王文娟，胡志堅，何巍巍，歐陽良良，梁曉君

（九江學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，江西 九江 332000）

艱難梭菌 （Clostridium difficile,C.difficile）屬革蘭氏陽性厭氧芽孢桿菌，在自然環(huán)境中廣泛存在；是醫(yī)院內(nèi)抗生素相關(guān)感染性腹瀉的主要病因。在腸道定植的艱難梭菌可產(chǎn)生兩種外毒素，毒素A和B。毒素可導(dǎo)致急性炎癥、細胞壞死和腸道液體分泌[1-3]。近年來，在美國由艱難梭菌感染導(dǎo)致的死亡率增長迅猛[4]。通常情況下，只有當腸道正常菌群被破壞后，比如使用抗生素治療其他疾病的過程中，艱難梭菌才會造成感染發(fā)病[5,6]。因此，艱難梭菌感染已成為住院病人高發(fā)傳染病。而抗生素治療對艱難梭菌感染大多無效[7]。目前，治療艱難梭菌相關(guān)疾病（Clostridium difficile-associated disease,CDAD）的方法是盡可能停用導(dǎo)致疾病發(fā)生的抗生素，輔助以萬古霉素或甲硝唑進行治療。但治療方法無法重建腸道正常菌群對艱難梭菌感染的抑制，也無法阻止艱難梭菌芽孢的產(chǎn)生[8]。

CDAD在多種動物模型中進行研究，如倉鼠、豚鼠、無菌小鼠和大鼠等[9-12]。倉鼠是最常使用的動物模型，經(jīng)抗生素處理之后，艱難梭菌可在倉鼠腸道定植并誘發(fā)CDAD。但倉鼠發(fā)病的主要部位在盲腸，動物發(fā)病后會發(fā)展為腹瀉，并因急性炎癥而快速死亡。該模型可模擬快速發(fā)病并致死疾病類型，但與人體CDAD通常病程存在很多不同。實驗室常用的正常狀態(tài)的小鼠和大鼠不易感染艱難梭菌，但艱難梭菌可以在無菌小鼠和大鼠的腸道定植并發(fā)展成假膜性結(jié)腸炎，且與人體感染更為類似[13-15]。但無菌小鼠或大鼠的獲取價格昂貴，并不適合實驗室常規(guī)使用。

因此，本研究擬建立實驗室常用小鼠感染艱難梭菌模型，為后續(xù)研究艱難梭菌感染及治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 艱難梭菌ATCC 43255購自美國模式菌種保藏中心ATCC（American Type Culture Collection）。BALB/c小鼠（雌，14～16g），購自江西省中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。腦心浸液（干粉）購自BD公司 （BD Biosciences,237400），CCFA瓊 脂 基 礎(chǔ)（HB8808）和50%卵黃乳液（HB8295）購自青島海博生物技術(shù)有限公司，環(huán)絲氨酸（239831）和頭孢西丁鈉（C4786）購自Sigma公司。厭氧培養(yǎng)箱購自上?？等A生化儀器公司。氨芐西林（59349）、鏈霉素（1203008）、萬古霉素（V2002）購自Sigma公司。

1.2 動物處理及感染BALB/c小鼠隨機分成4組，每組10只，一組作為對照（不經(jīng)抗生素處理），另3組分別使用不同抗生素進行處理。氨芐西林（0.5mg/ml）、鏈 霉 素（5mg/ml）及 萬 古 霉 素（0.1mg/ml）添加入小鼠飲水中，小鼠自由飲水，處理5天。

1.3 艱難梭菌培養(yǎng)及感染 將艱難梭菌ATCC 43255劃線接種于CCFA平板（CCFA瓊脂基礎(chǔ)10.6g，加水定容至200ml，高壓滅菌后加入50%卵黃乳液10 ml，環(huán)絲氨酸0.1g，頭孢西丁3.2mg），于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，挑取單菌落接種于BHI培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜。然后取培養(yǎng)液涂布于血平板，厭氧培養(yǎng)5天以促使艱難梭菌芽孢產(chǎn)生。用無菌PBS將菌苔沖洗下平板，65C孵育2小時。芽孢經(jīng)無菌PBS沖洗3次，經(jīng)連續(xù)稀釋后涂布CCFA平板，定量芽孢數(shù)目（以CFU計數(shù)）。

小鼠經(jīng)抗生素飲用水處理5天，隨即換普通飲水1天。然后經(jīng)口腔灌胃103 CFU艱難梭菌。剩余菌經(jīng)連續(xù)稀釋后涂板定量計數(shù)，以確定接種菌量準確。

1.4 樣品采集和檢測指標 感染后24h，收集艱難梭菌感染后小鼠的糞便樣本并稱重，用PBS溶解后逐級稀釋，取不同梯度稀釋液涂布于CCFA平板，厭氧培養(yǎng)，計數(shù)芽孢菌數(shù)量。觀察小鼠死亡情況，繪制艱難梭菌感染后小鼠的生存曲線。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的抗生素處理及感染 我們選取了臨床上經(jīng)常使用的抗生素來破壞小鼠腸道正常菌群，觀察抗生素處理后小鼠對艱難梭菌的易感程度。將不同抗生素按如下濃度溶解于小鼠飲用水中，氨 芐 西 林0.5mg/ml，鏈 霉 素5mg/ml，萬 古 霉 素0.1mg/ml，小鼠自由飲水，處理5天。之后換成未添加抗生素的飲用水處理一天，隨后進行艱難梭菌感染。

2.2 不同抗生素處理的小鼠感染艱難梭菌后細菌載量的變化 經(jīng)抗生素處理過的小鼠感染艱難梭菌24h后，取小鼠糞便，溶解于無菌PBS，經(jīng)連續(xù)逐級稀釋后，涂布于平板，計數(shù)小鼠糞便艱難梭菌數(shù)量。實驗共計3次，計算菌落平均數(shù)。如圖1所示，鏈霉素處理后小鼠糞便中艱難梭菌含量最高，可達8.2107 CFU/g；氨芐西林處理的小鼠糞便中也可檢測到較高的艱難梭菌載量，可達1.5107 CFU/g；萬古霉素處理的小鼠糞便中檢測到的細菌載量很低，平均為3.6106 CFU/g。

圖1 不同抗生素處理小鼠感染艱難梭菌24h后糞便艱難梭菌載量（CFU/g）。ND，未檢測到。

2.3 不同抗生素處理的小鼠感染艱難梭菌后生存曲線 小鼠經(jīng)不同抗生素處理5天，換為正常飲水1天后，用103 CFU艱難梭菌芽孢進行感染，每天觀察記錄動物死亡狀況，繪制艱難梭菌感染后小鼠生存曲線。如圖2所示，經(jīng)鏈霉素處理的小鼠，從感染后第2天起即出現(xiàn)死亡，至感染后第6天全部小鼠均死亡；經(jīng)氨芐西林處理的小鼠，從感染后第3天出現(xiàn)死亡，至感染后第8天有60%的小鼠死亡；經(jīng)萬古霉素處理的小鼠，至感染后第8天有20%的小鼠死亡；未經(jīng)抗生素處理的小鼠，均存活。

圖2 不同抗生素處理的小鼠感染艱難梭菌后生存曲線

3 討論

艱難梭菌感染在發(fā)達國家越來越受重視，其發(fā)病率和死亡率在近些年來都在上升，美國每年由艱難梭菌導(dǎo)致的死亡病例多達14000例[16]；在國內(nèi)也引起越來越多關(guān)注。艱難梭菌感染往往發(fā)生在抗生素破壞腸道正常菌群后，因此，常規(guī)抗生素不能用來治療艱難梭菌感染。臨床成功使用腸道菌群移植的方法治療艱難梭菌感染，提示了腸道正常菌群在對抗艱難梭菌感染中發(fā)揮重要作用。實驗室簡單、易用的艱難梭菌感染動物模型的缺失是制約艱難梭菌深入研究的一個因素，因此，本研究擬建立艱難梭菌感染的小鼠模型。

以往研究發(fā)現(xiàn)使用頭孢哌酮、克林霉素、替加環(huán)素或多種抗生素聯(lián)合用藥處理C57BL/6小鼠，可增強其對艱難梭菌的易感性[17,18]。本文考察臨床常用的鏈霉素、氨芐西林和萬古霉素是否可破壞腸道正常菌群、提高小鼠對艱難梭菌的易感性。通過使用三種臨床常用的抗生素處理小鼠，破壞小鼠腸道正常菌群，觀察不同抗生素處理的小鼠對艱難梭菌的易感性變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鏈霉素處理后的小鼠對艱難梭菌感染最易感，經(jīng)氨芐西林處理的小鼠易感性次之，經(jīng)萬古霉素處理的小鼠對艱難梭菌易感性較差，而未經(jīng)處理的小鼠對艱難梭菌不易感。成功建立的艱難梭菌感染小鼠動物模型，為研究腸道菌群在對抗艱難梭菌感染中的作用及機制、艱難梭菌感染預(yù)防治療方案的評價等奠定了基礎(chǔ)。