黃琬淇，劉玉思，顧卉，袁正偉

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)小兒先天畸形重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110004）

神經(jīng)管畸形（neural tube defects，NTDs）作為最嚴(yán)重的出生缺陷之一，全球發(fā)病率約為1‰～10‰［1］。由于神經(jīng)管的閉合失敗，可出現(xiàn)如無(wú)腦兒、脊柱裂、腦脊髓膜膨出等一系列表型［2］。神經(jīng)上皮細(xì)胞的過(guò)度凋亡導(dǎo)致神經(jīng)管閉合異常，產(chǎn)生NTDs［3］。全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活動(dòng)影響神經(jīng)管閉合，引起NTDs的發(fā)生［4-5］，本研究組前期利用ATRA成功制作了NTDs胎鼠模型。

微RNA（microRNAs，miRNA）是一種長(zhǎng)度為22～24 nt的內(nèi)源性小型非編碼 RNA 分子，通過(guò)與靶基因的3’端非翻譯區(qū)（3’untranslated regions，3’-UTR）結(jié)合，誘導(dǎo)mRNA降解或抑制翻譯，從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)［6］。miR-322是細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)活動(dòng)的重要調(diào)控因子，對(duì)于心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及其他器官均有一定的保護(hù)作用［7-8］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-322-5p可抑制高糖誘導(dǎo)的小鼠神經(jīng)干細(xì)胞凋亡和NTDs的發(fā)生。本課題組前期研究［9-10］發(fā)現(xiàn)，胚胎體外注射miR-322-5p-mimic，對(duì)NTDs有治療作用。但它與ATRA誘導(dǎo)的大鼠NTDs的關(guān)系仍有待研究。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4）是NADPH氧化酶家族的一個(gè)亞型成員，它的過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致神經(jīng)元的自身毒性以及大腦的局部缺血［11］。在高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)病變動(dòng)物模型中，周圍神經(jīng)系統(tǒng)施旺細(xì)胞NOX4表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞氧化應(yīng)激參與周圍神經(jīng)損傷［12］。但NOX4在ATRA誘導(dǎo)的大鼠NTDs中的表達(dá)及作用尚未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)TargetScan及starBase生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，NOX4是miR-322-5p的靶點(diǎn)，在NOX4mRNA的非翻譯區(qū)存在miR-32-5p的潛在結(jié)合位點(diǎn)。本研究擬觀察miR-322-5p與NOX4在ATRA誘導(dǎo)的大鼠NTDs模型中的表達(dá)及其對(duì)凋亡活動(dòng)的影響，探討NTDs的發(fā)生機(jī)制，以為其診療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠神經(jīng)干細(xì)胞（C17.2，貝納創(chuàng)聯(lián)生物研究所），ATRA（美國(guó)Sigma公司），MEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），MEM NEAA（美國(guó)Gibco公司），胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），青霉素鏈霉素溶液/雙抗（美國(guó)Hyclone公 司），miR-322-5p mimics/inhibitor、mimics/inhibitor-NC（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），NOX4 plasmid（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司）。JetPRIME（法國(guó)PolyPlus-transfection公司），miRNeasy Mini Kit（美國(guó)Qiagen公司），miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒（上海生工生物工程有限公司），SYBR Premix Ex Taq Kit（大連寶生物工程有限公司），BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），NOX4兔多克隆抗體（美國(guó)Rocklamd公司），Bcl-2鼠多克隆抗體（美國(guó)Sigma公司），Bax兔多克隆抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司），β-actin鼠單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/抗小鼠IgG（美國(guó)Proteintech公司），UltraSensitive SP IHC kit、辣根過(guò)氧化氫DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠NTDs模型制備及組織樣本收集：Wistar大鼠（北京華阜康生物技術(shù)有限公司）飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，按雌∶雄為2 ∶1于前一晚合籠，第二日早將大鼠分籠，陰道涂片見(jiàn)精子的雌鼠單獨(dú)放于一籠，記為孕0 d（E0）。于E10將已孕雌性大鼠隨機(jī)分為2組，NTDs組灌胃140 mg/kg橄欖油溶解的ATRA，對(duì)照組給予同體積的橄欖油灌胃。于E11剖宮取出胎鼠，獲取脊髓組織。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色：將胚鼠脊髓固定于4%多聚甲醛中，石蠟包埋，制4 μm厚切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，于去離子水中水化?？乖迯?fù)后，使用UltraSensitive SP IHC試劑盒處理切片，滴加一抗anti-NOX4（1 ∶800），4 ℃孵育過(guò)夜，第二日DAB顯色，蘇木素復(fù)染，流水返藍(lán)1 h除去余色，封片拍照。

1.2.3 免疫熒光染色：切片在二甲苯中脫蠟，梯度乙醇脫水，去離子水水化，0.1% Triton X-100處理。動(dòng)物血清封閉后，加入anti-NOX4抗體（1 ∶1 000），4℃孵育過(guò)夜。PBS沖洗3次，室溫?zé)晒鈽?biāo)記的二抗孵育（1 ∶200）2 h。DAPI染色，熒光顯微鏡觀察。

1.2.4 細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：用含10%胎牛血清、1%MEM NEAA、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的MEM培養(yǎng)液在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞C17.2。接種細(xì)胞至6孔板，轉(zhuǎn)染前培養(yǎng)24 h。以JetPRIME為轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染miRNA-空白對(duì)照（miRNC）、miR-322-5p mimic、miR-322-5p inhibitor以 及NOX4高表達(dá)質(zhì)粒至C17.2細(xì)胞。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR：用miRNeasy Mini試劑盒從胚胎脊髓組織和C17.2中提取總RNA，用miRNA First Strand cDNA Synthesis反轉(zhuǎn)錄RNA。以U6為內(nèi)參，用SYBR Premix Ex Taq試劑盒行實(shí)時(shí)定量PCR。引物序列如下：miR-322-5p F鏈為AGCAGCAATTCATGTTT TGGAA，R鏈為GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC；U6F鏈為CTCGCTTCGGCAGCACA，R鏈為AACGCT TCACGAATTTGCGT；β-actinF鏈為GGAGATTACTGC CCTGGCTCCTA，R鏈為GACTCATCGTACTCCTGCTT GCTG。

1.2.6 Western blotting：自胚胎脊髓和C17.2細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)。SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h。加入一抗 NOX4（1 ∶1 000），Bax（1 ∶1 000），Bcl-2（1 ∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜。次日用TBST洗膜3次（10 min/次），室溫下與HRP兔和鼠二抗（1 ∶5 000）孵育2 h，ECL發(fā)光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用 GraphPad 8.0統(tǒng)計(jì)軟件作圖。計(jì)量資料以表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-322-5p和NOX4在大鼠NTDs形成中的表達(dá)

2.1.1 ATRA誘導(dǎo)的NTDs胎鼠脊髓組織神經(jīng)管形態(tài)及NOX4定位表達(dá)情況：免疫組織化學(xué)染色和組織免疫熒光結(jié)果顯示，NTDs組神經(jīng)管形態(tài)明顯異常，且胚胎脊髓中NOX4表達(dá)顯著高于對(duì)照組，見(jiàn)圖1。

圖1 E11對(duì)照組和NTDs組大鼠胚胎脊髓組織神經(jīng)管的形態(tài)和NOX4表達(dá)情況 ×200Fig.1 Morphology and NOX4 expression of spinal cord neural tube between E11 control and NTDs rats ×200

2.1.2 miR-322-5p和NOX4在NTDs胎鼠脊髓組織中的表達(dá)情況：實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NTDs組脊髓組織中miR-322-5p mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)（均P＜ 0.05），見(jiàn)圖2。提示miR-322-5p的表達(dá)對(duì)NTDs可能有抑制作用，而NOX4可能促進(jìn)NTDs的形成。

圖2 E11對(duì)照組和NTDs組大鼠胚胎脊髓組織miR-322-5p和NOX4表達(dá)情況Fig.2 Comprison of miR-322-5p mRNA and NOX4 protein expression in the embryonic rat spinal cord tissues between control and NTDs groups

2.2 ATRA致畸胎鼠脊髓中凋亡蛋白的表達(dá)情況

Western blotting結(jié)果顯示，ATRA誘導(dǎo)的NTDs組中，NOX4蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，促凋亡蛋白Bax表達(dá)增強(qiáng)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減弱（P＜ 0.05），見(jiàn)圖3。表明NTDs胎鼠脊髓中細(xì)胞凋亡增加，提示NOX4可能促進(jìn)凋亡的發(fā)生。

圖3 凋亡相關(guān)蛋白在對(duì)照組和NTDs組胎鼠脊髓組織中的表達(dá)情況Fig.3 The expression of apoptosis-related proteins in the embryonic rat spinal cord of control and NTDs groups

2.3 miR-322-5p負(fù)調(diào)控NOX4的表達(dá)并減少細(xì)胞凋亡

2.3.1 轉(zhuǎn) 染miR-322-5p mimics和inhibitor后C17.2神經(jīng)干細(xì)胞中NOX4的表達(dá)：Western blotting結(jié)果顯示，C17.2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-322-5p mimic 48 h后，miR-322-5p表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖4 A，P＜ 0.05），NOX4蛋白表達(dá)下調(diào)（圖4B、4C，P＜ 0.05）；轉(zhuǎn)染miR-322-5p inhibitor后，miR-322-5p表達(dá)水平下調(diào)（圖4D，P＜0.05），NOX4表達(dá)下調(diào)（圖4E、4F，P＜ 0.05）

圖4 轉(zhuǎn)染miR-322 mimic/inhibitor對(duì)C17.2細(xì)胞中NOX4表達(dá)的影響Fig.4 Regulation of NOX4 after transfection of miR-322 mimic/inhibitor

2.3.2 miR-322/NOX4對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡的影響：Western blotting結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染NOX4高表達(dá)質(zhì)粒的神經(jīng)干細(xì)胞中，NOX4過(guò)表達(dá)，促凋亡基因Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)。miR-322-5p mimic與NOX4過(guò)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，miR-322-5p mimic抑制NOX4表達(dá)的同時(shí)，也抑制了Bax表達(dá)，促進(jìn)了Bcl-2表達(dá)（P＜ 0.05），見(jiàn)圖5。提示miR-322-5p能夠通過(guò)抑制NOX4表達(dá)抑制神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡。

圖5 C17.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-322-5p mimic和NOX4后NOX4和凋亡蛋白的表達(dá)水平Fig.5 Expression of NOX4 and apoptotic proteins after transfection miR-322-5p mimic and NOX4 of C17.2

3 討論

NTDs作為一種多因素疾病，對(duì)于其發(fā)病機(jī)制的了解仍較局限。本研究利用ATRA誘導(dǎo)大鼠NTDs模型，發(fā)現(xiàn)NOX4作為miR-322-5p的靶標(biāo)，可以通過(guò)參與細(xì)胞凋亡調(diào)控大鼠神經(jīng)管閉合的過(guò)程，在大鼠NTDs發(fā)生中扮演重要角色。

細(xì)胞凋亡對(duì)于維持胚胎的正常發(fā)育具有重要作用，在神經(jīng)管閉合進(jìn)程中，中線細(xì)胞的過(guò)度凋亡導(dǎo)致神經(jīng)管的閉合失敗以及一系列NTDs表型的形成［13］。研究［14］發(fā)現(xiàn)，miRNA對(duì)NTDs具有調(diào)控作用。在高糖環(huán)境下，miR-129-2通過(guò)抑制細(xì)胞自噬可誘導(dǎo)NTDs發(fā)生［15］。本課題組前期研究［16］發(fā)現(xiàn)，孕產(chǎn)婦糖尿病或體外高血糖會(huì)增加miR-200b的水平，CITED2是miR-200b的靶標(biāo)，被高糖下調(diào)。由此可見(jiàn)，miR-200b抑制劑可逆轉(zhuǎn)培養(yǎng)的胚胎中高葡萄糖誘導(dǎo)的CITED2下調(diào)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而改善胚胎發(fā)育中的NTDs。miR-322也參與了細(xì)胞凋亡活動(dòng)的調(diào)控［17］。缺氧條件可引起心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，并伴隨miR-322明顯上調(diào)［18］。本研究組前期還發(fā)現(xiàn)miR-322-5p可以通過(guò)抑制TRAF3減少高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡［9］。但miR-322-5p是否參與ATRA誘導(dǎo)的大鼠NTDs尚無(wú)報(bào)道。

NOX4作為NOX酶家族成員是細(xì)胞超氧陰離子的來(lái)源，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)以及成熟神經(jīng)元的功能［19］，并可通過(guò)產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。研究［20-21］顯示，糖皮質(zhì)激素可通過(guò)NOX4/ROS/p38 MAPK途徑誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，心肌細(xì)胞NOX4高表達(dá)，凋亡也隨之增加。由于神經(jīng)元的抗氧化性較弱，ROS的產(chǎn)生是神經(jīng)系統(tǒng)疾病和細(xì)胞凋亡的主要因素。NOX4對(duì)神經(jīng)元的凋亡也具有相似作用，它參與大鼠缺血再灌注過(guò)程中ROS誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡和腦損傷［22］。此外，慢性氟暴露會(huì)誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)NOX4的表達(dá)，而NOX4高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致血腦屏障損害，小膠質(zhì)細(xì)胞活化和神經(jīng)元喪失，從而導(dǎo)致腦功能受損［23］。但關(guān)于大鼠NTDs胚胎中脊髓NOX4的表達(dá)尚無(wú)研究。本研究結(jié)果顯示，在NTDs胎鼠模型脊髓中，NOX4表達(dá)水平上調(diào)，且伴隨促凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)增加，抗凋亡相關(guān)蛋白減少。結(jié)合生物信息學(xué)分析的結(jié)果，NOX4是miR-322-5p的靶基因，當(dāng)神經(jīng)干細(xì)胞C17.2在轉(zhuǎn)染NOX4高表達(dá)質(zhì)粒的同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-322模擬物，可降低NOX4的表達(dá)水平，且伴隨抗凋亡相關(guān)蛋白增加，促凋亡蛋白減少。由此可見(jiàn)，miR-322-5p能夠抑制NOX4的表達(dá)，抑制神經(jīng)管發(fā)育過(guò)程神經(jīng)細(xì)胞的過(guò)度凋亡。

綜上所述，miR-322-5p能夠下調(diào)NOX4的表達(dá)，減少大鼠胚胎神經(jīng)管閉合過(guò)程中細(xì)胞凋亡，減少NTDs的發(fā)生，因此，miR-322-5p可能成為NTDs治療的新靶點(diǎn)。