王維曼 馬凡提 張 軍 李慕梓 李博玲 向 麗 李翔宇

(嘉必優(yōu)生物技術(shù)(武漢)股份有限公司1，武漢 430073)(湖北省營養(yǎng)化學(xué)品生物合成工程技術(shù)研究中心2，武漢 430223)

微生物油脂，是指由霉菌、酵母菌、細(xì)菌和藻類等產(chǎn)油微生物在一定的培養(yǎng)條件下，利用碳源、氮源等在菌體內(nèi)大量合成并積累的三酰甘油、游離脂肪酸類以及其他脂質(zhì)[1]。經(jīng)過篩選和培育的微生物能產(chǎn)出富含α-亞麻酸(ALA)、γ-亞麻酸 (GLA)、花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)，和二十二碳六烯酸(DHA)等的功能性油脂。這些功能性油脂，大多是人體必需而又無法自身合成的。ALA、DHA、EPA等ω-3脂肪酸作為人體重要的生命活性物質(zhì)，能有效促進(jìn)人體生長發(fā)育，具有預(yù)防糖尿病、心腦血管疾病，抗癌、抗炎、降血脂，增強(qiáng)機(jī)體免疫力等重要的生理功能[2]。隨著人們生活水平的提高，消費(fèi)者飲食中的ω-3脂肪酸與ω-6脂肪酸比例出現(xiàn)了極大的不均衡。研究發(fā)現(xiàn)，長期缺乏ω-3脂肪酸易導(dǎo)致遺傳性肥胖、機(jī)體代謝紊亂，進(jìn)而影響人體健康[3]。ALA可從部分植物油中獲得，DHA和EPA主要來源于魚油和微生物油脂。但魚油成本高、易受污染、品質(zhì)不穩(wěn)定、產(chǎn)量難以滿足全球需求。隨著全球人口增長、健康意識的提高，功能性油脂缺乏的矛盾更加突出，微生物油脂的優(yōu)勢將日益凸顯。

據(jù)Coherent Market Insights預(yù)計(jì)，2018年全球ARA和藻油DHA市場容量為4.47億美元，2026年將增長至12.26億美元。微生物油脂的生產(chǎn)包括菌種篩選、滅菌發(fā)酵、菌體預(yù)處理、油脂提取、油脂精煉等環(huán)節(jié)。在工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模上，一般采用傳統(tǒng)的溶劑浸出法提取微生物油脂。本文綜述了微生物菌體預(yù)處理和油脂提取方法，為微生物油脂深入研究及開發(fā)利用提供一定的參考。

1 微生物菌體預(yù)處理

微生物油脂屬于胞內(nèi)產(chǎn)物，需借助外力破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜、使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物釋放出來，再進(jìn)行油脂提取[2]。不同種類微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)不同，細(xì)胞壁組成、厚度各有差異，需要根據(jù)微生物特性選擇合適的預(yù)處理方式。預(yù)處理方法有物理法、化學(xué)法、酶解法等，可單獨(dú)使用或聯(lián)合使用。

1.1 物理法

1.1.1 傳統(tǒng)物理法

傳統(tǒng)物理法有研磨法、擠壓膨化法、反復(fù)凍融法、滲壓震擾法等。這類方法使用剪切、擠壓等機(jī)械外力作用于菌體或利用細(xì)胞膜的滲透性使細(xì)胞破裂，處理效果取決于細(xì)胞大小和形狀、細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)及機(jī)械強(qiáng)度。傳統(tǒng)物理法發(fā)展成熟，近年來使用傳統(tǒng)物理法對微生物菌體進(jìn)行預(yù)處理的研究較多，總結(jié)如下表1。傳統(tǒng)物理法處理對象多為酵母、藻類等微生物，不同方法的處理時(shí)間、溫度、菌體濃度等均影響細(xì)胞破壁效果，進(jìn)而影響油脂提取率。擠壓膨化法在植物油脂提取中應(yīng)用較成熟，在微生物油脂中研究應(yīng)用較少，擠壓膨化過程會升溫而影響油脂品質(zhì)。研磨法、反復(fù)凍融法、滲壓震擾法，所需設(shè)備簡單、成本低、操作簡便，但破壁效率較低[4]。綜合考慮經(jīng)濟(jì)性、簡潔性，此類方法適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體。

表1 微生物菌體傳統(tǒng)物理法預(yù)處理提取工藝

1.1.2 現(xiàn)代物理法

隨著物理技術(shù)的發(fā)展和設(shè)備的開發(fā)，超聲、微波、脈沖電場、高壓均質(zhì)等技術(shù)與設(shè)備逐漸應(yīng)用于預(yù)處理中，總結(jié)如下表2。此類方法可用于霉菌、酵母菌、藻類等的預(yù)處理，作用于細(xì)胞的超聲波、微波、脈沖、壓力等的強(qiáng)度，處理時(shí)間，菌體濃度，循環(huán)次數(shù)是影響細(xì)胞破裂程度的重要因素。超聲法方法簡單、重復(fù)性較好，在工業(yè)化應(yīng)用中需注意因超聲產(chǎn)生熱量而影響油脂品質(zhì)、還需解決生產(chǎn)過程中噪聲問題。微波具有高穿透性、高選擇性等特點(diǎn)，微波法操作簡便、處理時(shí)間短、效率高，實(shí)際應(yīng)用過程中需關(guān)注微波場的不均勻性問題[12，13]。脈沖電場法可連續(xù)處理、預(yù)處理時(shí)間較短，無加熱、能耗低、對油脂品質(zhì)影響小，破壁效率較高[14]。高壓均質(zhì)技術(shù)安全、簡單、大規(guī)模破碎時(shí)效果較好；對于細(xì)胞壁較厚、難以破碎的、濃度高的或正處于生長期的細(xì)胞，通常需多次循環(huán)均質(zhì)[2]；均質(zhì)時(shí)菌體濃度不能過高、產(chǎn)生大量廢水，處理如絲狀真菌時(shí)易堵塞設(shè)備，應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)儀器費(fèi)用較高?，F(xiàn)代物理法為微生物細(xì)胞破壁提供了新思路，需針對不同微生物細(xì)胞特性優(yōu)選合適方法。

表2 微生物菌體現(xiàn)代物理法預(yù)處理提取工藝

1.2 化學(xué)法

化學(xué)法通過酸、堿、表面活性劑等的作用，改變細(xì)胞壁或膜的通透性，使細(xì)胞內(nèi)含物滲漏出來[23]。常用化學(xué)法有酸熱預(yù)處理法、表面活性劑法、亞臨界水解法等。酸熱法利用強(qiáng)酸對細(xì)胞壁中糖及蛋白質(zhì)等成分的作用，使原來結(jié)構(gòu)緊密的細(xì)胞壁變得疏松，再經(jīng)沸水浴及速凍處理，使細(xì)胞壁進(jìn)一步被破壞[4]。表面活性劑可促使細(xì)胞某些組分溶解，有助于細(xì)胞的破碎[24]。水的離子生成物在亞臨界范圍內(nèi)相對較高，可以有效加速酸或堿催化的反應(yīng)；相當(dāng)數(shù)量的生物量(蛋白質(zhì)和多糖)水解成水溶性化合物、從而使細(xì)胞壁水解；此外磷脂被水解成游離脂肪酸，乳化性能降低，改善脂質(zhì)提取過程中的傳質(zhì)[25]。

Wang等[26]以甲酸為基礎(chǔ)輔以少量鹽酸處理含水微藻，提取油脂。在甲酸用量5.57 g/g(按微藻干重計(jì)，下同)、鹽酸用量0.1 g/g、液固比10∶1、溫度100 ℃的最佳條件下，油脂總收率和脂肪酸甲酯收率分別達(dá)到45.6%和85.8%。已有報(bào)道利用十四烷基三甲基溴化銨、3-(癸二甲基胺)-丙磺酸鹽內(nèi)酯、N-十二烷基肌氨酸、十二烷基硫酸鈉等表面活性劑用于微生物細(xì)胞破壁[24]。Yellapu等[27]將N-十二烷基肌氨酸用于濕酵母細(xì)胞破壁提油，能縮短油脂提取時(shí)間，且對脂肪酸組成無影響。Moumita等[28]將亞臨界水萃取技術(shù)應(yīng)用于微藻中，從藻類生物質(zhì)中同時(shí)生產(chǎn)高附加值的多糖和微生物油脂?；瘜W(xué)破壁法所需條件簡單，作用直接，適用于大部分微生物細(xì)胞破壁，將是一種有前途的工業(yè)規(guī)模微生物脂質(zhì)回收方法。但需評估化學(xué)試劑對設(shè)備、環(huán)境、油脂品質(zhì)等的影響。

1.3 酶解法

酶解法利用酶作用于特定底物，破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，降解油脂與蛋白質(zhì)等的結(jié)合，使油脂釋放[29]。常用的外源性酶主要有溶菌酶、纖維素酶、蛋白酶、酯酶、糖苷酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶等；內(nèi)源性酶解通過控制溫度、pH、時(shí)間、緩沖液濃度及添加激活劑等使細(xì)胞發(fā)生自溶[30-32]。

You等[30]采用酶法輔助提取高山被孢霉中油脂，果膠酶與木瓜蛋白酶(5∶3)、果膠酶與堿性蛋白酶(5∶1)混合酶解時(shí)油脂收率較好，酶解時(shí)間是影響酶解效果的重要參數(shù)。Zhang等[31]以纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶輔助提取柵藻中脂質(zhì)。在最佳條件下，油脂提取率較對照組增加了2倍。掃描電鏡、紅外光譜、X射線光電子能譜和高效液相色譜分析結(jié)果均表明，酶預(yù)處理使微藻細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變。酶解法適用于多種微生物細(xì)胞的破碎預(yù)處理、專一性高，針對不同的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成，需選擇不同的酶及添加次序。商業(yè)化酶價(jià)格高、存在產(chǎn)物抑制作用。但是酶解法反應(yīng)條件溫和、細(xì)胞壁損壞程度可控、能耗低、能有效保持油脂品質(zhì)。酶解法在大規(guī)模生產(chǎn)中極具潛力。

2 微生物油脂提取

微生物細(xì)胞經(jīng)預(yù)處理破壁后，需要采用合適的方法對油脂進(jìn)行提取。主要方法有溶劑萃取法、臨界流體萃取法、吸油材料吸附法等。

2.1 溶劑萃取法

溶劑萃取法利用油脂與待分離混合物在各溶劑中溶解性不同，將油脂提取出來[33]。正己烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，已被廣泛用于微生物油脂的提取。除了使用單一溶劑外，一些雙相共沸混合溶劑已被證明能有效進(jìn)行脂質(zhì)提取[34]。主要有乙醇-正己烷、氯仿-甲醇、氯仿-甲醇-正丁醇-水-EDTA、乙醇-乙醚等[35，36]。混合溶劑中的醇類破壞了靜電力、膜脂與相關(guān)蛋白之間的氫鍵，然后非極性組分進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)行中性脂質(zhì)提取[34]。

工業(yè)生產(chǎn)中常使用正己烷作為萃取溶劑，溶劑萃取前通常需經(jīng)過干燥處理。Zhu等[35]從高山被孢霉?jié)窬w和干菌體中分別提取油脂。以氯仿/甲醇/水(2/2/1.8)為溶劑，直接從濕菌體中提取油脂，脂類收率為27.6%；以氯仿/甲醇(2/1)為溶劑，從干物質(zhì)中提取油脂，脂類收率為41.1%。實(shí)驗(yàn)室常用乙醚等溶劑通過索氏抽提裝置反復(fù)萃取菌體中油脂，此方法適合小批量油脂提取及含量檢測。此法將菌體中脂肪、磷脂、固醇等同時(shí)提出，使測得油脂含量偏高[37]。溶劑萃取法需要使用大量溶劑，對環(huán)境有一定影響，溶劑回收時(shí)消耗大量能量，提取的毛油中含有雜質(zhì)需進(jìn)一步精煉處理；但其處理量大，油脂提取率高，生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)工藝及設(shè)備成熟，是工業(yè)化生產(chǎn)中最常用的油脂提取方法。

2.2 臨界流體萃取法

臨界流體萃取法以臨界流體為萃取劑，利用壓力、溫度對臨界流體溶解能力的影響，通過控制條件使待分離組分萃取出來，再通過減壓蒸發(fā)過程將油脂與臨界流體分離，使被萃取物質(zhì)析出，達(dá)到分離提取效果[38]。根據(jù)臨界狀態(tài)可分為亞臨界流體萃取和超臨界流體萃取。常用的亞臨界流體有丙烷、丁烷、二甲醚、液化石油氣等，這類物質(zhì)以亞臨界狀態(tài)存在時(shí)，分子的擴(kuò)散性能增加，傳質(zhì)速度加快，其滲透能力和溶解能力顯著增強(qiáng)[2]。常用的超臨界流體萃取使用CO2為萃取劑，在萃取強(qiáng)極性化合物時(shí)，可使用如甲醇、乙醇、己烷等夾帶劑輔助超臨界萃取[39]。

二甲醚亞臨界萃取較傳統(tǒng)溶劑提取具有優(yōu)越性，其不破壞細(xì)胞、對環(huán)境友好，可直接用于濕菌體中脂質(zhì)提取[40]。Catchpole等[41]以二甲醚(DME)為萃取溶劑，對發(fā)酵生產(chǎn)的濕生物質(zhì)和干生物質(zhì)油脂進(jìn)行了萃取，使用DME從濕菌體中直接提取脂質(zhì)，不需要進(jìn)行烘干。Sallet等[42]利用超臨界CO2(SFE-CO2)和液化石油氣(LPG)萃取深黃被孢霉中油脂。從動力學(xué)曲線、傳質(zhì)速率和萃取物得率來看，80 ℃/250 bar (SFE-CO2)和40 ℃/20 bar (LPG)是最適宜的條件，其中液化石油氣萃取時(shí)收率最高，為4.45 wt.%；根據(jù)脂肪酸組成來看，SFE-CO2的性能略高于壓縮液化石油氣。李麗娜[43]通過超臨界CO2萃取深黃被孢霉中花生四烯酸。得到最佳萃取條件為：萃取溫度32 ℃、萃取壓力16 MPa、萃取時(shí)間100 min和10%甲醇做夾帶劑，花生四烯酸提取率為45.7%，花生四烯酸含量為19.34%。Patil等[44]采用微波預(yù)處理、超臨界CO2從微擬球藻中萃取油脂。在優(yōu)化條件下：混合溶劑(正己烷∶乙醇，1∶1)與藻類比率12∶1、萃取壓力360 bar、萃取溫度80 ℃、超臨界CO2萃取60 min，油脂產(chǎn)量為31.37%(以干基計(jì))，EPA含量在20%～32%之間。

臨界流體萃取技術(shù)作為新一代化工分離技術(shù)，可在常溫下操作，油脂中的活性成分不易損失，所提取的油脂中雜質(zhì)少、純度高、品質(zhì)好[42]。其中超臨界流體萃取不使用有機(jī)溶劑、無溶劑殘留、安全性較高，該法較適合于生理活性物質(zhì)的提取、分離[45]。亞臨界流體來源廣泛、溶劑消耗量小，設(shè)備投資成本及生產(chǎn)運(yùn)行成本較超臨界流體萃取低[2]，更易于工業(yè)化應(yīng)用，在微生物油脂提取中極具發(fā)展前途。

2.3 吸附法

吸附法通過具有超疏水性或超疏油性的材料，選擇性吸附油相或水相，達(dá)到油水分離的效果。鄭依凡[23]采用聚丙烯-乙烯共聚無紡布作為吸附油脂材料，以物理方法直接對濃縮、高壓勻漿破碎后的粘紅酵母進(jìn)行油脂提取。吸油材料在聚丙烯原料中加入聚乙烯，提高無紡布的機(jī)械強(qiáng)度。無紡布吸油的最佳工藝條件為：150 r/min攪拌、單次吸附時(shí)間1 h、溫度60 ℃、材料用量0.5 cm2/mL發(fā)酵液、采用二級吸附，油脂總收率達(dá)到69.6%。趙一帆等[46]制備超疏水聚丙烯纖維/SiO2氣凝膠復(fù)合材料，吸油實(shí)驗(yàn)表明常溫下該復(fù)合材料對食用油、汽油、煤油的最大吸附效率分別為6.96、7.54、7.16 g/g。此方法能選擇性吸附油脂、吸附性能良好，操作便捷、常溫即可操作。但現(xiàn)階段油脂收率較溶劑法低、吸附材料制作成本較高，且存在塑化劑污染隱患，暫未應(yīng)用于微生物油脂工業(yè)生產(chǎn)中。

3 展望

微生物油脂具有產(chǎn)率高、安全性好、生產(chǎn)易控制、營養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)勢，深受企業(yè)和消費(fèi)者青睞。隨著市場對食品安全及品質(zhì)穩(wěn)定要求越來越高。未來微生物油脂的發(fā)展方向可能有：利用現(xiàn)代生物技術(shù)繼續(xù)探索選育優(yōu)質(zhì)菌種；探索資源節(jié)約、環(huán)境友好型發(fā)酵工藝，提高油脂產(chǎn)量；結(jié)合不同微生物自身特點(diǎn)持續(xù)改進(jìn)和提高生產(chǎn)工藝，降低成本，向著綠色可持續(xù)方向發(fā)展；作為功能性原料開發(fā)及擴(kuò)大其在食品、保健品、醫(yī)藥等產(chǎn)品中的應(yīng)用；應(yīng)用于能源領(lǐng)域緩解能源短缺等。