季小詩，郭紅蓮，王笑笑，楊昭輝，閆晨卉

(天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津，300450)

冬棗(ZizyphusjujubaMill.)果皮薄而脆，果肉細(xì)嫩多汁，鮮食口感甜脆，營養(yǎng)成分豐富，含有人體所需的多種礦物質(zhì)、維生素以及氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)[1-2]，特別是維生素C含量極高，可達(dá)300～600 mg/100g，被譽(yù)為“活維生素丸”[3]，還富含環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)和環(huán)磷酸鳥腺苷(guanosine-5′-monophosphate，GMP)等功能成分，深受人們喜愛[4]。然而冬棗在采摘以及貯藏過程中不僅極易失水皺縮造成果實軟化腐爛，并且容易受到病原菌從而引起腐敗，是冬棗在采后運(yùn)輸以及銷售過程中的極大障礙[5-6]。據(jù)報道，冬棗收獲后引起果實腐敗的病原菌大多數(shù)為細(xì)交鏈格孢菌(Alternariaalternata)[7]。如何保持冬棗的采后品質(zhì)，特別是減少受黑斑病侵染而造成的腐敗，是當(dāng)前冬棗保鮮領(lǐng)域亟待解決的問題。

在冬棗保鮮研究中，保鮮技術(shù)分為以下幾種：物理保鮮、化學(xué)保鮮和生物防治[8]。生物防治是近幾年來深受人們青睞的一種保鮮技術(shù)。它主要是利用拮抗微生物對果蔬病原菌的抑制作用從而達(dá)到保鮮效果[9-10]。我們實驗室發(fā)現(xiàn)了1株拮抗菌GS-316屬于膜醭畢赤酵母(Pichiamembranifaciens)，前期預(yù)實驗證明其對果實黑斑病(細(xì)交鏈格孢菌)有明顯抑制作用，并對其抗病機(jī)制進(jìn)行了相關(guān)研究[11]。本試驗在前期研究基礎(chǔ)上，通過研究拮抗酵母GS-316發(fā)酵液對冬棗黑斑病的抑菌效果以及對冬棗果實貯藏期品質(zhì)的影響，以期為發(fā)現(xiàn)拮抗菌發(fā)酵液保鮮機(jī)制，探索冬棗果實生物保鮮技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：試驗所用黃驊冬棗，天津市千品果蔬超市；拮抗菌膜醭畢赤酵母GS-316、細(xì)交鏈格孢菌，實驗室保存。

試劑：2,6-二氯靛酚、Adamas-beta、3,5-二硝基水楊酸，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；過氧化氫，天津市化學(xué)試劑二廠；鄰苯二酚，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16M臺式高速冷凍離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；TU-1810紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；DK-2000-ⅢL電熱恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 病原菌的活化及孢子懸浮液制備

將實驗室保藏的病原菌菌株使用無菌接種環(huán)接種到PDA培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。用無菌鏟挑取培養(yǎng)7 d后的病原菌分生孢子于無菌蒸餾水中，制成孢子懸浮液。

1.3.2 拮抗菌的活化

無菌條件下，用無菌接種環(huán)刮取1環(huán)實驗室保藏的拮抗菌GS-316菌株，采用3區(qū)劃線接種于PDA培養(yǎng)基中，于28 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 拮抗菌GS-316發(fā)酵液的制備

在無菌條件下，用無菌接種環(huán)挑取已活化好的拮抗菌膜醭畢赤酵母GS-316接入PDA液體培養(yǎng)基中，以120 r/min的速度在搖床上培養(yǎng)7 d。將培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液用冷凍離心機(jī)以6 000 r/min冷凍離心15 min后，收集上清液。將得到的上清液經(jīng)0.22 μm的微孔過濾器過濾除菌體得無菌發(fā)酵液。

1.3.4 發(fā)酵液對病原菌的影響

參照喬博鑫等[12]的方法，在培養(yǎng)皿平板上打孔，另一側(cè)平行放置病原菌菌片。在小孔中加入50 μL提取的發(fā)酵液作為實驗組，以小孔中加入50 μL無菌水作為對照，觀察發(fā)酵液對交鏈孢的生長抑制率。每組處理設(shè)置3個平行。生長抑制率計算方法如公式(1)所示：

生長抑制率/%=

(1)

1.3.5 發(fā)酵液對冬棗自然發(fā)病率及病斑的影響

選取無機(jī)械損傷的棗果，用2%體積分?jǐn)?shù)次氯酸鈉溶液浸泡2 min，流水沖洗干凈后于通風(fēng)處晾干。將拮抗菌GS-316發(fā)酵液均勻噴灑于棗果表面作為實驗組，以無菌水噴灑作為對照組。將處理后的棗果置于室溫25 ℃閉光且濕度適宜的泡沫箱中，定時噴灑無菌水以保證其貯藏濕度，每隔2 d觀察棗果的發(fā)病情況并記錄數(shù)據(jù)。每組設(shè)置3個平行。發(fā)病率計算方法如公式(2)所示：

(2)

取數(shù)個預(yù)處理后的棗果，用直徑為0.5 cm的無菌打孔器在赤道部分表面打孔，在孔中注入40 μL濃度為1×105個/mL交鏈孢孢子懸浮液，以注入40 μL拮抗菌GS-316發(fā)酵液作為實驗組，注入等量無菌水作為對照組。將處理后的棗果置于室溫25 ℃閉光且濕度80%～90%的泡沫箱中，定時噴灑無菌水以保證其貯藏濕度，每天觀察棗果腐爛情況并記錄。每組處理設(shè)置3個平行。

1.3.6 發(fā)酵液對冬棗生理品質(zhì)及抗氧化活性的影響

稱重法測定失重率[13]；酸堿滴定法測定可滴定酸含量[14]；2,6-二氯靛酚滴定法測定維生素C含量[14]；3,5-二硝基水楊酸法測定還原糖含量[14]；紫外吸收法測定過氧化氫酶(catalase， CAT)活性[15]；參考ADEDEJI等[16]的方法測定多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌GS-316發(fā)酵液對病原菌細(xì)交鏈格孢菌的作用

從圖1可以看到，病原菌在拮抗菌GS-316發(fā)酵液的存在下于PDA平板上28 ℃ 培養(yǎng)6 d后，相較于對照組，發(fā)酵液對病原菌的生長有明顯的抑制作用，測得生長抑制率為17.03%。結(jié)果表明，拮抗菌GS-316發(fā)酵液中存在抑菌成分，并且在離體條件下抑制棗果黑斑病病原菌的生長。

2.2 冬棗采后貯藏試驗

2.2.1 拮抗菌GS-316發(fā)酵液對棗果發(fā)病率的影響

從圖2可以看出，貯藏過程中，棗果的發(fā)病率隨著貯藏時間的增加均呈上升的趨勢，但經(jīng)發(fā)酵液處理后的棗果發(fā)病率要明顯優(yōu)于對照組(P<0.05)。對照組棗果發(fā)病率在前期迅速上升，第14 天時發(fā)病率便達(dá)到了95.83%，而經(jīng)發(fā)酵液處理后的棗果前期上升速率較對照組緩慢，第14天發(fā)病率僅為51.39%。在第20天時，對照組發(fā)病率為100.00%，實驗組發(fā)病率僅為86.11%。結(jié)果說明，棗果經(jīng)拮抗菌GS-316發(fā)酵液處理后，其中的抑菌成分可以有效減少病原菌對棗果的侵染，減緩冬棗被病原菌侵染的概率，有效抑制棗果發(fā)病。

2.2.2 拮抗菌GS-316發(fā)酵液對有傷接種棗果病斑的影響

從圖3可以看出，實驗組由于拮抗菌GS-316發(fā)酵液的存在，阻止了交鏈孢孢子在棗果表面定植生長，故其腐爛程度低，病斑直徑小。到第7天時發(fā)酵液處理的病斑直徑僅為7.00 mm，對照組達(dá)到了10.5 mm，2組差異明顯(P<0.05)。結(jié)果表明，拮抗菌GS-316發(fā)酵液能有效減輕棗果黑斑病的發(fā)病程度，并在一定程度上減緩棗果的腐爛，延長冬棗的保質(zhì)期。

2.3 拮抗菌GS-316發(fā)酵液對棗果生理品質(zhì)和酶活性的影響

2.3.1 果實失重率

冬棗在采后仍然會進(jìn)行呼吸作用等一系列的代謝活動，會造成水分蒸發(fā)和營養(yǎng)物質(zhì)消耗[17]，是采后貯藏過程中果實失重的主要原因。從圖4可以看出，2組棗果的失重率隨著貯藏時間的增加呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，而經(jīng)過發(fā)酵液處理的棗果失重率一直低于對照組。至貯藏第7天時，發(fā)酵液處理后的冬棗失重率為6.04%，對照組為9.81%，兩者差異顯著(P<0.05)。結(jié)果表明，發(fā)酵液能夠在一定程度上減少棗果中營養(yǎng)物質(zhì)的代謝分解和水分的蒸發(fā)，保持果實的重量，提高果實的品質(zhì)。

2.3.2 果實可滴定酸的變化

可滴定酸含量直接影響著棗果品質(zhì)，是檢驗果實品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[18]。一般在冬棗青果中含量最高，隨后隨著果實成熟度的增加，可滴定酸含量降低，這是因為在果實成熟過程中，可滴定酸作為呼吸作用底物被消耗[19]。從圖5可以看出，對照組和實驗組冬棗的可滴定酸含量隨著貯藏時間的增加均呈逐漸下降的趨勢，但對照組的可滴定酸含量一直低于實驗組。至貯藏第7天時，經(jīng)發(fā)酵液處理的棗果可滴定酸含量為0.21%，對照組為0.19%，實驗組高于對照組但差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明，發(fā)酵液處理能夠有效減緩棗果可滴定酸含量的降低，保持棗果的貯藏品質(zhì)和風(fēng)味口感。

2.3.3 果實維生素C含量的變化

維生素C是水果的營養(yǎng)成分之一，對于人類來說具有重要的健康價值[20]。冬棗的維生素C含量極高，是貯藏期間重要的理化指標(biāo)，且棗果維生素C含量與軟化率呈負(fù)相關(guān)。由圖6可知，在貯藏時間內(nèi)，2組棗果維生素C含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，經(jīng)發(fā)酵液處理后的棗果維生素C含量一直高于對照組。至貯藏第7天時，對照組維生素C含量為105.42 mg/100g，而經(jīng)發(fā)酵液處理棗果維生素C含量為134.17 mg/100g，差異顯著(P<0.05)。結(jié)果表明，經(jīng)發(fā)酵液處理有效保持棗果內(nèi)維生素C含量，抑制棗果內(nèi)營養(yǎng)成分的流失，起到了一定的保鮮作用。

2.3.4 果實還原糖含量的變化

棗果在采后貯藏期間，果實需要進(jìn)行呼吸作用，還原糖是果實呼吸作用的底物，于是淀粉逐漸被淀粉酶分解為還原糖，這樣便會使果實中的還原糖含量升高。如圖7所示，棗果中的還原糖含量隨著貯藏時間的增加呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，對照組果實還原糖含量一直高于實驗組(P<0.05)。結(jié)果表明，GS-316拮抗菌發(fā)酵液處理能夠有效抑制棗果的呼吸作用，降低果實淀粉酶的活性，有效延長冬棗的保鮮期限。

2.3.5 CAT和PG

H2O2是植物體在生命代謝過程中產(chǎn)生的，對植物體細(xì)胞具有破壞性，而CAT可以使其分解為H2O和O2。如圖8所示，棗果中的CAT活性隨著貯藏時間的增加均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在貯藏第7天時，CAT活性低于初始值，實驗組顯著高于對照組(P<0.05)。貯藏第1天時，對照組CAT活性高于實驗組且達(dá)到高峰，實驗組CAT活性在第3天才達(dá)到高峰，推測對照組棗果衰老進(jìn)程較實驗組快，果實中的防御系統(tǒng)提前啟動，誘導(dǎo)CAT活性增加，后期冬棗腐爛，導(dǎo)致果實內(nèi)的CAT活性降低。

植物細(xì)胞壁中的果膠含量與果實硬度呈現(xiàn)正相關(guān)。PG能夠特異性催化水解多聚半乳糖醛酸，使植物細(xì)胞壁中的果膠發(fā)生降解，且外界病原菌侵入會使棗果抗病酶系失效，病原菌同樣會分泌果膠相關(guān)的降解酶等，也會使棗果發(fā)生軟化。2組棗果的PG活性在貯藏間內(nèi)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，實驗組的PG活性一直低于對照組(P<0.05)，且上升速率小于對照組。推測其原因可能是因為經(jīng)上清液處理的棗果果實有上清液中的抑菌成分抑制了果實PG發(fā)揮其作用，并且增強(qiáng)了果實體內(nèi)抗病酶系活性，這樣就有效減少了外界病原菌入侵對果實造成的傷害。

結(jié)果表明，拮抗菌GS316發(fā)酵液處理果實能夠使果實中CAT活性保持在較高位置，并且減緩棗果果實中PG活性的升高，增強(qiáng)冬棗果實抗病酶系的活性，提高果實的抗氧化活性，減少外界病原菌對果實細(xì)胞壁的降解，有效抑制果實軟化，提升其貯藏品質(zhì)及貯藏時間。

3 結(jié)論與討論

拮抗微生物的抑菌機(jī)制研究是近幾年人們研究的熱點(diǎn)，拮抗微生物可能分泌一些抗毒素、抑菌蛋白等物質(zhì)直接作用于靶標(biāo)如病原菌菌絲、孢子等起到抑制效果[21-23]。已有研究報道了一種膜醭畢赤酵母可通過分泌2種抑菌蛋白PMKT和PMICT2來抑制病原真菌的生長[24]。本實驗室的初步研究結(jié)果也表明，膜醭畢赤酵母菌可能產(chǎn)生某種物質(zhì)抑制了病原菌致病水解酶，所以導(dǎo)致了病原菌致病力下降，抑制病原菌的入侵[12]。本文在前述成果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步明確了該菌的抑菌物質(zhì)在發(fā)酵液中存在，抑菌物質(zhì)能夠?qū)绘滄呔淦鸬街苯右种谱饔谩?/p>

棗果在采后易受到病原菌的污染，主要是由于其高水分含量以及高糖分等特點(diǎn)，使得棗果的生理品質(zhì)在采后貯藏過程中逐漸下降，直至棗果腐爛。本研究通過冬棗采后貯藏實驗發(fā)現(xiàn)，GS-316發(fā)酵液處理后能夠抑制冬棗發(fā)病，減緩果實失重率的變化并維持可滴定酸含量，抑制還原糖含量的增加，說明拮抗菌發(fā)酵液可對采后果實品質(zhì)惡化有抑制作用；主要代謝酶活性分析表明，發(fā)酵液作用于果實后，能夠保持較高的CAT活性，降低PG的活性，從而增強(qiáng)果實的抗氧化能力，降低果實軟化速率，推測該拮抗酵母的發(fā)酵液中含有的抑菌類物質(zhì)，能夠阻止外界病原菌的侵入從而達(dá)到保持冬棗品質(zhì)和抗病酶系活性的目的，并且有效的阻止果實品質(zhì)的劣變。

拮抗菌GS316發(fā)酵液能夠抑制冬棗果實在貯藏期的黑斑病，可作為一種生物保鮮液在冬棗保鮮中發(fā)揮作用。將拮抗微生物的發(fā)酵液應(yīng)用到冬棗果實的保鮮中，為冬棗果實的貯藏保鮮提供了新技術(shù)。未來可將發(fā)酵液進(jìn)行更精細(xì)的分離純化，并可明確其起抑菌作用的物質(zhì)分類及分子結(jié)構(gòu)。