陸銀華，朱宇清，趙曉君，曹丹如，朱嶺峰，顧志冬

（1.上海市臨床檢驗(yàn)中心，上海 200126；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200025）

目前，用于丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）初篩的方法較多，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、化學(xué)發(fā)光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）、時(shí)間分辨熒光免疫分析法（time-resolved fluorescence immunoassay，TRFIA）。對(duì)于弱陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性樣本，主流國(guó)產(chǎn)試劑的S/CO值高于進(jìn)口試劑，但對(duì)于陽(yáng)性或陰性樣本，國(guó)產(chǎn)試劑的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）及特異性均明顯低于進(jìn)口試劑，導(dǎo)致出現(xiàn)較多的假陽(yáng)性結(jié)果[1]。此外，HCV初篩試劑均未設(shè)定灰區(qū)范圍，實(shí)驗(yàn)室對(duì)一些S/CO值較低，但>1的結(jié)果也發(fā)出陽(yáng)性報(bào)告，因此可能存在大量的假陽(yáng)性結(jié)果。為此，本研究擬對(duì)上海地區(qū)最常用的4家國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)與由ARCHITECT i2000SR全自動(dòng)免疫分析儀（美國(guó)雅培公司）及配套試劑組成的檢測(cè)系統(tǒng)（簡(jiǎn)稱(chēng)i2000SR檢測(cè)系統(tǒng)）測(cè)定抗HCV抗體結(jié)果的一致性及相關(guān)性進(jìn)行分析。

1 材料和方法

1.1 樣本來(lái)源

收集2012年1月—2014年7月上海市二、三級(jí)醫(yī)院各臨床實(shí)驗(yàn)室采用i2000SR檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定的S/CO值為1.0～9.0的抗HCV抗體灰區(qū)樣本120份，其中男性患者樣本59份、女性患者樣本61份，受檢者年齡14～83歲，所有樣本均采用確認(rèn)實(shí)驗(yàn)[重組免疫印跡法（recombinant immunoblotting assay，RIBA）]確認(rèn)為陽(yáng)性。所有樣本均無(wú)脂血、溶血，均未凝固。

1.2 方法

1.2.1 抗HCV抗體檢測(cè) 分別采用ELISA[試劑盒分別購(gòu)自上?？迫A生物工程股份有限公司（批號(hào)201403011）、上海榮盛生物藥業(yè)有限公司（批號(hào)2014503202），檢測(cè)儀器為Multiskan MK3酶標(biāo)儀（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司）]、TRFIA[ANYTEST時(shí)間分辨熒光分析儀（蘇州新波生物技術(shù)有限公司）及配套試劑（批號(hào)8600013651）]、CLIA[CHEMCLIN 100型半自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀（北京科美生物技術(shù)有限公司）及配套試劑（批號(hào)20140305）]檢測(cè)抗HCV抗體。采用i2000SR檢測(cè)系統(tǒng)（試劑批號(hào)32168L100、46355L100）進(jìn)行復(fù)檢。4種國(guó)產(chǎn)試劑與對(duì)應(yīng)的儀器組成4種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)，隨機(jī)編號(hào)為A檢測(cè)系統(tǒng)、B檢測(cè)系統(tǒng)、C檢測(cè)系統(tǒng)、D檢測(cè)系統(tǒng)，隨機(jī)進(jìn)行雙孔復(fù)檢，結(jié)果取均值。所有操作均嚴(yán)格按儀器和試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每塊酶標(biāo)板均加入質(zhì)控品一同檢測(cè)，室內(nèi)質(zhì)量控制質(zhì)控品（批號(hào)1401）由上海市臨床檢驗(yàn)中心提供。檢測(cè)結(jié)果以S/CO值表示?？笻CV抗體國(guó)家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品由國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心提供，濃度為8 NCU/mL。

1.2.2 精密度（以CV表示）評(píng)價(jià) 參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP15-A2文件[2]提供的簡(jiǎn)易方案操作。將抗HCV抗體國(guó)家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品（8 NCU/mL）倍比稀釋?zhuān)瑵舛确謩e為8、4、2、1、0.5 NCU/mL，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定4次，連續(xù)檢測(cè)5 d。計(jì)算不同檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的批內(nèi)不精密度（批內(nèi)CV）和總不精密度（總CV），比較不同國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果的線性關(guān)系。

1.2.3 一致性比對(duì) 比較4種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)與i2000SR檢測(cè)系統(tǒng)不同S/CO值區(qū)間臨床樣本檢測(cè)結(jié)果的符合率。將國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)的定性結(jié)果按4種檢測(cè)系統(tǒng)均陰性、任意1種檢測(cè)系統(tǒng)陽(yáng)性、任意2種檢測(cè)系統(tǒng)陽(yáng)性、任意3種檢測(cè)系統(tǒng)陽(yáng)性、4種檢測(cè)系統(tǒng)均陽(yáng)性分成5組，采用i2000SR檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)5組樣本，計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的±3s。

1.2.4 4種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性和一致性 計(jì)算4種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)弱陽(yáng)性樣本結(jié)果的相關(guān)性及一致性（Kappa值）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 精密度評(píng)價(jià)

對(duì)于不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，A、B、C、D 4種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)的批內(nèi)CV分別為17.6%～25.1%、0.8%～26.7%、7.8%～36.2%、0.7%～20.2%，總CV分別為15.9%～25.3%、1.0%～23.5%、7.7%～34.8%、3.4%～18.9%。除A檢測(cè)系統(tǒng)外，B、C、D 3種檢測(cè)系統(tǒng)的批內(nèi)CV和總CV均隨標(biāo)準(zhǔn)品濃度的升高而降低。對(duì)于濃度最低的標(biāo)準(zhǔn)品（0.5 NCU/mL），4種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)的批內(nèi)CV和總CV均>15%。見(jiàn)表1。

表1 4種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的不精密度結(jié)果

A、B、C、D 4種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)的線性相關(guān)方程分別為Y=0.634X+0.973、Y=2.495X+0.010、Y=1.348X+0.896、Y=2.510X-0.214。B、D 2種檢測(cè)系統(tǒng)的斜率非常接近，分別為2.495和2.510。A檢測(cè)系統(tǒng)和C檢測(cè)系統(tǒng)的斜率低于B檢測(cè)系統(tǒng)和D檢測(cè)系統(tǒng)，且A檢測(cè)系統(tǒng)的斜率最?。?.634）。各檢測(cè)系統(tǒng)的CV也表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)。見(jiàn)圖1。

圖1 4種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的線性

2.2 4種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)與i2000SR檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)抗HCV抗體結(jié)果的符合率

對(duì)于S/CO值為1.00～3.00的樣本，4種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)與i2000SR檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果的符合率為34.2%～55.2%；對(duì)于S/CO值為3.01～6.00的樣本，4種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)與i2000SR檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果的符合率為57.5%～80.0%；對(duì)于S/CO值為6.01～9.00的樣本，4種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)與i2000SR檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果的符合率均>90%。見(jiàn)表2。

表2 4種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)與i2000SR檢測(cè)系統(tǒng)抗HCV抗體檢測(cè)結(jié)果的符合率 例（%）

2.3 4種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性及一致性

根據(jù)各檢測(cè)系統(tǒng)的陽(yáng)性判斷值，對(duì)抗HCV抗體檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行定性分析。120份i2000SR檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定結(jié)果為陽(yáng)性的樣本中，4種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)均陰性的樣本數(shù)為23份（19.2%），S/CO值的±3s為2.80±4.35；任意1種檢測(cè)系統(tǒng)陽(yáng)性的樣本數(shù)為10份（8.3%），S/CO值的±3s為3.59±5.95；任意2種檢測(cè)系統(tǒng)陽(yáng)性的樣本數(shù)為5份（4.2%），S/CO值的±3s為3.70±7.47；任意3種檢測(cè)系統(tǒng)陽(yáng)性的樣本數(shù)為11份（9.2%），S/CO值的±3s為3.75±5.66；4種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)均陽(yáng)性的樣本數(shù)為71份（59.1%），S/CO值的±3s為5.13±7.84。

A檢測(cè)系統(tǒng)與B、C、D檢測(cè)系統(tǒng)的r值分別為0.712 5、0.760 0、0.837 0，Kappa值分別為0.666 3、0.598 5、0.742 6。B檢測(cè)系統(tǒng)與C、D檢測(cè)系統(tǒng)的r值分別為0.702 2、0.769 4，Kappa值分別為0.759 3、0.879 0。C檢測(cè)系統(tǒng)與D檢測(cè)系統(tǒng)的r值為0.736 4，Kappa值為0.664 8。B檢測(cè)系統(tǒng)與D檢測(cè)系統(tǒng)的一致性很好，A檢測(cè)系統(tǒng)與C檢測(cè)系統(tǒng)的一致性較差，其他檢測(cè)系統(tǒng)兩兩之間一致性均較好。見(jiàn)表3。

表3 4種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)弱陽(yáng)性樣本結(jié)果一致性分析

3 討論

抗HCV抗體是臨床診斷HCV感染的主要血清學(xué)指標(biāo)。ELISA、CLIA和TRFIA是目前臨床實(shí)驗(yàn)室及采供血機(jī)構(gòu)測(cè)定抗HCV抗體的主要方法，具有操作簡(jiǎn)便、快速、成本低、通量高、檢測(cè)敏感性和特異性較高等優(yōu)勢(shì)[3-4]。但這些方法的影響因素較多[5]，且為定性檢測(cè)。在臨床實(shí)際工作中，常會(huì)遇到不同品牌的抗HCV抗體檢測(cè)試劑測(cè)定結(jié)果不一致的情況，尤其是灰區(qū)樣本，這不僅會(huì)影響對(duì)患者的臨床診斷，還會(huì)導(dǎo)致獻(xiàn)血篩查發(fā)生漏檢[6]。目前，已有較多關(guān)于抗HCV抗體ELISA試劑之間的比對(duì)、可信度分析等的研究，但對(duì)于國(guó)產(chǎn)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)的評(píng)價(jià)較為少見(jiàn)。為此，本研究針對(duì)常用的國(guó)產(chǎn)ELISA和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定抗HCV抗體結(jié)果的一致性及相關(guān)性進(jìn)行分析，綜合評(píng)價(jià)不同檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果的可信程度。

目前，主要的商品化抗HCV檢測(cè)試劑盒均以HCV基因重組蛋白（由大腸埃希菌表達(dá)）或合成肽（核心區(qū)Core、NS3、NS4和NS5等蛋白片段）為抗原包被固相載體[7]，采用間接法原理進(jìn)行測(cè)定。由于不同廠商使用的HCV抗原的組合、來(lái)源、用量等有一定差異，導(dǎo)致不同品牌試劑盒的抗HCV抗體檢測(cè)結(jié)果有時(shí)會(huì)出現(xiàn)較大的差異[7-8]。本研究結(jié)果顯示，各檢測(cè)系統(tǒng)之間抗HCV抗體標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定結(jié)果存在差異，B檢測(cè)系統(tǒng)和D檢測(cè)系統(tǒng)線性相關(guān)方程中的斜率非常接近，分別為2.495和2.510；而A檢測(cè)系統(tǒng)和C檢測(cè)系統(tǒng)的斜率均低于B檢測(cè)系統(tǒng)和D檢測(cè)系統(tǒng)，特別是A檢測(cè)系統(tǒng)的斜率最低，為0.634，這使得A檢測(cè)系統(tǒng)的測(cè)定結(jié)果與其他3個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)的差異較大。4種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)的不精密度（CV）也有類(lèi)似表現(xiàn)，B、C和D 3種檢測(cè)系統(tǒng)的CV較接近，而A檢測(cè)系統(tǒng)的CV明顯大于其他檢測(cè)系統(tǒng)。由于這4種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)操作過(guò)程涉及的手工步驟較多，如加樣、洗板、溫育等，因此影響檢測(cè)的因素較多，導(dǎo)致不精密度較大，特別是對(duì)于0.5 NCU/mL的抗HCV抗體標(biāo)準(zhǔn)品，4種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)的批內(nèi)CV和總CV均>15%，與i2000SR檢測(cè)系統(tǒng)的CV有一定的差異。

長(zhǎng)期以來(lái)，檢驗(yàn)結(jié)果的一致性一直是臨床實(shí)驗(yàn)室關(guān)心的重要問(wèn)題。本研究結(jié)果顯示，對(duì)于抗HCV抗體濃度較高的樣本，各檢測(cè)系統(tǒng)之間的符合率隨S/CO值的升高而升高。在臨床實(shí)際工作中，檢測(cè)結(jié)果一致性較差的主要是低濃度和臨界值樣本。因此，本研究對(duì)i2000SR檢測(cè)系統(tǒng)S/CO值為1.00～9.00，且RIBA確認(rèn)為陽(yáng)性的樣本進(jìn)行了分析，評(píng)估不同檢測(cè)系統(tǒng)之間結(jié)果的一致性，結(jié)果顯示，對(duì)于S/CO值為1.00～3.00的樣本，除B檢測(cè)系統(tǒng)外，其他3種檢測(cè)系統(tǒng)與i2000SR檢測(cè)系統(tǒng)的符合率均未超過(guò)50%；隨著S/CO值的增大，4種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)與i2000SR檢測(cè)系統(tǒng)的符合率也隨之升高。120份灰區(qū)樣本中，4種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定均為陰性的樣本為23份（19.2%），S/CO值為1.00～7.15，提示對(duì)于S/CO值≤7.15的樣本，4種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)可能會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。任意3種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)均陽(yáng)性的樣本的S/CO值（±3s）為3.75±5.66，提示S/CO值>9.41的樣本，4種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)可以得出與i2000SR檢測(cè)系統(tǒng)一致的結(jié)果。對(duì)于S/CO值為7.15～9.41的樣本，各檢測(cè)系統(tǒng)之間會(huì)出現(xiàn)不一致的結(jié)果。因此，對(duì)于這一區(qū)間的樣本，應(yīng)采取相應(yīng)的復(fù)檢措施，以提高不同檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定結(jié)果的一致性。對(duì)于確認(rèn)實(shí)驗(yàn)為陰性的樣本，不同檢測(cè)系統(tǒng)之間檢測(cè)結(jié)果的一致性還有待進(jìn)一步研究。

本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示，4種國(guó)產(chǎn)檢測(cè)系統(tǒng)兩兩之間均呈正相關(guān)，r值最高為0.837 0，最低為0.702 2；一致性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，除A檢測(cè)系統(tǒng)與C檢測(cè)系統(tǒng)的Kappa值<0.6外，其他檢測(cè)系統(tǒng)兩兩之間一致性均較好（Kappa值均>0.6[9]）。A檢測(cè)系統(tǒng)與C檢測(cè)系統(tǒng)一致性較差的原因可能與臨界值陽(yáng)性樣本檢測(cè)結(jié)果不符有關(guān)。

綜上所述，對(duì)于抗HCV抗體灰區(qū)（S/CO值為1.00～9.41）樣本，建議至少使用2種試劑進(jìn)行復(fù)檢，有條件的實(shí)驗(yàn)室可采用高特異性的試劑進(jìn)行復(fù)檢[7]，以確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。對(duì)于低濃度樣本或臨界值樣本，應(yīng)充分考慮到不同檢測(cè)系統(tǒng)之間可能出現(xiàn)的結(jié)果不一致現(xiàn)象，制定合理的灰區(qū)范圍，以便能更好地應(yīng)用于臨床。