彭壯壯 ， 鄒玉霞， 劉 琰， 梁少帥， 王雯祥， ， 王麗娟， 鄒聰聰， ，周 順 尤 鋒

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)， 山東 青島 266071； 2. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海洋大科學(xué)中心， 山東 青島 266071； 3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049)

促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone， GnRH)是下丘腦-垂體-性腺(hypothalamic pituitary gonadal， HPG)軸的關(guān)鍵上游信號(hào)分子。哺乳動(dòng)物中GnRH通過門靜脈作用于垂體[1]， 而大多數(shù)硬骨魚中， GnRH由下丘腦合成并以神經(jīng)分泌的方式釋放到垂體， 促進(jìn)垂體促性腺激素(gonadotrophin， GTH)的合成和釋放， 后者可以刺激性腺合成性類固醇激素， 從而調(diào)控魚類性腺分化、發(fā)育及生殖等過程[2]。

自20世紀(jì)70年代 Bmrgus和Matsuo在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)GnRH以來， 共報(bào)道了25種gnrh， 在魚類中鑒定出19種， 其中17種為魚類特有[3]?；谙到y(tǒng)發(fā)育樹分析、胚胎起源和腦中神經(jīng)元的分布， 可將所有g(shù)nrh分為gnrh1(sbgnrh)、gnrh2(cgnrh-Ⅱ)和gnrh3(sgnrh)三種類型[4-5]。一般認(rèn)為， 在魚類中，gnrh1具有神經(jīng)遞質(zhì)活性， 是調(diào)節(jié)垂體促性腺激素的主要類型， 參與魚類繁殖相關(guān)的功能[2]；gnrh2與生殖行為的調(diào)節(jié)和攝食行為調(diào)節(jié)有關(guān)[6]；gnrh3除了與性腺分化和發(fā)育等繁殖功能相關(guān)外， 還與魚類的感覺功能相關(guān)[3]。大多數(shù)魚類的腦中同時(shí)表達(dá)2種或3種gnrh[7-12]。GnRH與魚類性腺發(fā)育、性成熟及生殖相關(guān)的研究有一些報(bào)道[13-15]， 后來發(fā)現(xiàn)gnrh1、gnrh2和gnrh3分別在黑鯛(Acanthopagrus schlegelii)、黃鱔(Monopterus albus)和歐鱸(Dicentrarchus labraxL.)性腺分化期腦和性腺中表達(dá)， 在歐鱸中也有明顯性別二態(tài)性[11-12，16]， 這些研究提示GnRH在一些魚類的性腺分化中發(fā)揮作用。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)隸屬于鰈形目(Pleuronectiformes)、牙鲆科(Paralichthyidae)、牙鲆屬(Paralichthys)， 是我國(guó)具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海水養(yǎng)殖魚種。牙鲆雌性生長(zhǎng)顯著快于雄性[17]， 故研究其性腺分化機(jī)制對(duì)于進(jìn)行性別控制， 從而提升其養(yǎng)殖效益有重要價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)， 其性別決定受遺傳和環(huán)境等因素影響[18]， 對(duì)處于性腺分化前的牙鲆， 經(jīng)17β-雌二醇(E2)處理可使其分化成雌性， 經(jīng)17α-甲基睪酮(MT)或者高溫處理則使其分化為雄性[19-20]。研究還顯示， 牙鲆成體腦中表達(dá)三種類型的gnrh[21]， 但其雌、雄個(gè)體組織及性腺分化中的差異表達(dá)特征尚未見報(bào)道。本文通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)的方法，分析了三種gnrh在牙鲆雌、雄成體組織， 以及性腺分化前及分化過程中腦和性腺組織中的差異表達(dá)，以期為系統(tǒng)闡述GnRH在魚類性腺分化和發(fā)育中的作用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚及樣品采集

牙鲆成魚全長(zhǎng)(total length， TL) (30±5) cm、體重(625±25) g， 購于青島南山市場(chǎng)， 在中國(guó)科學(xué)院海洋研究所水族樓魚缸內(nèi)暫養(yǎng)3 d用于組織差異表達(dá)分析。取樣前先用60 mg/L MS-222麻醉。雌雄個(gè)體各取3尾， 每尾魚各取腦、垂體、性腺、胃、脾臟、腸、鰓、腎臟、頭腎、肝臟、心臟、眼睛和肌肉組織， 并立即放入液氮中凍存以用于總RNA提取。性腺形狀對(duì)稱， 發(fā)育正常， 卵巢呈橘紅色， 精巢呈乳白色， 性腺一半用于總RNA提取， 一半用Davison液固定， 通過組織切片HE染色鑒定性腺發(fā)育時(shí)期[22-23]。

牙鲆異質(zhì)雌核發(fā)育誘導(dǎo)魚苗在威海圣航科技水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)通過紫外照射和冷休克誘導(dǎo)培育獲得[24]，培育至1.2～1.5 cm TL時(shí)進(jìn)行雌雄表型誘導(dǎo)。將魚苗隨機(jī)分配到E2、MT和對(duì)照3個(gè)組中， 每組200尾魚苗， 分別在3 個(gè)90 L養(yǎng)殖箱培育， 養(yǎng)殖水溫維持在19～21 ℃， 鹽度30‰， 溶氧5.8～6.2 mg/L， 每日全量更換過濾海水2～3次， 光周期為14 L： 10 D， 每日投喂3～4次餌料。對(duì)照組投喂常規(guī)商用餌料。E2和MT組分別投喂含有5 mg/kg 的E2和MT (Sigma， 美國(guó))的商用餌料[23]， 該餌料配置方法為： E2和MT分別溶解于無水乙醇并均勻噴灑于餌料上， 放置黑暗條件下晾干。培育至魚苗達(dá)到10 cm TL后， 各實(shí)驗(yàn)組改投喂常規(guī)餌料， 并培育至15 cm TL。在魚苗2、3、4、6和8 cm TL時(shí)， 各組分別隨機(jī)取3尾魚， 用40 mg/L MS222麻醉后， 取其腦和性腺組織， 并立即放入液氮中速凍后存放于–80 ℃保存， 用于RNA提取。當(dāng)魚苗15 cm TL時(shí)， 每組取30尾， 用上述濃度MS222麻醉，分別采集性腺組織， 用3倍以上體積的Davison液固定， 用于組織切片HE染色分析性比[23]。

1.2 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄cDNA

采用 Trizol(Toroivd， 英國(guó))提取總RNA， 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性， Nanodrop 2000(Thermo，美國(guó))檢測(cè)其濃度及純度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(諾維贊，中國(guó)南京)， 并按其說明書將總RNA反轉(zhuǎn)至cDNA。

1.3 qPCR檢測(cè)gnrh的表達(dá)

采用qPCR方法， 檢測(cè)gnrh1、gnrh2和gnrh3在牙鲆成體組織及性腺分化期腦和性腺中的表達(dá)量。根據(jù)這些基因的cDNA序列(gnrh1、gnrh2和gnrh3的GenBank編碼號(hào)分別是DQ074693.1、DQ008580.1和DQ444281.1)， 使用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性引物(見表1)。qPCR反應(yīng)體系為20 μL， 按照TB Green? Premix Ex Taq? II (Tli RNaseH Plus)(寶日醫(yī)生物， 中國(guó))的說明書配制。其反應(yīng)程序?yàn)椋?95 ℃ 30 s 預(yù)變性； 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。牙鲆β-actin作為內(nèi)參基因[25]。使用qTOWER3G熒光定量PCR儀(Jena， 德國(guó))進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次， 利用 2–ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量[26]。使用SPSS軟件(IBM SPSS， Armonk， 美國(guó))中的單因素方差分析及 Dunnett's 檢驗(yàn)， 分析組內(nèi)和組間基因表達(dá)差異的顯著性(P＜ 0.05)。

表1 用于qPCR分析的特異性引物Tab. 1 Specific primers for gene expression analysis with quantitative polymerase chain reaction

1.4 牙鲆性別與性腺發(fā)育時(shí)期的鑒定

性腺組織固定 24 h 后， 用乙醇和二甲苯梯度脫水處理， 石蠟包埋后切片(厚度5～7 μm)， 蘇木精和伊紅(HE)染色， 乙醇脫水及二甲苯透明， 最后用中性樹膠封片。在顯微鏡(Leica DM LB2， 德國(guó))下觀察切片， 判斷性別及性腺發(fā)育時(shí)期[23]， 對(duì)性腺分化各組樣品計(jì)算其性比。

2 結(jié)果與分析

2.1 gnrh1、gnrh2和gnrh3在牙鲆雌、雄成體組織中的表達(dá)

用于gnrh1、gnrh2和gnrh3雌、雄成體組織差異表達(dá)分析的牙鲆， 經(jīng)組織學(xué)鑒定， 雄性處于精巢Ⅲ期階段， 雌性處于卵巢Ⅱ期階段(圖1)。

利用qPCR技術(shù)， 對(duì)雌、雄成體腦、垂體、性腺、胃、脾臟、腸、鰓、腎臟、頭腎、肝臟、心臟、眼睛和肌肉組織中g(shù)nrh1、gnrh2和gnrh3表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，gnrh1在雌、雄各組織中幾乎都有表達(dá)， 且在雌雄個(gè)體腦、垂體、腎臟、頭腎、肝臟和眼睛中表達(dá)較高， 在腎臟中雄性顯著高于雌性(P＜ 0.05)； 而精巢中的表達(dá)略高于卵巢， 只是沒有顯著性差異(圖2a)。gnrh2在雌雄肝臟以及雄性的腸、腎臟、頭腎、眼睛和肌肉中檢測(cè)到表達(dá)(圖2b)。gnrh3只在雄性的腎臟、眼睛和肌肉中檢測(cè)到微弱表達(dá)(圖2c)。

圖 1 牙鲆雌、雄性腺組織切片F(xiàn)ig. 1 Histological sections of the testis and ovary of Paralichthys olivaceus

圖2 gnrh1、gnrh2和gnrh3在牙鲆雌、雄成體組織中的表達(dá)Fig. 2 Expression of gnrh1， gnrh2, and gnrh3 in the male and female adult P. olivaceus tissues

2.2 gnrh1、gnrh2和gnrh3在性腺分化期的表達(dá)

通過性腺組織切片觀察確定性別， 并由此獲得各實(shí)驗(yàn)組的性比： E2、對(duì)照組雌性率均為100%， MT組雄性率為100%。

2.2.1 腦組織中的差異表達(dá)

qPCR分析結(jié)果顯示，gnrh1的表達(dá)水平隨著牙鲆性腺分化的進(jìn)行呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)， 顯示其在性腺分化過程中發(fā)揮作用； 在4 cm TL魚苗中， E2組中的表達(dá)顯著高于MT組， 也顯著高于對(duì)照組(P＜ 0.05) (圖3a)，該結(jié)果顯示gnrh1的表達(dá)在牙鲆卵巢腔出現(xiàn)的時(shí)期(4 cm TL)受E2調(diào)控。gnrh2表達(dá)水平在2 cm TL時(shí)， E2組顯著高于MT組(P＜ 0.05)， 也顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)， 該結(jié)果顯示gnrh2的表達(dá)在牙鲆性腺分化啟動(dòng)時(shí)期(2 cm TL)受E2調(diào)控； 自3 cm TL， E2和對(duì)照組的表達(dá)水平均開始出現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖3b)， 顯示其可能在雌性性腺分化啟動(dòng)時(shí)發(fā)揮作用。gnrh3在2 cm TL時(shí)，E2組和對(duì)照組的表達(dá)均顯著高于MT組(P＜ 0.05)；MT和E2組自6 cm TL開始下降， 三個(gè)組均在8 cm TL下降至最低(圖3c)， 顯示其可能在雌性性腺分化啟動(dòng)和分化中發(fā)揮作用， 但在精巢分化啟動(dòng)時(shí)作用較小。

圖3 gnrh1、gnrh2和gnrh3在牙鲆性腺分化期腦中的表達(dá)Fig. 3 Expression of gnrh1， gnrh2， and gnrh3 in the brain of P. olivaceus during gonadal differentiation period

2.2.2 性腺組織中的表達(dá)

qPCR結(jié)果顯示，gnrh1在2 cm TL時(shí)， MT、E2和對(duì)照組中的表達(dá)均為最高水平， 此后在三個(gè)組中的表達(dá)均下降至較低水平(圖4a)。gnrh2也是在2 cm TL時(shí)， 三組中的表達(dá)均顯著高于后面時(shí)期(P＜0.05)(圖4b)。gnrh3在MT和E2組中的表達(dá)在2 cm TL時(shí)， 顯著高于后面時(shí)期(P＜ 0.05)(圖 4c)。在各組中g(shù)nrh1、gnrh2和gnrh3的表達(dá)均呈現(xiàn)隨著性腺分化的開始和進(jìn)行而下降的趨勢(shì)， 顯示出它們?cè)诖菩孕韵俜只瘑?dòng)期在性腺中發(fā)揮作用。

圖4 gnrh1、gnrh2和gnrh3在牙鲆性腺分化期性腺中的表達(dá)Fig. 4 Expression of gnrh1， gnrh2， and gnrh3 in the gonads of P. olivaceus during gonadal differentiation

3 討論

在魚類中，gnrh主要表達(dá)于腦和垂體， 在其他組織中也有表達(dá)， 但在不同的魚種中呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式。在大西洋鱈魚(Gadus morhua)中， 三種gnrh在組織內(nèi)的表達(dá)較為廣泛， 其中g(shù)nrh1在卵巢、鰓、心臟、腸道和脾臟中高表達(dá)，gnrh2和gnrh3則在腦和卵巢中高表達(dá)[27]。在一齡雄性大菱鲆(Schophthalmus maximus)中，gnrh1的表達(dá)分布較gnrh2和gnrh3更為廣泛， 且在腦、垂體和性腺中呈現(xiàn)高表達(dá)的模式， 而gnrh2和gnrh3則只在腦中高表達(dá)， 在其他組織中的表達(dá)較為微弱[28]。房保海等[1]在性成熟牙鲆中的半定量PCR研究表明，gnrh1在腦、垂體、胃、脾臟、眼睛、肌肉、腸、卵巢和精巢中均表達(dá)，gnrh2則在腦、垂體、鰓、頭腎和卵巢中有表達(dá)。本研究所用牙鲆雌魚卵巢處于第Ⅱ期， 雄魚精巢處于第Ⅲ期。定量分析結(jié)果顯示，gnrh1的表達(dá)分布也呈現(xiàn)一個(gè)廣泛表達(dá)的模式， 主要在腦、垂體、腎臟、頭腎、肝臟和眼睛中高表達(dá)， 卵巢和精巢中則較微弱， 性別差異表達(dá)只在腎臟中出現(xiàn)； 其在成體腦中高表達(dá)與其在性腺分化期結(jié)束時(shí)腦中相對(duì)較高的表達(dá)結(jié)果一致。gnrh2和gnrh3均未在成魚腦、垂體和性腺中檢測(cè)到表達(dá)，且在其他組織中表達(dá)也很微弱， 在腦中未檢測(cè)到表達(dá)的結(jié)果與其在性腺分化期結(jié)束時(shí)腦中較低的表達(dá)結(jié)果一致。組織表達(dá)結(jié)果表明， 在卵巢Ⅱ期和精巢Ⅲ期的牙鲆成魚中， 對(duì)性腺發(fā)育起作用的主要是gnrh1。在性腺發(fā)育其他時(shí)期gnrh1, gnrh2和gnrh3在腦和垂體等各組織中的表達(dá)特征仍需進(jìn)一步研究。

性腺分化是魚類雌雄性別表型形成的必經(jīng)過程。孫鵬等[23]研究表明， 組織學(xué)水平上， 牙鲆在(1.25±0.13) cm TL時(shí)形成原始性腺， 然后在(3.8±0.17) cm TL出現(xiàn)卵巢腔， (6.35±0.34) cm TL出現(xiàn)輸精管結(jié)構(gòu)，分別標(biāo)志著雌、雄性腺分化的開始， 而到了(8.65±0.59) cm 和(7.6±0.86) cm TL時(shí)卵巢和精巢分別形成明顯的性腺結(jié)構(gòu)， 標(biāo)志著性腺分化的基本結(jié)束。據(jù)此，本文研究了牙鲆性腺分化啟動(dòng)期(2 cm TL)， 性腺分化前期(3 cm TL)， 性腺分化期(4～8 cm TL)腦和性腺中g(shù)nrh1、gnrh2和gnrh3的表達(dá)。在腦中它們呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式。腦中g(shù)nrh1在性腺分化過程中表達(dá)量持續(xù)上升，gnrh2在2 cm TL時(shí)有較高的表達(dá)水平， 隨后表達(dá)水平下降，gnrh3表達(dá)水平在4 cm TL前相對(duì)較高， 之后下降， 在8 cm TL時(shí)基本沒有表達(dá)。這些結(jié)果與軍曹魚(Rachycentron canadum)和鮐魚(Scomber japonicus)性腺分化期的研究不完全一致， 在這兩種魚中， 雌、雄魚腦中三種gnrh表達(dá)水平均呈上升趨勢(shì)， 這暗示不同魚種中三種gnrh對(duì)性腺分化的作用可能不同[12，29]。牙鲆gnrh1在4 cm TL、gnrh2和gnrh3在 2 cm TL 時(shí)， MT和E2組中的表達(dá)出現(xiàn)顯著差異， 且E2組表達(dá)水平均高于MT組， 這些結(jié)果提示， 腦中g(shù)nrh1與牙鲆性腺分化過程有關(guān)，gnrh2和gnrh3可能與性腺分化的啟動(dòng)有關(guān)。gnrh調(diào)控性別分化的作用在斑馬魚(Danio rerio)中得到了直接證實(shí)，gnrh3缺失的斑馬魚在受精后18 d時(shí)雄性基因表達(dá)顯著上升且性腺分化方向向雄性偏移[30]。牙鲆三種gnrh在性腺分化前的原始性腺中表達(dá)水平較高， 在性腺分化過程中呈現(xiàn)下降趨勢(shì)， 這顯示性腺中3種gnrh的表達(dá)可能都與其分化的啟動(dòng)有關(guān)。在雌性先熟的黃鱔性逆轉(zhuǎn)過程中，gnrh2及其剪接體gnrh2-sv表達(dá)水平則在初期升高， 并保持較高水平[12]， 這說明gnrh2及gnrh2-sv參與了黃鱔性逆轉(zhuǎn)過程中雄性性腺分化的啟動(dòng)， 以及分化過程。有趣的是， 在雄性先熟的黑鯛性逆轉(zhuǎn)過程中， 3種gnrh在性腺中均有表達(dá)， 提示黑鯛性腺中g(shù)nrh在其性逆轉(zhuǎn)雌性性腺分化過程中發(fā)揮作用[31]。因此，gnrh在魚類的性腺分化中發(fā)揮作用， 只是具體作用時(shí)間及方式可能存在不同，有待于進(jìn)一步的研究和比較。

4 結(jié)論

綜上所述， 牙鲆中g(shù)nrh1基因可能參與了其性腺分化的啟動(dòng)、分化過程及其性腺發(fā)育的進(jìn)行， 其gnrh2基因則主要參與了性腺分化的啟動(dòng)，gnrh3基因主要參與了性腺分化的啟動(dòng)和分化過程。這些研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步明晰牙鲆性腺分化和發(fā)育機(jī)制提供了參考。