崔暢婉，孫崢嶸

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院生物樣本庫，沈陽 110004）

炎癥性腸病包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎，作為多種因素誘導(dǎo)的腸道疾病在世界范圍流行，其流行病學(xué)、病因?qū)W、遺傳學(xué)和表型被廣泛研究［1］。炎癥性腸病手術(shù)有關(guān)的并發(fā)癥如狹窄、瘺管和膿腫較為常見，因此探索預(yù)防和輔助治療機(jī)制勢在必行。有研究［2］證實(shí)，駱駝奶在某些疾病中可能具有治療作用，包括糖尿病、自閉癥、癌癥和酒精引起的中毒等，但駱駝奶的臨床療效和治療價(jià)值目前尚不十分清楚。先前的研究［3］表明，駱駝奶可能參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞因子分泌，對維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要作用。本研究采用噁唑酮（oxazolone，OXA）誘導(dǎo)的小鼠腸炎模型模擬人炎癥性腸病發(fā)病過程，通過灌胃方式給予駱駝奶，檢測腸黏膜免疫細(xì)胞和免疫因子的改變，探討駱駝奶對小鼠腸炎的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

SPF級BALB/c小鼠40只，由北京維通利華生物科技有限公司提供，18～20 g，5～6周齡，雄性，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會批準(zhǔn)。駱駝奶（新疆旺源有限公司），DMEM培養(yǎng)基、乙二胺四乙酸、膠原酶、DNA酶（美國Gibco公司），胎牛血清、離子霉素、佛波酯、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑布雷非德菌素A、OXA（美國Sigma公司），流式抗體CD4-異硫氰酸熒光素、CD3-紫草素葉綠素、γ干擾素（interferon γ，IFN-γ）-別藻藍(lán)蛋白、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-17-藻紅蛋白、CD25-別藻藍(lán)蛋白、ELISA試劑盒（美國R&D Systems公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立：5～6周BALB/c小鼠40只，在特定的無病原體條件（溫度25 ℃，濕度60%～65%，12 h光照）下飼養(yǎng)和繁殖。在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后的第1～2天戊巴比妥鈉（8 μL/g）注射給藥，待小鼠麻醉后，剃毛并暴露皮膚，涂擦3% OXA溶液（溶于100%乙醇，200 μL/只），并于第6天將l% OXA溶液（溶于50%乙醇，150 μL/只）經(jīng)肛門給藥，通過直徑2.5 mm的硅膠細(xì)軟管插入距肛緣4 cm左右，注意避免用力過大造成腸壁損傷。經(jīng)肛門給藥后，將小鼠保持倒立1 min，使藥物充分接觸腸壁，確保造模成功。將小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組20只。l% OXA給藥當(dāng)天起，實(shí)驗(yàn)組小鼠每天駱駝奶灌胃（2 g/kg，溶于200 μL雙蒸水），對照組連續(xù)200 μL雙蒸水灌胃，7 d后斷頸法處死小鼠，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）評分：每天記錄小鼠體質(zhì)量、大便形態(tài)和隱血改變情況，用DAI評估結(jié)腸炎嚴(yán)重程度。體質(zhì)量改變：體質(zhì)量減輕＜1%，0分；體質(zhì)量減輕1%～＜5%，1分；體質(zhì)量減輕5%～＜10%，2分；體質(zhì)量減輕10%～＜15%，3分；體質(zhì)量減輕≥15%，4分。大便形態(tài)：正常，0分；稍稀，2分；稀便，3分；水樣便，4分。隱血試驗(yàn)：陰性，0分；弱陽性，1分；陽性，2分；強(qiáng)陽性，3分；肉眼血便，4分。計(jì)算DAI=（體質(zhì)量改變得分+大便形態(tài)得分+隱血試驗(yàn)得分）/3。

1.2.3 腸黏膜固有層細(xì)胞提取：斷頸法處死小鼠后，剝離干凈結(jié)腸至肛門段腸管，在含有乙二胺四乙酸的DMEM培養(yǎng)基中剪碎并移至離心管。固有層細(xì)胞提取參見文獻(xiàn)［4］。在含有100 U/mL膠原酶和5 U/mL DNA酶Ⅰ的DMEM培養(yǎng)基中37 ℃孵育90 min，之后4 ℃、3 000 r/min離心10 min。棄上清，保留細(xì)胞沉淀，以梯度離心分離液分離細(xì)胞并回收中間段液體，3 000 r/min離心10 min，保留細(xì)胞沉淀，棄上清。

1.2.4 流式細(xì)胞分析：提取小鼠腸黏膜固有層淋巴細(xì)胞，并于細(xì)胞混懸液中加入胞外染色抗體進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)表面染色。向細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入佛波酯25 ng/mL，離子霉素1 μg/mL，布雷非德菌素A 10 μg/mL，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育5 h。之后將細(xì)胞破膜固定，再加入胞內(nèi)染色抗體，4 ℃孵育30 min，之后高速離心機(jī)4 ℃、4 800 r/min離心1 min，棄掉上清后重懸沉淀。FACS Canto Ⅱ流式細(xì)胞儀檢測，應(yīng)用FlowJo7.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 ELISA：臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞，稀釋后將細(xì)胞接種 于96孔 板，每孔2×105/mL，200 μL，37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育48 h，回收上清，加入一抗室溫避光過夜。第2天棄掉孔中液體，洗滌3次，并以封閉液封閉。加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品（50 μL/孔），靜置2 h。加二抗，室溫靜置2 h。棄去孔中液體，加辣根過氧化物酶（50 μL/孔），靜置20 min后加入底物，20 min后以終止液終止反應(yīng)，立即上機(jī)檢測450 nm處吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量變化和DAI評分

1% OXA灌腸給藥當(dāng)天作為第1天，記錄小鼠體質(zhì)量和排便情況。給藥第1天小鼠體質(zhì)量記為1，每日記錄體質(zhì)量比值（當(dāng)日小鼠體質(zhì)量/第1天小鼠體質(zhì)量）。與對照組小鼠相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量下降程度減弱、DAI評分低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示駱駝奶灌胃后，OXA誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎發(fā)展緩解，駱駝奶可能對腸道有保護(hù)作用。見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠體質(zhì)量和DAI評分Fig.1 Body weight and disease activity index（DAI）score of mice in experimental and control groups

2.2 小鼠腸道黏膜淋巴細(xì)胞比例

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠腸黏膜淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+T細(xì)胞（分別為5.78%±0.34%和10.91%±0.86%）和CD4+IFN-γ+T細(xì)胞比例（分別為9.48%±0.92%和15.95%±1.13%）升高，CD4+IL-17+T細(xì)胞比例（分別為8.23%±1.16%和4.07%±1.02%）下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示駱駝奶可能具有調(diào)節(jié)小鼠腸道黏膜免疫細(xì)胞增殖分化的作用，促進(jìn)IFN-γ+輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th細(xì)胞）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg細(xì)胞）增殖，抑制Th17細(xì)胞增殖。駱駝奶可能通過抵抗OXA誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞比例失衡，從而緩解腸道炎癥。見圖2。

圖2 小鼠腸道淋巴細(xì)胞比例Fig.2 Proportions of lymphocytes in mice colon

2.3 小鼠腸道黏膜細(xì)胞因子分泌

ELISA結(jié)果表明，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠腸黏膜淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17、IL-4、IL-13濃度降低，IFN-γ濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。提示駱駝奶可能通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的濃度，緩解OXA誘導(dǎo)的小鼠腸炎。見圖3。

圖3 小鼠腸道黏膜固有層細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子濃度Fig.3 Concentration of cytokines in the culture supernatant of lamina propria cells from mice colon

3 討論

炎癥性腸病是由易感基因、環(huán)境、宿主腸道微生物群數(shù)量和種類、病毒和真菌以及免疫穩(wěn)態(tài)失衡等多種因素引起的一系列復(fù)雜的病理改變。腸黏膜免疫系統(tǒng)與炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，包括腸上皮細(xì)胞、固有層淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和Treg細(xì)胞/B淋巴細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子和趨化因子［5］。根據(jù)HELLER等［6］的方法，OXA誘導(dǎo)的BALB/c小鼠急性腸炎模型，在疾病進(jìn)展、病理改變以及免疫狀態(tài)改變等方面，均可作為潰瘍性結(jié)腸炎的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探討其發(fā)病機(jī)制和藥物應(yīng)用。

駱駝科與?？朴泻艽蟮倪M(jìn)化差異，因此駱駝奶與牛奶的蛋白質(zhì)組成不同，駱駝奶是對牛奶過敏的人群較好的一種替代選擇。研究［7］證明，駱駝奶中富含的胰島素和不飽和脂肪酸能夠調(diào)節(jié)糖尿病患者的血糖水平，增加患者血清中的超氧化物酶歧化酶、谷胱甘肽過氧物酶活性，降低糖尿病發(fā)生率。放化療或長期應(yīng)用抗生素會對人體免疫系統(tǒng)造成破壞，對骨髓祖細(xì)胞造成損傷，引起免疫細(xì)胞減少，引起患者免疫抑制，增加病原微生物感染概率。有研究［8］表明，飲用駱駝奶可以調(diào)節(jié)免疫功能，促進(jìn)免疫穩(wěn)態(tài)恢復(fù)。潰瘍性結(jié)腸炎作為一種不典型CD4+Th2型淋巴細(xì)胞因子反應(yīng)性疾病，其特征性免疫因子改變，包括IL-13等表達(dá)增多［9］。Th17細(xì)胞分泌IL-17A、IL-17F、IL-21等多種細(xì)胞因子，在炎癥性腸病發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。

本研究以O(shè)XA誘導(dǎo)的BALB/c小鼠急性腸炎模型作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，模擬患者潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病過程，探究駱駝奶對小鼠腸道黏膜免疫的調(diào)節(jié)機(jī)制，進(jìn)一步探究駱駝奶的輔助治療作用。本研究中，CD4+IFN-γ+T細(xì)胞比例增加，說明駱駝奶對小鼠腸炎的保護(hù)作用可能與調(diào)節(jié)T細(xì)胞向Th1型細(xì)胞分化有關(guān)。促炎的Th2型細(xì)胞因子包括IL-4和IL-13水平降低，也提示了小鼠腸道免疫穩(wěn)態(tài)恢復(fù)。Treg細(xì)胞激活后高水平表達(dá)CD25［10］。本研究中，實(shí)驗(yàn)組小鼠CD4+CD25+T細(xì)胞比例較對照組增加，而Treg細(xì)胞的增加有助于腸炎恢復(fù)。結(jié)果提示，飲用駱駝奶可能緩解腸炎進(jìn)展。

總之，本研究表明，駱駝奶可能通過調(diào)節(jié)Th1-Th2/Treg細(xì)胞增殖及其細(xì)胞因子分泌，糾正失衡的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，從而改善OXA誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的疾病進(jìn)展。這些結(jié)果表明，駱駝奶可能為緩解炎癥性腸病疾病進(jìn)程提供一種新的輔助治療方法。