劉建云，江和，張杰，馬百成，吳萍，熊建軍，

（1.江西省系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 九江 332000；2.九江學(xué)院醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，江西 九江 332000）

脂肪細(xì)胞由間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）定向分化而來(lái)。脂肪生成的改變可能導(dǎo)致復(fù)雜疾病的發(fā)生，如骨質(zhì)疏松癥、肥胖、糖尿病和其他脂肪代謝紊亂等［1］。應(yīng)用成脂誘導(dǎo)劑（地塞米松聯(lián)合胰島素、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤）是體外誘導(dǎo)hMSCs向成脂細(xì)胞分化的經(jīng)典方法［2］。這一過(guò)程中涉及眾多基因的轉(zhuǎn)錄激活或抑制［3-4］，但是其中的機(jī)制尚未完全明確?；谵D(zhuǎn)座酶和高通量測(cè)序的染色質(zhì)分析（assay for transposaseaccessible chromatin using sequencing，ATAC-Seq）是近年來(lái)興起的用于研究染色質(zhì)開(kāi)放性的表觀遺傳學(xué)技術(shù)，通過(guò)獲得染色質(zhì)上開(kāi)放區(qū)域的位置和活躍的調(diào)控序列，在全基因組范圍內(nèi)推測(cè)特定生理過(guò)程中可能參與的轉(zhuǎn)錄因子及其動(dòng)態(tài)規(guī)律［5-6］。本研究以人源hMSCs成脂分化的早期過(guò)程（0～7 d）為研究目標(biāo)，采用ATAC-Seq技術(shù)分析其中的染色質(zhì)開(kāi)放性變化，為進(jìn)一步了解成脂分化的調(diào)控機(jī)制及尋找有效靶基因提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理

人源性MSCs（hMSCs）由本實(shí)驗(yàn)室保存。在37 ℃，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)，間隔48 h傳代。取第6代MSCs進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，誘導(dǎo)劑成分為DMEM培養(yǎng)液，內(nèi)含10%胎牛血清，1 μmol地塞米松，10 μg/mL胰島素，200 μmol 吲哚美辛和 0.5 mmol 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤［2］。成脂誘導(dǎo)劑分別刺激細(xì)胞0 d（MSC-0d）、3 d（AD-3d）、5 d（AD-5d）和7 d（AD-7d）。刺激完畢去上清，收集細(xì)胞，在4 ℃環(huán)境下以500g離心力離心5 min，留取沉淀細(xì)胞，隨后以50 μL冰冷PBS 洗滌細(xì)胞1次，去上清液，再以50 μL冰冷裂解緩沖液懸浮細(xì)胞，離心10 min；去上清液，迅速進(jìn)入轉(zhuǎn)座反應(yīng)。

1.2 轉(zhuǎn)座反應(yīng)與純化

混合轉(zhuǎn)座反應(yīng)體系50 μL（2.5 μL Nextera Tn5 Transposase、25 μL 2 × 反應(yīng)緩沖液、22.5 μL無(wú)核酶水）在冰冷溫度懸浮細(xì)胞核，再置于37 ℃孵育30 min；隨后用Qiagen MinElute PCR純化試劑盒純化DNA用于PCR反應(yīng)［7］，反應(yīng)體系為10 μL DNA、2.5 μL PCR引物1、2.5 μL Barcoded PCR 引物2、25 μL NEBNext High-Fidelity 2× PCR Master Mix、10 μL無(wú)核酶 水。反應(yīng)條件為72 ℃延伸5 min；98 ℃ 變性30 s（1個(gè)循環(huán)）；98 ℃變性10 s；63 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min（共5個(gè)循環(huán)）；72 ℃延伸5 min；4 ℃冷卻。PCR產(chǎn)物再經(jīng)Qiagen MinElute PCR純化試劑盒純化后進(jìn)行Illumina HiSeq測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制使用Fast QC軟件。下機(jī)的原始數(shù)據(jù)經(jīng)去接頭處理。BWA軟件將clean data比對(duì)到參考基因組hg38_genecode［8］。比對(duì)分析后得到的bam文件作為輸入文件，使用MACS2軟件進(jìn)行Call Peak，篩選閾值為q＜ 0.05［9］。每個(gè)Peak 區(qū)域從5’端和3’端2個(gè)方向分別延伸200 bp 提取DNA序列，采用HOMER 軟件預(yù)測(cè)Motif，隨后將預(yù)測(cè)的motif與數(shù)據(jù)庫(kù)（HOMER、JASPAR）中已有的motif 數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配，鑒定相應(yīng)的已知motif和相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子［10］?；蚋浇盘?hào)分布圖的分析使用 deeptools 軟件［11］。

利用DAVID（the Database for Annotation，Visualizationand Integrated Discovery）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域相關(guān)聯(lián)的基因進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）富集分析［12］；基于京都基因與基因組 百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Peak鄰近基因 Pathway富集分析［13］。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域的鑒定

在成脂誘導(dǎo)劑刺激下，原代培養(yǎng)的hMSCs逐漸出現(xiàn)分化至14 d，成功分化為包含脂滴的脂肪細(xì)胞，見(jiàn)圖1。

圖1 油紅O對(duì)hMSC分化不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的染色 ×200Fig.1 Oil red O staining of hMSCs at different time points of differentiation ×200

測(cè)序原始數(shù)據(jù)經(jīng)篩選后，采用BWA軟件比對(duì)，各組細(xì)胞（MSC-0d、AD-3d、AD-5d、AD-7d）的Reads比對(duì)率均高于95%；Reads信號(hào)在基因區(qū)域的分布主要在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)（TSS）附近（圖2A）。使用MACS軟件對(duì)各組細(xì)胞Reads進(jìn)行Call Peak，在MSC-0d組篩選出110 369個(gè)Reads顯著富集的區(qū)域（Peak），在AD-3d組篩選出68 327個(gè)Peak，在AD-5d組篩選出99 362個(gè)Peak，在AD-7d組篩選出77 712個(gè)Peak，表明hMSCs向成脂細(xì)胞分化的前3 d，轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域明顯減少，隨后逐漸恢復(fù)（圖2B）。各組細(xì)胞的Peak分布在啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)之間的比例大約為10%～20%，各組之間存在細(xì)微差異。在成脂誘導(dǎo)的第3天，位于啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域的比例最高（17.63%），而此時(shí)全基因組Reads信號(hào)反而最少（圖2C）。

圖2 細(xì)胞染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域的鑒定Fig.2 Identification of opening chromatin regions in each group of cells

2.2 染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域的motif分析

采用Homer軟件對(duì)4組細(xì)胞染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域的DNA序列進(jìn)行motif分析，結(jié)果顯示，各組細(xì)胞中結(jié)合最多的motif均是亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，如Fra1、Atf3、Fra2、JunB、BATF、AP-1等（結(jié)果未顯示）。隨后對(duì)AD-3d/MSC-0d、AD-5d/MSC-0d、AD-7d/MSC-0d組間差異motif分別進(jìn)行分析，在AD-3d/MSC-0d組間，數(shù)量上調(diào)最為顯著的motif為CEBP、EBF2、NF1等；在AD-5d/MSC-0d組間，數(shù)量上調(diào)最為顯著的motif為CEBP、EBF2、RUNX1等；在AD-7d/MSC-0d組間，轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量上調(diào)最為明顯的motif則為TEAD3、CEBP、RUNX1等（圖3A）。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferatorsactivated receptors，PPARs）為調(diào)控成脂早期分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，本研究重點(diǎn)追蹤了PPARγ結(jié)合motif排序的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果顯示，PPARγ結(jié)合的motif在MSC-0d的富集排序?yàn)?60位；在AD-3d和AD-5d，富集排序分別升至第161位和第170位；而在AD-7d，PPARγ的motif富集排序又降至350位（圖3B），表明成脂分化的第3～5天，PPARγ轉(zhuǎn)錄因子被顯著激活。

圖3 各組細(xì)胞間差異motif分析Fig.3 Motif analysis in each group

2.3 GO富集分析結(jié)果

MSC-0d、AD-3d、AD-5d和AD-7d 4組細(xì)胞染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域所關(guān)聯(lián)的基因的主要生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，大多涉及蛋白磷酸化、代謝等過(guò)程（結(jié)果未顯示）。通過(guò)對(duì)各組間差異染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域所關(guān)聯(lián)的基因進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)在AD-3d/MSC-0d組間，上調(diào)最為顯著的BP有細(xì)胞黏附，細(xì)胞外基質(zhì)組織，Rho-GTPase活性的正性調(diào)控等；在AD-5d/MSC-0d組間，上調(diào)最為顯著的BP有細(xì)胞黏附，細(xì)胞外基質(zhì)組織，細(xì)胞形態(tài)調(diào)控等；在AD-7d/MSC-0d組間，上調(diào)最為顯著的BP則是GTPase活性的正性調(diào)節(jié)，內(nèi)皮細(xì)胞遷移的正性調(diào)節(jié)和血管生成等（圖4）。以上結(jié)果表明，成脂分化第7天，基因功能的變化與前5 d有明顯不同。

圖4 各組細(xì)胞間差異Peak鄰近基因GO富集分析Fig.4 GO enrichment analyses of peak adjacent gene differences in each group

2.4 Peak鄰近基因功能Pathway富集分析結(jié)果

Pathway富集分析結(jié)果顯示，MSC-0d、AD-3d、AD-5d和AD-7d 4組細(xì)胞染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域所關(guān)聯(lián)的Pathway并無(wú)明顯差別（結(jié)果未顯示）。而組間差異染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域所關(guān)聯(lián)Pathway有顯著變化。在AD-3d/MSC-0d組間，上調(diào)最為顯著的Pathway有Rap1信號(hào)通路，蛋白消化與吸收通路，PPARs信號(hào)通路，PI3K-Akt 信號(hào)通路等，而與脂肪酸代謝密切相關(guān)的脂肪酸代謝通路也顯著上調(diào)；在AD-5d/MSC-0d組間，上調(diào)較為顯著的Pathway有Rap1信號(hào)通路，黏附連接，PPARs信號(hào)通路等；在AD-7d/MSC-0d組間，上調(diào)較為顯著的Pathway有Rap1信號(hào)通路，黏附連接，黏著斑激酶通路等，而PPARs信號(hào)通路和脂肪酸代謝通路活性顯著下降，見(jiàn)圖5。

圖5 各組細(xì)胞間差異 Peak 鄰近基因Pathway 富集分析Fig.5 Pathway enrichment analysis of peak adjacent gene differences in each group

3 討論

脂肪細(xì)胞來(lái)源于hMSCs的分化，這一過(guò)程通常被劃分為2個(gè)階段：（1）MSCs定向分化為前脂肪細(xì)胞階段（決定期）；（2）前脂肪細(xì)胞最終分化為成熟和功能性脂肪細(xì)胞（終末分化期）［14-15］。本項(xiàng)研究著重關(guān)注hMSCs成脂分化的早期階段，所以將觀察的染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)的時(shí)間點(diǎn)定為誘導(dǎo)后的7 d之內(nèi)。

“開(kāi)放”和“封閉”染色質(zhì)分別代表基因的轉(zhuǎn)錄激活和抑制狀態(tài)［16］。ATAC-Seq測(cè)序結(jié)果顯示，hMSCs有超過(guò)十萬(wàn)個(gè)染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域，且信號(hào)密度在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近最高，表明MSCs在體外培養(yǎng)條件下就具有較高的基因表達(dá)活性。成脂誘導(dǎo)劑作用第3天，染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域的數(shù)量發(fā)生顯著下降，但是信號(hào)趨向轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)集中，推測(cè)此階段的細(xì)胞功能可能被專一地錨定在譜系定向，而其余功能被弱化。成脂誘導(dǎo)的第5天和第7天，染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域的數(shù)量緩慢回升，提示轉(zhuǎn)錄因子活性增多，目前，這一動(dòng)態(tài)變化尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。

motif分析反映活化轉(zhuǎn)錄因子活性的動(dòng)態(tài)變化。在成脂分化的前5 d，motif的變動(dòng)較為相似，最為明顯的有CEBP、EBF2、NF1等。CEBP家族是脂肪分化重要的調(diào)節(jié)因子［17］，CEBPα，CEBPβ和CEBPδ促進(jìn)脂肪生成，而CEBPγ則起抑制作用［18］。在此次測(cè)序分析中，沒(méi)有對(duì)各亞型進(jìn)行細(xì)分，需要在下一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中予以驗(yàn)證。值得關(guān)注的是，成脂分化第7天，發(fā)生顯著變化的motif是TEAD3而非CEBP。TEAD3是轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子家族成員，有研究［19］顯示其也參與調(diào)控成脂分化，但作用機(jī)制尚不明確。以上結(jié)果表明，成脂分化不同時(shí)間點(diǎn)，調(diào)控細(xì)胞功能的轉(zhuǎn)錄因子有不同的側(cè)重點(diǎn)。本研究重點(diǎn)觀察PPARγ，因其是調(diào)控脂肪分化的重要的轉(zhuǎn)錄因子之一［20］。PPARγ的結(jié)合活性在經(jīng)歷明顯升高后于第7天下降至正常水平，一方面表明前5 d可能為成脂定向分化的關(guān)鍵時(shí)期，另一方面也證實(shí)PPARγ是參與成脂分化的關(guān)鍵因子。

Peak鄰近基因GO富集分析顯示，成脂誘導(dǎo)劑作用的第3天和第5天，上調(diào)的基因功能與細(xì)胞黏附、血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)形成有關(guān)；第7天，新增的基因功能轉(zhuǎn)變?yōu)樾》肿覩TPase活性、內(nèi)皮細(xì)胞遷移等活動(dòng)，提示細(xì)胞功能出現(xiàn)轉(zhuǎn)變。差異Pathway富集分析顯示，Rap1信號(hào)通路在成脂分化的前期都呈現(xiàn)顯著激活狀態(tài)，提示Rap1信號(hào)通路對(duì)于脂肪細(xì)胞分化可能具有重要的意義，值得進(jìn)一步研究。此外，PPARγ信號(hào)通路在第3天和第5天中都呈現(xiàn)明顯激活狀態(tài)，與第7天不同，均提示分化第5～7天前后，細(xì)胞可能發(fā)揮不同的生理功能。

本研究分析了hMSCs成脂分化早期染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域的動(dòng)態(tài)變化，下一步工作計(jì)劃聯(lián)合RNA-Seq數(shù)據(jù)和ChIP-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析，為研究hMSCs定向分化的調(diào)控機(jī)制及骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制提供新的切入點(diǎn)。