国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

甲型H1N1流感病毒RNA檢測方法的建立及臨床應(yīng)用

2021-07-29 10:55曹紅梅
檢驗醫(yī)學(xué) 2021年7期
關(guān)鍵詞:流感病毒探針定量

唐 鈞,曹紅梅

(上海市金山區(qū)亭林醫(yī)院檢驗科,上海 201505)

H1N1是甲型流感病毒的一種亞型,為RNA病毒,屬正黏液病毒科,其“H”指的是血球凝集素(hemagglutinin,H),而“N”指的是神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,N),2種都是糖蛋白,分布在病毒表面[1]。甲型H1N1流感病毒的宿主主要是犬科動物、鳥類和一些哺乳動物[2]。2009年3月,墨西哥首次發(fā)現(xiàn)了人感染甲型H1N1流感病毒的病例[3],然后傳播到全球。多項研究發(fā)現(xiàn),甲型H1N1流感病毒是一種變異后的新型甲型流感病毒,其基因組內(nèi)存在四源重配,是由人流感、豬流感和禽流感病毒基因混合而成的,該病毒的PBl基因源自人流感H3N2病毒,HA、NA、NP、NS和M基因源自豬流感H1N1病毒,PB2和PA基因源自禽流感H1N1病毒[4-5]。甲型H1N1流感病毒可通過直接或間接接觸、呼吸道等途徑在人群中傳播,臨床癥狀與普通流行性感冒十分相似,僅憑癥狀無法確診,且該病發(fā)展迅速,若不能及時治療,會出現(xiàn)肺炎、呼吸衰竭、多器官功能損傷等并發(fā)癥,死亡率極高[6-7]。以往主要通過血清診斷法、特異性抗體檢測法、細(xì)胞培養(yǎng)或雞胚培養(yǎng)分離病毒檢測甲型H1N1流感病毒感染,但這些方法較復(fù)雜且耗時較長,疫情暴發(fā)初期無法獲得毒株抗體,因此無法滿足臨床診斷需求[8]。所以,建立簡便、快捷的病毒檢測方法十分重要。本研究通過對甲型H1N1流感病毒HA基因和NA基因序列進(jìn)行分析,設(shè)計引物和TaqMan探針,建立檢測甲型H1N1流感病毒遺傳物質(zhì)的實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescence quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法,以期為防控甲型H1N1流感提供幫助。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

甲型H1N1流感病毒、H1~H16流感病毒、季節(jié)性流感病毒、豬流感病毒由生工生物工程(上海)股份有限公司惠贈,TRIzol試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司,甲型H1N1流感病毒(2009)RNA檢測試劑盒購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司,RNeasy Mini Kit核酸提取盒購自廣州健侖生物科技有限公司,One Step PrimeScript RT-PCR試劑盒和酶、dNTP等試劑購自上海酷樂生物科技有限公司。ABI 7500全自動實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司,T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司,不同稀釋度的甲型H1N1流感病毒、季節(jié)性流感病毒、禽流感病毒等流感病毒盲樣由中國疾病預(yù)防控制中心(Chinese Center for Disease Control and Prevention,CDC)提供。

1.2 檢測方法建立

1.2.1 引物和探針的合成 采用DNASTAR生物軟件進(jìn)行同源性分析,比較我國分離的甲型H1N1流感病毒HA基因和NA基因的核苷酸序列和GenBank數(shù)據(jù)庫中存在的核苷酸序列(HA,GenBank:MT186158.1;NA,GenBank:MT138529.1),選擇高度保守且特異的核苷酸區(qū)域設(shè)計特異性擴(kuò)增引物和TaqMan探針,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,探針由大連寶生物工程有限公司合成。HA基因上游引物為5'-CCCTCTACCAGAATAATCATAC-3′,下游引物為5'-ATGAATTATTACTGGACAC-3',探針為5'-(HEX)AGTCAGAGAACAAGCAGGCAGA(ECLIPS)-3'。NA基因上游引物為5'-CCCATATCGAACATTGATG-3',下游引物為5'-TACAATGGCATAATAACAGAC-3',探針為5'-(HEX)CTGTCCTATTGGTGAGGTTCCTTCT(ECLIPS)-3'。利用BLAST軟件分析探針序列的特異性。

1.2.2 病毒RNA的提取 采用TRIzol試劑提取季節(jié)性流感病毒、豬流感病毒RNA,置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。將提取到的RNA作為RT-PCR模板,用于逆轉(zhuǎn)錄試驗。

1.2.3 反應(yīng)體系的建立 反應(yīng)體系為25 μL,常規(guī)配置,包括RNA 2.0 μL,One Step RT-PCR 緩沖液12.5 μL(1×),Ex Taq HS 0.5 μL(1×),酶混合液0.5 μL(1×),PrimeScript RT enzyme MixⅡ 2 μL(1×),上游引物(10 μmol/L)1 μL,下游引物(10 μmol/L)1 μL,TaqMan探針0.5 μL(10 μmol/L),RNase Free dH2O 5 μL。反應(yīng)條件:50 ℃ 15 min;95 ℃ 15 s;95 ℃ 30 s,55 ℃ 45 s,共40個循環(huán),退火結(jié)束后讀取5-六氯熒光素氨基磷酸酯(5-hexachlorofluorescein phosphoramidite,HEX)實時熒光信號。根據(jù)收集的實時熒光曲線和擴(kuò)增循環(huán)閾值(cycle threshold,Ct)判定結(jié)果。

1.2.4 RNA標(biāo)準(zhǔn)品制備 采用TRIzol試劑提取甲型H1N1流感病毒RNA,用HA探針及引物擴(kuò)增后,用帶T7啟動子的引物進(jìn)行二次擴(kuò)增,用酚-氯仿溶液(V∶V=25∶24)純化。純化產(chǎn)物在體外按T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,采用SPT53-ZF7-B紫外分析儀(南京威美特科學(xué)儀器有限公司)測定濃度后分裝,于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 反應(yīng)體系優(yōu)化 對反應(yīng)體系中的不同引物與探針濃度組合、反應(yīng)體積、擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)等條件進(jìn)行優(yōu)化,以達(dá)到最優(yōu)組合。利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件建立實時熒光定量RT-PCR方法,然后檢測甲型H1N1流感病毒、H1~H16流感病毒、季節(jié)性流感病毒、豬流感病毒的RNA。

1.2.6 敏感性試驗及定量分析 用焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)水將RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍倍比稀釋,利用建立的實時熒光定量RT-PCR方法對不同濃度的RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行敏感性試驗,RNA標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為107、106、105、104、103拷貝/μL,同時采用通過標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣本進(jìn)行定量分析。

1.3 重復(fù)性試驗

以DEPC水為陰性對照,對106拷貝/μL RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行重復(fù)性試驗,批間檢測重復(fù)3次,批內(nèi)檢測重復(fù)5次,根據(jù)Ct值結(jié)果計算批間、批內(nèi)變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)。

1.4 樣本檢測

收集2019年5月—2020年10月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院傳染病科流行性感冒患者的鼻咽拭子樣本21份。采用柱提法提取RNA,取2 μL RNA,采用實時熒光定量RT-PCR檢測,同時采用雞胚培養(yǎng)法分離甲型 H1N1流感病毒。比較2種方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 特異性試驗

同源性分析結(jié)果顯示,設(shè)計的HA探針序列與甲型H1N1流感病毒H1基因序列的同源性達(dá)100%。

采用基于HA和NA探針及引物建立的實時熒光定量RT-PCR方法對構(gòu)建的陽性質(zhì)粒和甲型H1N1流感病毒、H1~H16流感病毒、季節(jié)性流感病毒、豬流感病毒的RNA進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示,HA探針的特異性好,甲型H1N1流感病毒核酸檢測結(jié)果為陽性時,其他病毒檢測結(jié)果均為陰性;NA探針對季節(jié)性流感病毒、豬流感病毒的檢測結(jié)果為弱陽性,因此選用HA探針進(jìn)行后續(xù)實驗。見圖1。

圖1 基于HA和NA探針及引物的擴(kuò)增動力學(xué)曲線

2.2 敏感性試驗

實時熒光定量RT-PCR檢測RNA標(biāo)準(zhǔn)品的敏感性為103拷貝/μL RNA分子,標(biāo)準(zhǔn)曲線r2=0.998。見圖 2。

圖2 實時熒光定量RT-PCR檢測RNA標(biāo)準(zhǔn)品的敏感性試驗結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 重復(fù)性試驗

陽性RNA標(biāo)準(zhǔn)品Ct值的批內(nèi)、批間CV均<10%,陰性標(biāo)準(zhǔn)品(DEPC水)重復(fù)檢測的Ct值均<0,重復(fù)性良好。見圖3。

圖3 RNA陽性標(biāo)準(zhǔn)品及陰性標(biāo)準(zhǔn)品批內(nèi)重復(fù)檢測的擴(kuò)增動力學(xué)曲線

2.4 樣本檢測結(jié)果

21份鼻咽拭子樣本中有2份檢測結(jié)果為陽性,Ct值分別為20.41、24.93;其他樣本均為陰性,與雞胚培養(yǎng)法的符合率為100%。

3 討論

甲型H1N1流感是一種由甲型H1N1流感病毒引起的急性呼吸道傳染病,可通過飛沫傳染、接觸傳染在人群中傳播[9]。2009年3月,甲型H1N1流感病毒在墨西哥被發(fā)現(xiàn)后,世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)把全球甲型H1N1流感大流行警告級別提高至5級;同時,我國也將其納入《中華人民共和國傳染病防治法》[10]規(guī)定的乙類傳染病和《中華人民共和國國境衛(wèi)生檢疫法》[11]規(guī)定的檢疫傳染病管理,并對其采取甲類傳染病的預(yù)防、控制措施。2009年6月11日,WHO將全球甲型H1N1流感大流行警告級別提高至6級,即警戒級別的最高級狀態(tài)[12]。2010年8月10日,WHO宣布甲型H1N1流感大流行已經(jīng)結(jié)束,甲型H1N1流感病毒的傳播基本接近尾聲,正步入后流感大流行階段;但該階段并不意味著甲型H1N1流感病毒已徹底消失;甲型H1N1流感病毒在未來幾年內(nèi)會繼續(xù)存在,由于此時該病毒的動向具有非常高的不可預(yù)測性,因此仍需對其保持警惕[13]。臨床上通常使用病毒培養(yǎng)法對流感病毒感染進(jìn)行診斷,雖然有較高的診斷準(zhǔn)確率,但受實驗室條件和人員條件的限制,且耗時久,無法滿足疫情暴發(fā)時的診斷需求[14]。因此,對病毒核酸進(jìn)行檢測,有助于疾病的早期診斷。

實時熒光定量RT-PCR能用少量的RNA識別出在某個特定時間細(xì)胞組織內(nèi)的特定基因,特異性、敏感性、自動化程度均較高,操作簡單、快捷,防污染效果較好,是檢測甲型H1N1流感病毒RNA的有效方法[12,15-16]。

本研究根據(jù)甲型H1N1流感病毒HA基因和NA基因的核苷酸序列和GenBank數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列設(shè)計引物和TaqMan探針,結(jié)果顯示,HA探針僅與甲型 H1N1流感病毒RNA反應(yīng),與H1~H16流感病毒、季節(jié)性流感病毒、豬流感病毒的RNA無交叉反應(yīng),特異性好;而NA探針與季節(jié)性流感病毒、豬流感病毒呈弱陽性反應(yīng),特異性較差;因此,本研究采用HA基因的引物和探針建立反應(yīng)體系并進(jìn)一步優(yōu)化,根據(jù)優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件建立檢測甲型H1N1流感病毒的實時熒光定量RT-PCR方法。該方法的敏感性為103拷貝/μL RNA分子,陽性RNA標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值批內(nèi)、批間CV均<10%,陰性標(biāo)準(zhǔn)品(DEPC水)重復(fù)檢測的Ct值均<0,重復(fù)性良好,與雞胚培養(yǎng)法的符合率為100%。

綜上所述,本研究建立了檢測甲型H1N1流感病毒RNA的實時熒光定量RT-PCR方法。該方法操作簡便、耗時較短、特異性較強(qiáng)、敏感性較高,可用于臨床檢測。

猜你喜歡
流感病毒探針定量
顯微定量法鑒別林下山參和園參
抗甲型流感病毒中藥活性成分的提取
當(dāng)歸和歐當(dāng)歸的定性與定量鑒別
10 種中藥制劑中柴胡的定量測定
高原地區(qū)流感病毒培養(yǎng)的條件優(yōu)化
多通道Taqman-探針熒光定量PCR鑒定MRSA方法的建立
流感病毒分子檢測技術(shù)的研究進(jìn)展
從噬菌體隨機(jī)七肽庫中篩選抗H3N2亞型犬流感病毒多肽的研究
慢性HBV感染不同狀態(tài)下HBsAg定量的臨床意義
透射電子顯微鏡中的掃描探針裝置