吳玉洪，張世昌，田茜，馬桂珍，郭榮君*，李世東，鐘增明

（1.江蘇海洋大學(xué)，江蘇 連云港 222005；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193；3.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；4.北京啟高植物醫(yī)學(xué)和營(yíng)養(yǎng)研究所有限公司，北京 100193）

氮雜環(huán)化合物是一類(lèi)污染面廣、毒性大的難降解有機(jī)物。多數(shù)氮雜環(huán)化合物有惡臭或刺激性氣味，其中吲哚類(lèi)氮雜環(huán)有機(jī)物是畜牧堆肥中有機(jī)污染物的主要成分，造成養(yǎng)殖場(chǎng)及其周邊環(huán)境惡化，引起一系列環(huán)境污染和公共衛(wèi)生問(wèn)題[1-2]。

3-甲基吲哚（3MI）俗稱(chēng)糞臭素（SK），是一種可溶于有機(jī)溶劑、難溶于水的含氮雜環(huán)化合物。它是吲哚的一種衍生物，具有雙環(huán)結(jié)構(gòu)，是色氨酸的主要代謝物之一[3]，其中豬糞和雞糞中糞臭素含量可高達(dá)40～60 mg·kg-1[4-5]。3-甲基吲哚能夠調(diào)控腸道菌群，抑制產(chǎn)氣桿菌、沙門(mén)氏菌等多種革蘭氏陰性腸道菌的增殖，但對(duì)人和動(dòng)物健康也有不良影響。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，其對(duì)細(xì)胞具有遺傳毒性，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，并能夠引起多種反芻動(dòng)物的急性肺水腫和肺氣腫[6]，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致動(dòng)物死亡；另外，還可引起人神經(jīng)內(nèi)分泌功能和免疫功能的病變，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致呼吸道細(xì)胞發(fā)生畸變和癌變[7-8]。

物理化學(xué)方法是目前去除吲哚類(lèi)氮雜環(huán)化合物臭味的主要方法，但該方法成本較高，且易造成二次污染，利用微生物降解吲哚類(lèi)化合物的研究近年受到廣泛關(guān)注。Yin 等[9]從紅樹(shù)林底泥中分離的銅綠假單胞菌（Pesudomonas aeruginosa）能夠降解4 mmol·L-1的糞臭素；Gu 等[10]從海底沉積物中分離出厭氧菌群，在硫還原條件下可降解糞臭素；Kohda 等[11]從禽畜糞便中分離出一株馬來(lái)提名梭菌（Clostridium malenomina?tum），研究發(fā)現(xiàn)在糞臭素濃度為100～300 mg·L-1時(shí)，豐富的營(yíng)養(yǎng)供給有利于糞臭素的降解。以往研究報(bào)道紅球菌對(duì)烷烴、芳香烴、原油、有機(jī)腈等多種化合物具有轉(zhuǎn)化及降解功能[12]，但有關(guān)紅球菌降解糞臭素等吲哚類(lèi)化合物的研究未見(jiàn)報(bào)道。

本研究從羊糞堆肥下土壤中分離到糞臭素降解菌株Rp3，研究了其對(duì)糞臭素的降解率以及在不同糞臭素濃度、pH 及鹽度下菌株的生長(zhǎng)情況，為該菌株應(yīng)用于堆肥臭味污染環(huán)境的凈化提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

樣品：羊糞堆肥下土壤，采集于山西應(yīng)縣羊養(yǎng)殖場(chǎng)。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基L2：KH2PO40.5 g、K2HPO41.5 g、MgSO40.5 g、（NH4）2SO41.5 g，蒸餾水定容至1 L，pH自然。

LB 液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、NaCl 5 g、酵母提取物5 g，蒸餾水定容至1 L。

富集馴化培養(yǎng)基：在L2 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，梯度（10～100 mg·L-1）增加糞臭素。

趨化培養(yǎng)基：KH2PO40.5 g、K2HPO41.5 g、MgSO40.5 g、（NH4）2SO41.5 g，瓊脂2 g，蒸餾水定容至1 L，pH自然。

分離培養(yǎng)基：在富集馴化培養(yǎng)液中加入糞臭素，使其終濃度為50 mg·L-1，瓊脂20 g。

BUG+B 培養(yǎng)基：BUG 瓊脂培養(yǎng)基57 g，加水至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min后加50 g·L-1脫纖維羊血。

Dunham氏蛋白胨水溶液：蛋白胨1 g、NaCl 0.5 g、蒸餾水100 mL。

Ehrlich氏：對(duì)二氨基苯甲醛1 g、無(wú)水乙醇95 mL、濃鹽酸25 mL。

淀粉培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、NaCl 5 g、牛肉膏5 g、可溶性淀粉10 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集與預(yù)處理

從養(yǎng)殖場(chǎng)不同羊糞堆放處取樣，每堆多點(diǎn)取樣后混合成一個(gè)樣品，每個(gè)樣品500 g。低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，共采集樣品10個(gè)。

1.2.2 糞臭素母液的制備

將糞臭素0.5 g 溶于100 mL 無(wú)水乙醇中，配制成5 g·L-1的糞臭素母液。用0.2 μm 的有機(jī)相濾膜過(guò)濾除菌，放置于4 ℃冰箱，備用。

1.2.3 微生物菌株的富集馴化培養(yǎng)

將糞臭素母液加到250 mL 三角瓶中，待乙醇揮發(fā)后加入60 mL 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液L2，振蕩混勻，使糞臭素的終濃度為10 mg·L-1。將0.1 g 樣品加入培養(yǎng)液中，以不加樣品的培養(yǎng)液為對(duì)照，每處理3 個(gè)重復(fù)，28 ℃、180 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)7 d，作為第1 個(gè)周期富集培養(yǎng)液。取第1 個(gè)周期富集馴化后的菌液10 mL，加入到60 mL 新配制的加有更高濃度糞臭素的富集培養(yǎng)液中，28 ℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)7 d，以相同方法連續(xù)馴化5 個(gè)周期。在第5 個(gè)周期，馴化培養(yǎng)液中糞臭素含量達(dá)100 mg·L-1。

1.2.4 糞臭素降解菌的分離

取最后一次富集馴化的菌液，稀釋涂布于含糞臭素50 mg·L-1的分離培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d。挑取單菌落進(jìn)行純化，-20 ℃保存。

1.2.5 降解糞臭素優(yōu)勢(shì)菌株的篩選

將純化后的菌株劃線接種于L2 培養(yǎng)基，在菌體表面撒上5 mg的糞臭素，28 ℃恒溫培養(yǎng)，感官法判斷臭味降解程度，選取臭味降解程度較高的菌株，將該菌株保存于30%的無(wú)菌甘油中，備用。

1.2.6 糞臭素降解菌對(duì)糞臭素的趨化性

采用點(diǎn)滴平板趨化方法測(cè)試降解菌株對(duì)糞臭素的趨化反應(yīng)。吸取1 mL Rp3 菌株的菌懸液（OD600=0.8，109CFU·mL-1）加入到溫度為40 ℃的趨化培養(yǎng)基中，混和均勻，倒平板。凝固后，在平板中央放置少量糞臭素，28 ℃靜置培養(yǎng)2 d，觀察趨化反應(yīng)圈，并拍照。

1.2.7 菌株Rp3對(duì)糞臭素降解的效果

（1）糞臭素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱(chēng)取糞臭素標(biāo)準(zhǔn)樣品10 mg，置于10 mL 容量瓶中，用乙醇配制成1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。依次稀釋?zhuān)玫?、1、5、10、15、20、25 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.2 μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾，HPLC 法測(cè)定其峰面積，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定三次。以進(jìn)樣濃度和所得峰面積建立線性回歸方程。

色譜條件：色譜柱為Hypersill BDS C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為室溫；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流動(dòng)相為甲醇∶水（體積比為90∶10）；流速1 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL。

（2）糞臭素在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中的添加回收率

在20 mL L2 培養(yǎng)液中添加糞臭素標(biāo)準(zhǔn)液，使其添加濃度分別為10、20、50、100 mg·L-1，每個(gè)添加濃度3 次重復(fù)。加入適量甲醇，150 Hz 超聲振蕩提取10 min，過(guò)0.22 μm濾膜，HPLC檢測(cè)。檢測(cè)條件同上。

（3）菌株Rp3對(duì)糞臭素的降解率

在滅菌的50 mL 三角瓶中加入糞臭素的乙醇溶液，揮發(fā)盡溶劑，分別加入滅菌的20 mL 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液L2，150 Hz 超聲振蕩10 min，使三角瓶中糞臭素含量分別為50 mg·L-1和100 mg·L-1。按5%（OD600=0.8）的接種量加入Rp3 菌株的菌懸液，28 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)，于0、12、24、36、48 h 取樣測(cè)定。同時(shí)設(shè)不接種細(xì)菌但含相同濃度糞臭素的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液為對(duì)照；另設(shè)一個(gè)培養(yǎng)液中接種菌株Rp3 菌懸液的處理，檢測(cè)菌懸液細(xì)胞提取物對(duì)糞臭素的降解效果，每個(gè)處理3重復(fù)，于0、12、24、36、48 h提取糞臭素。

糞臭素提取：將上述培養(yǎng)液加入等體積甲醇，5 000 r·min-1離心10 min，吸取1 mL 溶液，0.22 μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾，4 ℃保存，待測(cè)。如提取液濃度太高，需進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行HPLC檢測(cè)。檢測(cè)條件同上。

1.2.8 Rp3菌株生物學(xué)特性研究

（1）糞臭素濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

將菌株接種于糞臭素含量為50、100、150、200、250、300 mg·L-1的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中，28 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h，測(cè)定OD600值。

（2）pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

將菌株接種于初始pH 值分別為4、5、6、7、8、9 的LB 培養(yǎng)液中，28 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h，測(cè)定OD600值。

（3）NaCl含量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

將菌株接種于NaCl 含量分別為0、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%的LB 培養(yǎng)液中，28 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h，測(cè)定OD600值。

1.2.9 菌株Rp3的鑒定

（1）菌落形態(tài)觀察

將活化好的Rp3 菌株稀釋涂布于無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基L2，28 ℃恒溫培養(yǎng)，定期觀察菌落形態(tài)。

（2）菌體特征觀察

挑取少量培養(yǎng)24 h 的菌株Rp3 的菌體于載玻片上無(wú)菌水中涂抹均勻，自然干燥，2%結(jié)晶紫染色，在100倍油鏡下觀察[13]。

（3）生理生化特征

部分生理生化指標(biāo)的測(cè)定及方法參考文獻(xiàn)[14]。

①革蘭氏鑒定：取一滴新鮮配制的3%KOH 滴到干凈的載玻片上，然后用無(wú)菌牙簽挑取少許培養(yǎng)20～24 h 的菌株Rp3，與KOH 溶液混和，30 s 內(nèi)向上拉，觀察是否能拉出黏絲。能拉出黏絲為陰性菌，相反則為陽(yáng)性菌。以已知的G-菌為對(duì)照菌株。

②過(guò)氧化氫酶鑒定：將培養(yǎng)24 h 的菌株Rp3，用接種環(huán)挑取一環(huán)于已滴有3%過(guò)氧化氫的載玻片上，如有氣泡產(chǎn)生則為陽(yáng)性，無(wú)氣泡為陰性。

③吲哚試驗(yàn)：將菌株Rp3 接種于Dunham 氏蛋白胨水溶液中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h（可延長(zhǎng)4～5 d），于培養(yǎng)液中加入二甲苯2 mL，搖勻，靜置，沿管壁加入Eh?rlich氏2 mL。顯紅色說(shuō)明產(chǎn)吲哚。

④淀粉水解試驗(yàn)：將菌株Rp3 點(diǎn)接在平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，滴加少量碘液，菌落周?chē)霈F(xiàn)無(wú)色水解圈說(shuō)明能夠產(chǎn)生水解酶。

（4）16S rRNA基因序列擴(kuò)增與分析

用細(xì)菌基因組提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取Rp3菌株的總DNA，用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[15]。上游引物為27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；下游引物為1492R：5′-ACGGTTACCTTACCTTGTTACGACTT-3′。

反應(yīng)體系（50 μL）：DNA 模版5 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，T3 1×SuperMix 41 μL。

PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)32 次，最后72 ℃延伸10 min。4 ℃保存樣品。

采用3%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，PCR 產(chǎn)物送擎科生物公司進(jìn)行測(cè)序。所得16S rRNA 基因序列拼接完整后與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)，采用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建Rp3菌株的16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

（5）Biolog鑒定[16]

將Rp3 菌株接種至BUG+B 培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)16 h。培養(yǎng)好的菌株轉(zhuǎn)接于IF-A 接種液中，得菌懸液；調(diào)節(jié)菌懸液濁度為90%～98%之間。

將上述菌懸液用12 道移液器按順序加入微孔板中，28 ℃恒溫培養(yǎng)46 h 后，放入Gen ⅢMicrostation biolog 自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)中進(jìn)行分析。該部分實(shí)驗(yàn)在中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 糞臭素降解菌株的篩選

從羊糞堆肥下土壤中共分離出3 株菌，分別編號(hào)為1#、2#、3#，利用感官法及趨化反應(yīng)篩選降解效果最好的菌株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L2 培養(yǎng)基上的1#、2#菌株出現(xiàn)酸臭味，而3#菌株未產(chǎn)生酸臭味；在含有糞臭素的L2 培養(yǎng)基上接種3#菌株后臭味消失，說(shuō)明3#菌自身不產(chǎn)生酸臭味并可以降解糞臭素。三株菌株中只有3#菌株在糞臭素周?chē)纬哨吇Γ▓D1），說(shuō)明3#菌株對(duì)糞臭素降解能力最高，將其命名為菌株Rp3。

圖1 菌株對(duì)糞臭素的趨化響應(yīng)Figure 1 Chemotactic response of strains to skatole

2.2 降解率測(cè)定

2.2.1 糞臭素色譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍

糞臭素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為4.2 min左右（圖2）。配制濃度依次為0、1、5、10、15、20、25 mg·L-1的糞臭素標(biāo)準(zhǔn)溶液，線性方程為y=10 743x-6 327.7，R2為0.996 5，線性良好。

圖2 糞臭素標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖Figure 2 HPLC chromatography of standard skatole

2.2.2 糞臭素的添加回收精確度及回收率

糞臭素的添加回收率測(cè)定結(jié)果（表1）表明，不同濃度的糞臭素添加到L2 培養(yǎng)液后的回收率為84.6%～93.7%，在60%～110%范圍內(nèi)，符合要求。糞臭素的提取方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.09%～4.80%，小于5%，說(shuō)明提取方法的精確度良好。

表1 糞臭素的添加回收精確度和回收率Table 1 Accuracy and recovery rate of skatole

2.2.3 Rp3菌株對(duì)糞臭素的降解率

Rp3 菌株對(duì)糞臭素的降解率以及Rp3 菌株的生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖3。從Rp3 菌株生長(zhǎng)曲線可知：Rp3 菌株在兩種濃度糞臭素處理中的生長(zhǎng)趨勢(shì)基本相同，在0～36 h，處于指數(shù)生長(zhǎng)期，36～48 h時(shí)，生長(zhǎng)速率漸緩，進(jìn)入穩(wěn)定期；但Rp3菌株在添加100 mg·L-1糞臭素的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中生長(zhǎng)量低于其在糞臭素濃度為50 mg·L-1處理中的生長(zhǎng)量。從糞臭素的降解曲線可知：在兩種濃度下，Rp3菌株對(duì)糞臭素的降解趨勢(shì)相似，均在12～24 h時(shí)對(duì)糞臭素的降解逐漸增強(qiáng)，但100 mg·L-1濃度處理的降解速率有所減慢。當(dāng)糞臭素初始濃度為50 mg·L-1，接種Rp3菌株后24 h，糞臭素的降解率達(dá)100%；當(dāng)糞臭素初始濃度提高至100 mg·L-1時(shí)，接種Rp3菌株后36 h和48 h，糞臭素的降解率分別為95.5%和98.4%。

圖3 Rp3菌株的生長(zhǎng)量及其對(duì)糞臭素的降解能力Figure 3 The growth of strain Rp3 and its skatole-degrading ability

2.3 Rp3菌株生長(zhǎng)特性

2.3.1 不同糞臭素濃度對(duì)Rp3菌株生長(zhǎng)的影響

Rp3 菌株在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)情況因糞臭素的濃度不同而異（圖4）。當(dāng)糞臭素濃度為50 mg·L-1和100 mg·L-1時(shí)，菌株生長(zhǎng)較好，兩處理間差異不顯著；糞臭素濃度增加至150 mg·L-1以上時(shí)，Rp3菌株生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，且與100 mg·L-1以下濃度的菌株生長(zhǎng)存在顯著差異（P<0.05）。

圖4 不同糞臭素濃度下Rp3菌株生長(zhǎng)情況Figure 4 Growth of strain Rp3 with different concentrations of skatole

2.3.2 pH值對(duì)Rp3菌株生長(zhǎng)的影響

培養(yǎng)液的初始pH 值對(duì)Rp3菌株生長(zhǎng)有一定影響（圖5）。pH<6 和pH>8 時(shí)，Rp3 菌株生長(zhǎng)受到明顯抑制（P<0.05）；pH 7～8適宜Rp3菌株的生長(zhǎng)。

圖5 初始pH對(duì)Rp3菌株生長(zhǎng)的影響Figure 5 Growth of strain Rp3 in LB broth with different initial pH

2.3.3 鹽度對(duì)Rp3菌株生長(zhǎng)的影響

如圖6 所示，在培養(yǎng)基中NaCl 濃度為0～10%時(shí)，Rp3 菌株能夠正常生長(zhǎng)，說(shuō)明Rp3 菌株具有較強(qiáng)的耐鹽性；但是當(dāng)NaCl濃度增加至12%和14%時(shí)，Rp3 菌株生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，與NaCl 濃度為0～10%時(shí)差異顯著（P<0.05）。

圖6 不同鹽度下Rp3菌株生長(zhǎng)情況Figure 6 Growth of strain Rp3 at different salinity

2.4 菌株鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)特征

菌株Rp3 在L2 培養(yǎng)基上培養(yǎng)至7 d 時(shí)，菌落呈圓形，粉紅色，不透明，表面光滑（圖7A-a1、a2）；培養(yǎng)至27 d時(shí)，菌落變大，菌落呈圓形，菌落邊緣至中心顏色由淡粉色至粉紅色，不透明，表面光滑，邊緣不規(guī)則，呈花瓣?duì)睿▓D7A-a3、a4）。培養(yǎng)24 h 時(shí)，菌體呈球狀、桿狀兩種不同形態(tài)（圖7B）。

圖7 菌株Rp3的菌落形態(tài)和菌體形態(tài)特征Figure 7 Colony and cell morphological characteristics of strain Rp3

2.4.2 生理生化特征

對(duì)菌株Rp3部分生理生化特征的測(cè)定結(jié)果表明：Rp3 菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，能夠產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶，不能產(chǎn)吲哚及解淀粉酶。

2.4.3 16S rRNA基因序列擴(kuò)增與分析

以Rp3 菌株基因組DNA 為模板，使用16S rRNA基因通用引物（27F 和1492R）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得一條1 500 bp 左右的DNA 條帶，將序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，登錄號(hào)為MT664723。與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中紅球菌屬多個(gè)模式菌株Rhodococcus pyridinivorans（GCA_900105195.1）、R.ruber（GCA_002741725.1）和R.opacus（GCA_003626495.1）以及大腸桿菌Escherichia coli（GCA_000008865.2）比對(duì)，Rp3 菌株與多株Rhodococ?cus屬的序列相似度超過(guò)98%。構(gòu)建菌株Rp3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖8），結(jié)果顯示，菌株Rp3屬于Rhodococcussp.。

圖8 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建Rp3菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 8 Phylogenetic tree of strain Rp3 based on the 16S rRNA gene sequence analyses

2.4.4 Biolog系統(tǒng)鑒定結(jié)果

Rp3菌株對(duì)Biolog微孔板碳源與化學(xué)敏感物質(zhì)利用情況如表2、表3所示：其可利用碳源為D-果糖、D-山梨醇等16種碳源，對(duì)亞碲酸鉀等9種化學(xué)物質(zhì)敏感。

表2 Biolog GenⅢ微孔板碳源利用情況Table 2 Utilization of carbon source in Biolog Gen Ⅲmicroplate by strain Rp3

表3 Rp3菌株對(duì)化學(xué)物質(zhì)的抗性Table 3 Strain Rp3 resistance to chemicals in Biolog Gen Ⅲmicroplate

經(jīng)Biolog Gen Ⅲ微孔板培養(yǎng)以及Biolog細(xì)菌鑒定系統(tǒng)分析，用可能性（PROB）、相似性（SIM）和距離（DIS）三個(gè)參數(shù)來(lái)判斷結(jié)果。PROB=0.719、SIM=0.719、DIS=4.000<5，與數(shù)據(jù)庫(kù)相應(yīng)的數(shù)據(jù)匹配良好，在ID 地址欄顯示最佳的匹配名稱(chēng)為Rhodococcus pyri?dinivorans。

根據(jù)16S rRNA 基因序列分析和Biolog 系統(tǒng)鑒定結(jié)果，將Rp3菌株鑒定為Rhodococcus pyridinivorans。

3 討論

糞臭素是一種環(huán)境污染物，前人已經(jīng)開(kāi)展了糞臭素降解菌的研究，并獲得了一些具有降解能力的菌株。Gu 等[10]發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷菌群在硫還原條件下能夠降解100 μmol·L-1的糞臭素；惡臭假單胞菌LPC24 降解2.0 mmol·L-1的糞臭素需要30 d[17]；Meng 等[18]的研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌以2.5%的接種量接種于培養(yǎng)液后，37 ℃培養(yǎng)120 h 對(duì)1 μg·mL-1的糞臭素降解率達(dá)65%。上述菌株只能對(duì)低濃度的糞臭素進(jìn)行降解，有的還需要比較特殊的條件。最新研究表明不動(dòng)桿菌NTA1-2A和NTA1-6A 對(duì)糞臭素的降解能力較高。這兩株菌在糞臭素濃度為196.75 mg·L-1時(shí)，培養(yǎng)6 d 對(duì)糞臭素的降解率分別為85%和91%[19]。本研究從羊糞堆肥下土壤中分離出的紅球菌Rp3 對(duì)50 mg·L-1的糞臭素完全降解的時(shí)間為24 h，對(duì)100 mg·L-1的糞臭素降解率達(dá)到95%以上需要36 h，其降解能力遠(yuǎn)高于目前已經(jīng)報(bào)道的降解菌株，是一株非常有潛力的糞臭素降解菌株。紅球菌是具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的細(xì)菌類(lèi)群，對(duì)多種有機(jī)化合物有轉(zhuǎn)化或降解作用，利用紅球菌生產(chǎn)丙烯酰胺已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化，利用紅球菌生產(chǎn)生物表面活性劑及生物絮凝劑[20]等已有報(bào)道，但紅球菌具有專(zhuān)一性，目前未見(jiàn)紅球菌應(yīng)用于糞臭素或堆肥臭味物質(zhì)降解的報(bào)道。Rp3 菌株是紅球菌中首次發(fā)現(xiàn)能夠降解糞臭素的菌株，該菌株的獲得為堆肥中糞臭素的降解提供了新的資源。

趨化性是細(xì)菌適應(yīng)外界化學(xué)環(huán)境而作出的行為反應(yīng)，是細(xì)菌為尋找碳源或能源而進(jìn)化出的一種選擇優(yōu)勢(shì)[21]。該方法曾經(jīng)廣泛用于環(huán)境污染物降解菌株的篩選[22-25]。在糞臭素降解菌株篩選中，本研究采用了感官法和趨化性測(cè)定相結(jié)合的方法對(duì)降解菌株進(jìn)行初篩，大大縮短了降解菌株的初篩時(shí)間，提高了效率。該方法也可以應(yīng)用于其他具有類(lèi)似特性的功能菌株的研究中。Rp3菌株對(duì)糞臭素具有趨化響應(yīng)，說(shuō)明趨化性可能是該菌株降解性的重要特性之一，可應(yīng)用于后續(xù)研究中，通過(guò)趨化性判斷菌株降解能力。

紅球菌Rp3不僅具有高效降解糞臭素的能力，而且具有較高的耐鹽能力和較寬的pH 值適應(yīng)范圍，這可能與其菌株的來(lái)源有關(guān)。新鮮羊糞的鹽分和pH均較高，生存在該環(huán)境中的細(xì)菌因?qū)Νh(huán)境的適應(yīng)而具有較強(qiáng)的耐鹽能力，有利于將其應(yīng)用于堆肥環(huán)境。有關(guān)其對(duì)糞臭素的降解機(jī)理，以及在堆肥環(huán)境中的應(yīng)用效果還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

（1）從羊糞堆肥下土壤中分離獲得能有效降解堆肥臭味物質(zhì)糞臭素的菌株Rp3。該菌株與濃度為50 mg·L-1的糞臭素共培養(yǎng)24 h 的降解率達(dá)100%；與100 mg·L-1的糞臭素共培養(yǎng)48 h的降解率達(dá)98.4%。

（2）糞臭素高效降解菌Rp3 為Rhodococcus pyri?dinivorans，具有很強(qiáng)的耐鹽性，是一株很有潛力的堆肥臭味物質(zhì)降解菌。