劉紅強(qiáng)，于學(xué)健，翟磊，白飛榮，姚粟

(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京， 100015)

大曲高溫放線菌(Thermoactinomycesdaqus，T.daqus)CICC 10681分離自高溫大曲[1]，是芝麻香型白酒高溫大曲堆積發(fā)酵過程中的重要微生物，其系統(tǒng)學(xué)發(fā)育地位屬于芽孢桿菌目(Bacillales)-高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)[2-3]，但形態(tài)上與放線菌相似，具有發(fā)達(dá)的菌絲體，研究表明，菌株發(fā)達(dá)的菌絲體可以疏松大曲的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，促進(jìn)大曲水分的蒸發(fā)[4]。T.daqusCICC 10681具有良好的耐高溫特性，通過解析菌株的脂肪酸組成及代謝相關(guān)基因的差異表達(dá)情況，菌株CICC 10681在高溫條件下能夠增加細(xì)胞膜脂肪酸異構(gòu)化支鏈的比率[5-6]，為其在高溫條件下發(fā)揮生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)。此外，T.daqusCICC 10681能夠分泌高溫蛋白酶，酶的最適反應(yīng)溫度為65 ℃，與高溫大曲發(fā)酵過程中最高品溫相適應(yīng)。研究報(bào)道，在高溫大曲堆積發(fā)酵過程中，嗜熱微生物分泌的高溫蛋白酶通過降解大曲原料產(chǎn)生氨基酸并與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)[7-10]，生成酮、醛、醇等雜環(huán)化合物，有利于白酒特征風(fēng)味物質(zhì)的形成[11-14]，為酒體帶來綿軟醇厚、香味協(xié)調(diào)等特點(diǎn)。因此，對(duì)菌株CICC 10681生長(zhǎng)性能的研究具有重要的理論意義。

高溫放線菌在白酒高溫大曲中具有較高的物種豐度，葛媛媛等[15]、姚粟等[16]利用非培養(yǎng)方法分析芝麻香型白酒高溫大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性時(shí)發(fā)現(xiàn)高溫放線菌、芽孢桿菌和乳酸菌是高溫大曲中的優(yōu)勢(shì)菌屬，在大曲堆積發(fā)酵過程中發(fā)揮著重要的作用。T.daqusCICC 10681作為高溫大曲的重要菌株，在生長(zhǎng)培養(yǎng)基上的生物量偏低，不利于菌株的生物學(xué)功能研究，后續(xù)菌株的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用成本較高。本研究主要利用響應(yīng)面方法優(yōu)化T.daqusCICC 10681的生長(zhǎng)條件，使其生物量滿足微生物強(qiáng)化要求，節(jié)約生產(chǎn)成本，后續(xù)將菌株以菌粉或菌劑的形式應(yīng)用于高溫大曲發(fā)酵生產(chǎn)過程中，旨在更好的發(fā)揮菌株的生物學(xué)功能，以期改善高溫大曲品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)菌株

T.daqus菌株CICC 10681：分離于山東扳倒井股份有限公司芝麻香型白酒高溫大曲，保藏于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection，CICC)。

1.1.2 培養(yǎng)基

R2A瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯(nutrient broth，NB)培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；R2A液體培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

R2A瓊脂培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸出粉0.5、蛋白胨0.5、酪蛋白水解物0.5、葡萄糖0.5、可溶性淀粉0.5、磷酸氫二鉀0.3、無水硫酸鎂0.024、丙酮酸鈉0.3、瓊脂15.0、pH值7.2±0.2，121 ℃滅菌15 min。

NB培養(yǎng)基(g/L)：牛肉浸粉3、蛋白胨5，自然pH值，121 ℃滅菌15 min。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：NB培養(yǎng)基。

1.1.3 化學(xué)試劑

酵母浸粉、大豆蛋白胨、酸水解酪蛋白、胰蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；硝酸銨、硫酸鎂、氯化鈣、氯化鈉、硫酸鹽、磷酸氫二鉀、蔗糖、葡萄糖、果糖、牛肉浸粉、可溶性淀粉，北京化學(xué)試劑公司。試驗(yàn)所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

Olympus BH-2光學(xué)顯微鏡,奧林巴斯有限公司；Multiskan FC型酶標(biāo)儀,賽默飛世爾(上海)儀器有限公司;FE20型pH計(jì),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；2000型分光光度計(jì),尤尼柯(上海)儀器有限公司;BHG-8082型恒溫培養(yǎng)箱、THZ-98C恒溫振蕩培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 種子液制備

菌種活化：將甘油保藏的菌株CICC 10681接種于R2A液體培養(yǎng)基中，于55 ℃、180 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)12 h，備用。

種子液制備：將培養(yǎng)好的菌株稀釋至OD620nm=0.5并以2%接種量接入裝有50 mL R2A液體培養(yǎng)基中，于55 ℃、180 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)12 h，制備成種子液。

1.3.2 菌株生長(zhǎng)曲線繪制

將活化好的菌株CICC 10681稀釋至OD620nm=0.5 并以2%接種量接入50 mL NB培養(yǎng)基中，55 ℃，180 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔2 h測(cè)菌株CICC 10681培養(yǎng)液的OD620nm，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD620nm為縱坐標(biāo)，繪制大曲高溫放線菌的生長(zhǎng)曲線。

1.3.3 菌株CICC 10681培養(yǎng)基組分的篩選

1.3.3.1 碳源的篩選

運(yùn)用單因素試驗(yàn)，以NB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以果糖、蔗糖及菌株CICC 10681分離篩選培養(yǎng)基中含有的葡萄糖、丙酮酸鈉和可溶性淀粉(添加量為3 g/L)為篩選碳源，按照上述培養(yǎng)和測(cè)定方法，分別考察不同碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。

1.3.3.2 氮源的篩選

以添加最優(yōu)碳源培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加5 g/L的酵母浸粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、硝酸銨、酸水解酪蛋白，按照上述培養(yǎng)和測(cè)定方法，分別考察不同氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。

1.3.3.3 無機(jī)鹽的篩選

無機(jī)鹽離子是菌株生長(zhǎng)必不可少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有研究表明，適當(dāng)增加無機(jī)鹽的濃度可促進(jìn)菌株生長(zhǎng)[17-18]。以添加最優(yōu)碳源、氮源的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加硫酸鎂、氯化鈉、硫酸錳、磷酸二氫鉀、氯化鈣(添加量為5 g/L)，按照上述培養(yǎng)和測(cè)定方法，分別考察不同無機(jī)鹽對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。

1.3.4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)培養(yǎng)條件的優(yōu)化

在最優(yōu)碳源、氮源、無機(jī)鹽種類的基礎(chǔ)上，選取溫度、pH值、轉(zhuǎn)速、裝液量、接種量共8個(gè)因素進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)，每個(gè)因素選高低2個(gè)水平，以(-1，+1)編碼各值[19]，各因素及取值見表1。以菌株生物量(OD620nm)為響應(yīng)值，運(yùn)用N=12的Plackett-Burman(PB)試驗(yàn)設(shè)計(jì)快速篩選對(duì)菌株CICC 10681生長(zhǎng)影響顯著的因素。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

1.3.5 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，篩選出顯著影響因素，根據(jù)回歸方程系數(shù)來確定爬坡方向，+號(hào)表示正相關(guān)，-號(hào)代表負(fù)相關(guān)，通過最陡爬坡試驗(yàn)確定響應(yīng)面中心點(diǎn)[20-21]。

1.3.6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出顯著影響因素可溶性淀粉(A)、大豆蛋白胨(B)、溫度(E)、裝液量(H)，以最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果中最大響應(yīng)值所對(duì)應(yīng)的各因素水平為基準(zhǔn)，確定響應(yīng)面的中心點(diǎn)。采用Box-Behnken試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化菌株CICC 10681生長(zhǎng)條件[22]，并利用Design-Expert 10.0.7對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析。Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因子與水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，單因素方差分析采用SPSS Statistics 20.0軟件(P<0.05)，運(yùn)用軟件Origin 9.0[23]進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同碳源對(duì)菌株CICC 10681生長(zhǎng)的影響

碳源的篩選結(jié)果見圖1。大曲高溫放線菌CICC 10681生長(zhǎng)在高溫場(chǎng)所，能夠產(chǎn)生與放線菌相似的發(fā)達(dá)菌絲體，但菌株CICC 10681在生長(zhǎng)培養(yǎng)基上的生物量較低。菌株CICC 10681在NB液體培養(yǎng)基上生物量(OD620nm)僅為0.27±0.01，與細(xì)菌域中其他的高溫功能菌相比，其生物含量偏低。添加可溶性淀粉對(duì)菌株CICC 10681的生長(zhǎng)影響最顯著，生物量OD620nm達(dá)0.73±0.04(P<0.05)；果糖、葡萄糖和蔗糖次之。因此試驗(yàn)選取可溶性淀粉為最佳碳源。

2.1.2 不同氮源對(duì)菌株CICC 10681生長(zhǎng)的影響

氮源的篩選結(jié)果見圖2，添加大豆蛋白胨對(duì)菌株CICC 10681的生長(zhǎng)影響最顯著， OD620nm達(dá)1.35(P<0.05)，酸水解酪蛋白、酵母浸粉和硝酸銨次之，胰蛋白胨對(duì)菌株CICC 10681的生長(zhǎng)無顯著性影響(P>0.05)。由此可見，添加大豆蛋白胨對(duì)大曲高溫放線菌的生長(zhǎng)影響最大，因此試驗(yàn)選取大豆蛋白胨作為最佳氮源。

2.1.3 不同無機(jī)鹽對(duì)菌株CICC 10681生長(zhǎng)的影響

無機(jī)鹽的篩選結(jié)果見圖3,磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈣對(duì)菌株CICC 10681的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用，其中，添加硫酸鎂對(duì)菌株CICC 10681的生長(zhǎng)影響最顯著，OD620nm達(dá)1.71(P<0.05)，添加氯化鈉和硫酸錳對(duì)菌株CICC 10681的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，因此選取硫酸鎂作為最佳無機(jī)鹽。

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)篩選重要影響因素

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，按1.3.4中的方法進(jìn)行N=12的Plackett-Burman試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

運(yùn)用Design-Expert10.0.7軟件對(duì)表3結(jié)果進(jìn)行方差分析。從分析結(jié)果表4中可以看出影響因素大小順序?yàn)闇囟?E)>大豆蛋白胨(B)>裝液量(H)>可溶性淀粉(A)>轉(zhuǎn)速(F)>pH(D)>硫酸鎂(C)>接種量(G)。模型P=0.032 214<0.05，模型顯著，溫度P=0.009 342<0.01，影響極顯著，大豆蛋白胨、裝液量、可溶性淀粉的P<0.05，影響顯著，一次回歸方程為Y=1.022 50+0.172 50A+0.205 83B+0.107 50C-0.114 17D+0.309 17E+0.159 17F+0.027 50G-0.202 50H。

表3 Plackett-Burman設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of Plackett-Burman

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman experiments results

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果篩選出溫度、大豆蛋白胨、裝液量、可溶性淀粉4個(gè)顯著影響因素，通過最陡爬坡試驗(yàn)確定響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)，最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5，當(dāng)可溶性淀粉為4.5 g/L、大豆蛋白胨8 g/L、溫度為53 ℃、裝液量為60 mL時(shí)，對(duì)應(yīng)試驗(yàn)3的OD620nm達(dá)到最大，試驗(yàn)結(jié)果表明適當(dāng)增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及調(diào)整生長(zhǎng)條件有利于提高菌株CICC 10681的生物量，超出某一臨界值將抑制菌株CICC 10681的生長(zhǎng)。因此選取試驗(yàn)3對(duì)應(yīng)條件作為響應(yīng)面的中心點(diǎn)，即可溶性淀粉為4.5 g/L、大豆蛋白胨8 g/L、溫度為53 ℃、裝液量為60 mL。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and results of the steepest ascent experiments

2.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及分析

響應(yīng)面試驗(yàn)是根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)選取的中心點(diǎn)，利用少量的試驗(yàn)總結(jié)影響因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，同時(shí)分析各因素之間的交互作用。根據(jù)響應(yīng)面中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表6，以菌株OD620nm為響應(yīng)值的二次回歸方程：Y=1.945+0.069A+0.092B+0.181C+0.089D-0.092AB-0.164AC-0.052AD-0.061BC-0.084BD-0.077CD-0.158A2-0.067B2-0.601C2-0.309D2。Y表示菌株OD620nm，A表示可溶性淀粉，B表示大豆蛋白胨，C表示溫度，D表示裝液量。

表6 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

由表7可知，方差分析結(jié)果顯示模型P=0.000 1<0.05達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)為7.028，失擬項(xiàng)P=0.130 9>0.05，影響不顯著，說明試驗(yàn)所得方程與實(shí)際擬合中非正常誤差所占比例較小，模型擬合程度較好；模型決定系數(shù)為0.924 6，調(diào)整決定系數(shù)為0.836 6，信噪比為9.97。回歸模型分析結(jié)果顯示，大豆蛋白胨、溫度影響顯著，可溶性淀粉與溫度的交互作用顯著，說明溫度和大豆蛋白胨是菌株CICC 10681生長(zhǎng)的重要影響因子。

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

溫度、可溶性淀粉、大豆蛋白胨及裝液量這4個(gè)因素中兩兩相互作用對(duì)OD620nm的影響結(jié)果見圖4。其中可溶性淀粉(A)與溫度(C)交互作用顯著，當(dāng)可溶性淀粉添加量在較低水平時(shí)，較高生物量(OD620nm≈1.81)對(duì)應(yīng)的溫度在54 ℃；當(dāng)可溶性淀粉添加量增加到4.6 g/L時(shí)，最大生物量(OD620nm≈1.96)對(duì)應(yīng)的溫度在53.6 ℃，由此可知，可溶性淀粉與溫度交互作用呈負(fù)相關(guān)，在最優(yōu)條件范圍內(nèi)，調(diào)節(jié)可溶性淀粉含量與溫度的關(guān)系可提高菌株CICC 10681的生物量，此外，從等高線圖可以看出圖形呈橢圓型，交互作用顯著[24]。

根據(jù)上述分析及響應(yīng)面軟件預(yù)測(cè)，菌株CICC 10681的最佳培養(yǎng)條件為可溶性淀粉4.528 g/L、大豆蛋白胨8.410 g/L、硫酸鎂5 g/L、溫度53.28 ℃、接種量2%、裝液量63.57 mL/250mL、轉(zhuǎn)速180 r/min，預(yù)測(cè)最高OD620nm為1.972。為驗(yàn)證該模型預(yù)測(cè)的可靠性，在最優(yōu)培養(yǎng)條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)合實(shí)際培養(yǎng)條件，調(diào)整最優(yōu)條件為可溶性淀粉4.5 g/L、大豆蛋白胨8.4 g/L、硫酸鎂5 g/L、溫度53 ℃、接種量2%、裝液量60 mL/250mL、轉(zhuǎn)速180 r/min，實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株CICC 10681的OD620nm達(dá)1.98±0.029，與響應(yīng)曲面擬合所得方程的預(yù)測(cè)值相近，說明該模型較為合理。

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，大曲高溫放線菌CICC 10681的生物量明顯提高，OD620nm可以達(dá)到1.98±0.029，比優(yōu)化之前提高了6.2倍，為后續(xù)深入研究菌株CICC 10681的功能特性及菌株的生產(chǎn)應(yīng)用提供了良好的研究基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

本研究是對(duì)分離自芝麻香型白酒高溫大曲的大曲高溫放線菌CICC 10681的生長(zhǎng)性能優(yōu)化，以O(shè)D620nm為響應(yīng)值，利用單因素試驗(yàn)對(duì)菌株CICC 10681培養(yǎng)基組成進(jìn)行篩選，并結(jié)合Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)菌株CICC 10681的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在大曲高溫放線菌的最佳培養(yǎng)條件，為后續(xù)對(duì)高溫功能菌的生產(chǎn)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。研究結(jié)果表明，菌株CICC 10681最佳培養(yǎng)條件為可溶性淀粉4.5 g/L、大豆蛋白胨8.4 g/L、硫酸鎂5 g/L、53 ℃、接種量2%、裝液量60 mL/250mL、轉(zhuǎn)速180 r/min，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，菌株CICC 10681的OD620nm達(dá)1.98±0.029，較優(yōu)化前提高了6.2倍。

T.daqusCICC 10681是高溫大曲中的重要功能菌，發(fā)達(dá)的菌絲體可以很好的疏松大曲的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，其分泌的高溫蛋白酶對(duì)大曲原料的降解及大曲特征風(fēng)味前體物質(zhì)的形成方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本研究對(duì)T.daqusCICC 10681性能的初步研究，確定了菌株的最佳培養(yǎng)條件，一方面為深入分析菌株功能特性提供研究基礎(chǔ)，另一方面為挖掘菌株潛在功能及其在芝麻香型白酒高溫大曲中的應(yīng)用方面奠定了一定基礎(chǔ)。