楊 柳,戚小艷，施依彤，馬紹剛

1.江蘇省宿遷市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇宿遷 223800；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣西南寧 530023

常見(jiàn)的亞臨床甲狀腺功能減退癥(簡(jiǎn)稱(chēng)甲減)患者血清促甲狀腺激素(TSH)水平升高，并伴有甲狀腺特異性抗體升高。而特發(fā)性亞臨床甲減是指甲狀腺特異性抗體[抗甲狀腺過(guò)氧化物酶(TPO)抗體(TPOAb)、抗甲狀腺球蛋白(Tg)抗體(TGAb)、抗甲狀腺素受體抗體(TRAb)等]均陰性，TSH升高的一類(lèi)亞臨床甲狀腺疾病[1]，往往病因不詳。特發(fā)性亞臨床甲減患者無(wú)明顯臨床表現(xiàn)，多在體檢中發(fā)現(xiàn)，是否給予左旋甲狀腺素治療尚存爭(zhēng)議，具體機(jī)制尚不明，可能與基因突變有關(guān)。長(zhǎng)期高水平TSH刺激可導(dǎo)致甲狀腺腫大、甲狀腺結(jié)節(jié)、高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。妊娠期伴T(mén)SH水平升高，應(yīng)給予治療[4-5]。

甲狀腺激素合成障礙多與基因突變有關(guān)，其中較為常見(jiàn)的是TPO、Tg、雙氧化酶2(DUOX2)、雙氧化酶成熟因子2(DUOXA2)、鈉/碘協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體(NZS)、Pendrin等基因[6]。上述基因的雜合子可表現(xiàn)為特發(fā)性亞臨床甲減，TPO雜合突變相關(guān)的亞臨床甲減較為少見(jiàn)。而甲狀腺發(fā)育相關(guān)基因TSH受體、PAX8、TTF-1、TTF-2雜合突變也可表現(xiàn)為特發(fā)性亞臨床甲減[7]。所以特發(fā)性亞臨床甲減的臨床表型與基因型并不完全一致。本文對(duì)1個(gè)特發(fā)性亞臨床甲減家系進(jìn)行遺傳學(xué)研究。

1 資料與方法

1.1一般資料 先證者，女，25歲，無(wú)明顯臨床癥狀，因體檢發(fā)現(xiàn)“TSH水平升高”就診。通過(guò)詢問(wèn)病史、查體，初步判斷先證者為特發(fā)性亞臨床甲減，考慮與基因突變有關(guān)。先證者甲狀腺功能檢查中TSH水平升高，甲狀腺特異性抗體陰性，彩超檢查顯示甲狀腺未見(jiàn)異常。隨后對(duì)先證者進(jìn)行外顯子組測(cè)序。本研究獲得宿遷市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患者及其家屬的同意。

1.2儀器與試劑 采用瑞士羅氏Cobas E602全自動(dòng)免疫分析儀及其配套試劑檢測(cè)甲狀腺相關(guān)激素(電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法)；使用AxyPrep血液基因組DNA小量試劑盒(上海晶能生物技術(shù)有限公司提供)提取基因組DNA。

1.3方法 DNA提?。悍謩e抽取先證者及其相關(guān)親屬(包括先證者的祖父母、父母、兄弟姐妹)外周血2 mL，乙二胺四乙酸抗凝以備基因檢測(cè)，使用AxyPrep血液基因組DNA小量試劑盒(上海晶能生物技術(shù)有限公司提供)提取基因組DNA。

外顯子測(cè)序：按照上海晶能生物技術(shù)有限公司的操作流程，通過(guò)構(gòu)建DNA文庫(kù)、捕獲外顯子、簇生成等步驟后，采用Illumina Nova600測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與人類(lèi)參考基因組序列19進(jìn)行堿基對(duì)比，鑒別并標(biāo)注突變基因。突變基因經(jīng) Sanger正反測(cè)序證實(shí)后進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

Sanger測(cè)序:對(duì)目標(biāo)突變,用Sanger測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證。TPO基因第13位外顯子及其側(cè)翼引物序列:5′-GCTCAGTGAGTGACCACAGC-3′，常規(guī)PCR擴(kuò)增外顯子片段，純化后Sanger正向測(cè)序分析；TPO基因第13位外顯子及其側(cè)翼引物序列:5′-GCTCAGTGAGTGACCACAGC-3′，常規(guī)PCR擴(kuò)增外顯子片段，純化后Sanger反向測(cè)序分析。

2 結(jié) 果

先證者TPO基因第13外顯子c.2268insT雜合突變。PCR擴(kuò)增TPO基因第13位外顯子并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序，證實(shí)先證者及其家系成員中Ⅰ2、Ⅱ1、Ⅲ3均存在相同TPO基因c.2268insT雜合突變，符合隱性遺傳規(guī)律，其中Ⅱ1、Ⅲ3 TPO基因c.2268insT雜合突變伴有亞臨床甲減，見(jiàn)表1、圖1。

表1 先證者及家系成員的甲狀腺功能檢測(cè)結(jié)果

注：A為該患者的家系遺傳圖(○表示健康女性；●表示患病女性；□表示健康男性；■表示患病男性)；B為突變型；C為野生型；D為健康人TPO基因測(cè)序圖；E為患者克隆基因測(cè)序；↗所指為先證者，↑所指為插入T。

3 討 論

TPO與髓過(guò)氧化物酶、乳過(guò)氧化物酶和嗜酸性粒細(xì)胞過(guò)氧化物共同屬于含血紅素的人過(guò)氧化物酶家族，人的TPO基因位于2號(hào)染色體上，編碼933個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)[8]，主要在甲狀腺濾泡細(xì)胞合成，是合成T4的關(guān)鍵酶，直接催化甲狀腺球蛋白中酪氨酸殘基的碘化和偶聯(lián)，從而合成T3和T4，TPO基因突變是導(dǎo)致T4合成障礙的重要原因，除了已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的純合子和雜合子基因突變外，人群中還存在大量未被發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)，可能導(dǎo)致某些甲狀腺疾病。

本研究對(duì)包括先證者在內(nèi)共12位直系親屬進(jìn)行隨訪調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該家系三代成員中4人測(cè)序結(jié)果顯示TPO基因c.2268insT雜合子突變(比例約33.33%)，該突變?yōu)門(mén)PO基因的高頻突變，在中國(guó)人群中較為常見(jiàn)[9-12]。在既往研究報(bào)道中，TPO基因純合或復(fù)合雜合突變是導(dǎo)致先天性甲減的重要病因[13-15]，單純雜合突變發(fā)生亞臨床甲減較為少見(jiàn)。由此可見(jiàn)亞臨床甲減的臨床表型與基因型并不完全一致。

TPO基因c.2268insT插入性突變使翻譯的氨基酸序列明顯錯(cuò)誤，影響TPO的正常功能。在蛋白質(zhì)翻譯階段TPO基因c.2268insT插入性突變導(dǎo)致密碼子移碼變異(翻譯氨基酸序列的密碼子發(fā)生移位)，提前出現(xiàn)終止密碼子，合成TPO肽鏈變短，成為截短蛋白,無(wú)法發(fā)揮蛋白質(zhì)的正常功能，影響TPO活性。TPO生物活性下降，可引起碘有機(jī)化障礙，導(dǎo)致甲狀腺激素合成降低，垂體負(fù)反饋性調(diào)節(jié)使TSH水平升高。長(zhǎng)期高水平TSH的刺激，增加了甲狀腺結(jié)節(jié)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，長(zhǎng)期可能會(huì)導(dǎo)致甲狀腺癌變[16]，所以對(duì)于TPO基因突變的患者定期隨訪是十分必要的。

TPO基因缺陷通常是常染色體隱性遺傳，因此區(qū)分遺傳突變性甲狀腺疾病和其他甲狀腺疾病對(duì)遺傳咨詢具有重要的臨床意義。在臨床上，常規(guī)有關(guān)甲狀腺方面的檢查，如血清甲狀腺功能檢測(cè)、甲狀腺彩超等并不能起指導(dǎo)性作用。因此，針對(duì)這一類(lèi)的亞臨床甲減，需要基因診斷進(jìn)行確診。本研究存在一定不足，研究樣本量過(guò)少，在特發(fā)性亞臨床甲減及其家系調(diào)查中僅發(fā)現(xiàn)4例攜帶突變基因，應(yīng)擴(kuò)大樣本量以期發(fā)現(xiàn)特發(fā)性亞臨床甲減的其他致病基因，亦應(yīng)進(jìn)行長(zhǎng)期臨床隨訪。

綜上所述，本研究認(rèn)為T(mén)PO基因c.2268insT突變?yōu)樵摷蚁党蓡T的致病原因。