jié)合。