叢明，單偉，石玉秀

（1.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經外科，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室，遼寧 錦州 121001；3.中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院組織胚胎學教研室，沈陽 110122）

創(chuàng)傷后應激障礙（post-traumatic stress disorder，PTSD）是指人遭受突發(fā)的巨大災難或嚴重威脅而出現(xiàn)并長期存在的精神障礙［1］。研究［2］顯示，PTSD患者大腦杏仁核組織出現(xiàn)體積縮小、細胞死亡等病理改變。本課題組前期研究［3-4］證實了PTSD造模大鼠杏仁核及海馬組織中神經細胞均發(fā)生了凋亡；結果顯示，PTSD大鼠杏仁核神經細胞中細胞周期因子CDK4和 CyclinD1表達增高，而且這種表達增高時間與細胞凋亡時間接近，說明PTSD可能引起細胞周期的異常重啟，從而造成了神經細胞的凋亡。WANG等［5］在中樞神經系統(tǒng)損傷引起細胞凋亡的研究中發(fā)現(xiàn)細胞周期因子pRB和E2F1存在異常高表達，這種高表達是損傷刺激激活了CDK4/Cyclin D1-pRB-E2F信號通路引起的；而pRB［6-7］和E2F1［8-9］高表達誘導受損的成熟神經細胞最終走向凋亡。

本研究采用Wistar大鼠建立了單一連續(xù)應激（single-prolonged stress，SPS）經典PTSD動物模型，探討了CDK4-pRB-E2F1通路在 PTSD引起神經細胞凋亡中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選取健康雄性8～10周齡Wistar大鼠50只（中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供），體質量（150±20）g。大鼠分隔飼養(yǎng)，每12 h光照與黑暗交替，溫度22～25℃，大鼠可自由攝取食物和水。SPS處理后1 d、4 d、7 d、14 d將大鼠隨機分為4組，將未做任何處理大鼠作為對照組，每組10只。

1.2 PTSD大鼠模型建立

采用SPS刺激方法建立PTSD大鼠模型，具體步驟：（1）用剪開的塑料礦泉水瓶（500 mL）將大鼠固定、禁錮2 h；（2）將大鼠放入水深40 cm、水溫25 ℃左右的水池中游泳20 min；（3）將大鼠從水池中夾出，放置恢復15 min，然后乙醚麻醉大鼠；（4）大鼠放回籠子中繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 曠場實驗：將對照組和SPS 7 d組大鼠分別放入同樣條件下的四方形曠場箱中，安靜觀察并記錄大鼠在5 min內進入曠場箱中央位置區(qū)域范圍的次數(shù)，穿越中心區(qū)域次數(shù)越少代表焦慮狀態(tài)越嚴重。

1.3.2 僵立行為測定：僵立行為是嚙齒類動物在受到驚嚇后，保持一種僵硬蹲伏狀態(tài)的行為，提示動物存在恐懼記憶。將對照組和SPS 7 d組大鼠先后放入前期大鼠游泳使用的水池內，安靜觀察大鼠5 min，每隔10 s檢測1次，記錄大鼠表現(xiàn)出僵立行為的次數(shù)。僵立行為=僵立行為次數(shù)/觀察總次數(shù)×100%。

1.3.3 Western blotting檢測pRB、E2F1表達：各組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉注射液麻醉，麻醉成功后將大鼠放于冰面上，迅速取出杏仁核腦組織。將取出腦組織勻漿和超聲粉碎處理后，4 ℃，12 000 r/min離心20～30 min，離心后提取上清液；采取考馬斯亮藍方法測定標本蛋白濃度，按照每份標本蛋白含量50 μg標準提取樣本；采用10%SDS-PAGE 凝膠電泳后，采用恒壓下轉PVDF膜處理，將PVDF膜裁剪、封閉和漂洗后，分別滴加兔來源pRB抗體（1∶600）和兔來源E2F1抗體（1∶500），4 ℃封閉條件下過夜；應用TBST液清洗膜3次，每次15 min；分別加入羊抗兔辣根過氧化物酶IgG抗體（1：1 000），室溫條件下孵育2 h，經TBST液清洗膜3次后ECL發(fā)光液顯色。使用 Fluorchem V2.0 系統(tǒng)測定目標條帶吸光度，然后分別計算目標條帶的平均吸光度值和作為參照的GAPDH條帶的平均吸光度值，兩者比值代表蛋白的相對表達量。

1.3.4 實時PCR檢測RBmRNA、E2F1mRNA表達：按照1.3.3方法麻醉大鼠后獲取杏仁核腦組織，Trizol法提取各組細胞總RNA，嚴格按照試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA 。擴增反應體系，SYBR 10 μL，PCR上段引物0.4 μL，PCR下段引物0.4 μL，模板cDNA 2 μL，DEPC水7.2 μL；PCR引物序列見表1。采用LightCycler 480型PCR 儀進行反應和結果測試。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用表示。組間比較采用t檢驗或單因素方差分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2組行為學檢測結果

曠場實驗結果顯示，對照組和SPS 7d組多數(shù)時間在箱壁周圍范圍內活動，其活動軌跡呈現(xiàn)沿壁活動的特性。對照組和SPS 7 d組大鼠進入曠場箱中央位置區(qū)域次數(shù)分別為8.20±1.87、1.50±0.85，2組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。僵立行為測試結果顯示，對照組和SPS 7 d組表現(xiàn)截然不同。SPS 7 d組大鼠典型僵立蹲伏動作增多，其他活動行為頻率降低，時常出現(xiàn)頭、背毛發(fā)豎起等警覺動作；而對照組大鼠活動自如，僵立蹲伏動作較少。對照組和SPS 7d組大鼠僵立行為分別為（11.00±5.24）%、（56.67±8.61）%，2組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 各組pRB和E2F1蛋白表達結果

結果顯示，SPS各組大鼠pRB和E2F1蛋白表達均較對照組增高。與對照組比較，SPS 7 d組和SPS 14 d組pRB和E2F1蛋白表達顯著增高（P＜ 0.05），見圖1。

圖1 各組pRB、E2F1蛋白表達Fig.1 Protein Expression of pRB and E2F1 in each group

2.3 各組RB mRNA、E2F1 mRNA表達結果

結果顯示，SPS各組大鼠RB、E2F1mRNA表達均較對照組增高。與對照組比較，SPS 4 d組、SPS 7 d組、SPS 14 d組RBmRNA表達顯著增高（P＜ 0.05）；SPS 7 d組、SPS 14 d組E2F1mRNA表達顯著增高（P＜ 0.05）。見表2。

表2 各組RB mRNA、E2F1 mRNA表達結果比較Tab.2 Expression of Rb mRNA and E2F1 mRNA in each group

3 討論

已有研究［10］表明PTSD杏仁核組織發(fā)生病理變化，從而證實了PTSD產生的異常增強的恐懼記憶、焦慮等癥狀的根源很可能在杏仁核等邊緣系統(tǒng)。本研究中曠場實驗和僵立行為測試顯示，SPS刺激后大鼠進入曠場箱中央位置區(qū)域范圍的次數(shù)顯著減少，典型僵立蹲伏動作增多，時常出現(xiàn)頭、背毛發(fā)豎起等警覺動作，說明SPS刺激引起大鼠產生恐懼、焦慮的癥狀，證實PTSD模型建模成功。

在RB蛋白與E2F1轉錄因子在細胞周期調控中的關系研究中發(fā)現(xiàn)，RB蛋白被CDK4/CDK6-CyclinD復合物磷酸化，進而將E2F1從RB-E2F1復合物中游離出來發(fā)揮轉錄活性，推進細胞周期進入S期［11］。因此，CDK4、CDK6、Cyclin D蛋白、RB蛋白和E2F1轉錄因子構成了一條完整的調控細胞周期進程的鏈條，形成了CDK/Cyclin D-pRB-E2F 信號傳導通路。已有研究［5，12-13］證實中樞神經損傷時神經細胞內CDK4、Cyclin D1、pRB和E2F1等細胞周期相關因子異常高表達，說明可能激活了CDK4/Cyclin D1-pRB-E2F 信號通路，重啟細胞周期，進而導致細胞凋亡。本研究結果顯示SPS 刺激后pRB和E2F1表達增加，其表達升高趨勢與前期研究［4］CyclinD1、CDK4表達升高趨勢基本相同。因此推測PTSD中CDK4-pRB-E2F1信號轉導通路激活，細胞周期重啟，進而誘導了神經細胞凋亡。目前，關于CDK4-pRB-E2F1通路引起細胞凋亡機制的研究［14-15］發(fā)現(xiàn)，游離的E2F1可能通過阻斷抗凋亡信號、依賴p53凋亡基因和非依賴p53凋亡基因等途徑誘導細胞凋亡。

綜上所述，PTSD大鼠杏仁核神經細胞中pRB及E2F1高表達，CDK4-pRB-E2F1通路可能參與了PTSD杏仁核神經細胞的調亡。但PTSD中E2F1轉錄因子通過何種具體途徑誘發(fā)細胞凋亡，以及如何對細胞周期相關因子進行干預的尚不清楚，今后將進一步研究、論證。