盧玲，呂婷婷，黃其柳，黃小妹，宋曦，秦紅玲，刁麗梅*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

顳葉癲癇是局灶性癲癇的一種常見類型，具有反復(fù)發(fā)作的特點，極易發(fā)展成藥物難治性癲癇[1]。顳葉癲癇患者可伴有認(rèn)知功能障礙、焦慮、抑郁等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的工作、學(xué)習(xí)和生活質(zhì)量[2]。長期使用傳統(tǒng)的抗癲癇藥物可導(dǎo)致衰老及認(rèn)知功能障礙等。中醫(yī)藥治療癲癇歷史悠久，對于顳葉癲癇的輔助治療更具有較好的療效優(yōu)勢[3]。本課題組長期的臨床實踐發(fā)現(xiàn)，柴胡-鉤藤配伍對顳葉癲癇的輔助治療具有良好的效果。近幾年的基礎(chǔ)實驗研究也表明，柴胡中含有的有效成分柴胡皂苷可以減低癲癇大鼠顳葉皮層、海馬區(qū)P-糖蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮抗癲癇作用[4]。鉤藤通過調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞，可降低腦損傷早期的癲癇易感性，且具有神經(jīng)保護(hù)作用[5]。但是，柴胡-鉤藤配伍的活性成分如何作用于顳葉癲癇的作用機制尚未有相關(guān)的研究和報道。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合了系統(tǒng)生物學(xué)、分子生物學(xué)、藥理學(xué)等多門學(xué)科，并以計算機網(wǎng)絡(luò)為平臺來預(yù)測藥物的作用靶點、從而提高藥物發(fā)現(xiàn)效率[6]。分子對接技術(shù)是指通過計算機軟件預(yù)測藥物小分子與靶點蛋白之間的結(jié)合模式和親和力[7]。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，探討柴胡-鉤藤配伍治療顳葉癲癇的作用機制，為柴胡-鉤藤配伍在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 顳葉癲癇相關(guān)靶點的收集

以“Temporal Lobe Epilepsy”為關(guān)鍵詞分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)以及OMIM數(shù)據(jù)庫(https：//omim.org/search/advanced/)中檢索顳葉癲癇相關(guān)的靶點，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理去重。

1.2 中藥有效成分的查找

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)中分別檢索柴胡、鉤藤的成分，并以藥物篩選建議：口服生物利用度(OB)[8]≥30%，類藥性(DL)[9]≥0.18為過濾條件，分別篩選得到柴胡和鉤藤的有效成分。

1.3 中藥作用靶點的收集

將篩選出的柴胡和鉤藤的有效成分分別輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫中，檢索獲得有效成分對應(yīng)的靶點。把成分及靶點數(shù)據(jù)進(jìn)行編排去重，導(dǎo)入到UniProt 數(shù)據(jù)庫中(https：//www.uniprot.org/)，對靶點蛋白進(jìn)行基因注釋，獲得靶點對應(yīng)的Gene symbol。

1.4 柴胡-鉤藤配伍治療顳葉癲癇的靶點

將顳葉癲癇相關(guān)的靶點以及柴胡-鉤藤配伍的作用靶點共同導(dǎo)入到venny2.1.0在線軟件中(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)進(jìn)行映射，得到柴胡-鉤藤配伍治療顳葉癲癇的治療靶點。

1.5 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

把篩選出的治療靶點輸入到STRING數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)中，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI網(wǎng)路)，以了解各個靶點蛋白之間是否存在著相互作用關(guān)系。

1.6 GO和KEGG富集分析

本研究中基因富集分析是基于R語言軟件(版本：v.3.5.0)條件下進(jìn)行的，其軟件包clusterProfiler可以對基因集合或基因簇進(jìn)行GO和KEGG富集分析和可視化[10]。將治療靶點導(dǎo)入R語言軟件中進(jìn)行富集，并以P value<0.05且P.adjust<0.05為篩選條件，選取符合條件的前20的GO生物功能和KEGG通路。

1.7 “成分-靶點-通路-疾病”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

對柴胡-鉤藤配伍的有效成分、顳葉癲癇的治療靶點、以及治療靶點富集前20條KEGG信號通路進(jìn)行編排。并將編排的關(guān)系對文件導(dǎo)入到Cytoscape3.6.1軟件中進(jìn)行可視化，構(gòu)建“柴胡-鉤藤藥對有效成分-治療靶點-KEGG信號通路-顳葉癲癇”多維關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，計算網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點連接度(degree值)。選取degree值最大的靶點，即柴胡-鉤藤配伍治療顳葉癲癇的核心治療靶點。

1.8 分子對接預(yù)測

為了解柴胡-鉤藤藥對的有效成分與治療靶點的結(jié)合情況，本研究通過分子對接技術(shù)將柴胡-鉤藤的有效成分分別與核心治療靶點進(jìn)行分子對接。同時以顳葉癲癇常用藥物卡馬西平、丙戊酸鈉、左乙拉西坦作為對照分析。首先在RSCB PDB數(shù)據(jù)庫中檢索獲得核心靶點蛋白的結(jié)構(gòu)信息；在PubChem數(shù)據(jù)庫中查找獲得柴胡-鉤藤有效成分的結(jié)構(gòu)信息以及卡馬西平、丙戊酸鈉、左乙拉西坦的結(jié)構(gòu)信息；最后通過Autodock Vina實現(xiàn)小分子化合物與靶點蛋白的分子對接。

2 結(jié)果

2.1 顳葉癲癇相關(guān)的靶點

在GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索獲得2 780個顳葉癲癇的靶點，在OMIM數(shù)據(jù)庫中查找得到553個顳葉癲癇靶點。對兩個數(shù)據(jù)庫的靶點信息進(jìn)行合并，去除重復(fù)部分后共得到顳葉癲癇相關(guān)的靶點3 230個。

2.2 柴胡-鉤藤藥對有效成分及靶點

根據(jù)過濾條件：口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18篩選出柴胡的有效成分17種，鉤藤的有效成分33種，共50種。根據(jù)藥物有效成分，在TCMSP中檢索共得到柴胡-鉤藤藥對有效成分作用的靶點200個。

2.3 柴胡-鉤藤配伍治療顳葉癲癇的靶點

將顳葉癲癇相關(guān)的3 230個靶點以及柴胡-鉤藤藥對有效成分作用的200個靶點導(dǎo)入到venny中進(jìn)行映射，得到柴胡-鉤藤藥對治療顳葉癲癇的靶點共116個。對這116個治療靶點信息進(jìn)行編排，結(jié)果表明：在柴胡-鉤藤藥對的50種有效成分中，能作用于這116個治療靶點的有效成分有41種，部分有效成分見表1。

表1 柴胡-鉤藤配伍作用于顳葉癲癇的部分有效成分基本信息

2.4 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)

把柴胡-鉤藤藥對治療顳葉癲癇的116個靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫中，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果表明：116個柴胡-鉤藤藥對作用于顳葉癲癇的治療靶點相互之間均存在直接或間接的作用關(guān)系，見圖1。其中PTGS2、MAPK1、AKT1、GASP3、VEGFA等治療靶點均在PPI網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

2.5 GO和KEGG分析

本研究基于R語言軟件中的clusterProfiler包對116個治療靶點進(jìn)行GO和KEGG富集分析，并以P value<0.05且P.adjust<0.05為篩選條件，選取符合條件的前20的GO生物功能和KEGG通路。結(jié)果表明：治療靶點主要影響銨離子結(jié)合、兒茶酚胺結(jié)合、多巴胺結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體的活動、多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)受體活動、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、組蛋白激酶活性、類固醇激素受體活性、激酶調(diào)節(jié)活動、細(xì)胞因子受體結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、核受體的活動、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接配體調(diào)控序列特異性DNA結(jié)合、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合、蛋白結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、支架蛋白結(jié)合、整合素結(jié)合等生物學(xué)功能，見圖2；并且主要涉及糖尿病并發(fā)癥的年齡-憤怒信號通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、前列腺癌、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、結(jié)腸直腸癌、人類巨細(xì)胞病毒感染、內(nèi)分泌的阻力、麻疹、胰腺癌、松弛素信號通路、多巴胺能神經(jīng)突觸、膀胱癌、eb病毒感染、VEGF信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、丙型肝炎、肺結(jié)核等信號通路，見圖3。

注：灰度越深，圓形越大，則表明該靶點在PPI網(wǎng)絡(luò)中越重要。圖1 116個治療靶點的PPI關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

注：橫坐標(biāo)代表基因數(shù)，縱坐標(biāo)代表GO條目，由上至下P值逐漸增大。圖2 GO 分析柱狀圖

2.6 構(gòu)建“成分-靶點-通路-疾病”多維關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

將柴胡-鉤藤藥對的41種有效成分、116個治療靶點以及治療靶點富集的前20條KEGG信號通路編排成關(guān)系對文件，導(dǎo)入Cytoscape軟件中進(jìn)行可視化分析，得到“柴胡-鉤藤藥對有效成分-治療靶點-KEGG通路-顳葉癲癇”多維關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，見圖4。計算網(wǎng)絡(luò)中各個治療靶點的Degree值(表2)。結(jié)果表明：柴胡-鉤藤配伍治療顳葉癲癇是通過多成分、多靶點、多通路共同起作用的。PTGS2是多維關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中連接度最高的靶點，且它也是PPI網(wǎng)絡(luò)中的重要靶點。因此它可能是柴胡-鉤藤藥對治療顳葉癲癇的核心靶點，在治療機制中發(fā)揮著重要的作用。

表2 柴胡-鉤藤配伍治療顳葉癲癇的前30個靶點

2.7 分子對接預(yù)測

通過分子對接技術(shù)預(yù)測核心治療靶點PTGS2與柴胡-鉤藤藥對的41種有效成分的結(jié)合情況，計算出靶點蛋白與有效成分之間的結(jié)合能，見表3。若結(jié)合能<0 kJ/mol，表明有效成分小分子與靶點蛋白可以自發(fā)地結(jié)合，親合能<-5.0 kJ/mol，表明其結(jié)合性良好，結(jié)合能越小則分子間對接越好[11]。分子對接的結(jié)果表明：柴胡-鉤藤配伍藥對的41種有效成分均與核心治療靶點PTGS2的結(jié)合性良好，且97.56%的有效成分結(jié)合性優(yōu)于左乙拉西坦和丙戊酸鈉。乙酸亞油醇酯與核心靶點的結(jié)合性較左乙拉西坦差，但與丙戊酸鈉相似。此外，有7.31%的有效成分與核心靶點的結(jié)合性優(yōu)于卡馬西平，其余有效成分結(jié)合性均與卡馬西平相近。綜上，柴胡-鉤藤配伍對顳葉癲癇的療效顯著可能是由于其有效成分與顳葉癲癇的藥物靶點之間的結(jié)合性良好。

3 討論

顳葉癲癇屬于中醫(yī)“癇病”“癇證”的范疇，與風(fēng)、痰、瘀、毒等病理因素密切相關(guān)[12]。早在《內(nèi)經(jīng)》有“諸風(fēng)掉眩皆屬于肝，熱盛動風(fēng)，風(fēng)勝則動”，《三因極一病證方論》曰：“夫癲癇病，皆由驚動，使臟氣不平”;《醫(yī)方考》言：“癲疾者，風(fēng)痰之故也……風(fēng)熱盛于肝，則一身之筋牽掣，故令手足搐溺也”，均表明癇病的發(fā)病與肝氣疏泄失常密切相關(guān)。因此，中醫(yī)臨床上辨治癇病注重“從肝論治”[13-15]。常治以疏肝解郁、化痰熄風(fēng)，如本課題組臨床上常使用的加味柴胡疏肝湯，方中柴胡功善疏肝解郁，鉤藤平肝熄風(fēng)止痙之效佳，二者均歸肝經(jīng)，配伍應(yīng)用可增強治癇之力[16-19]。且既往基礎(chǔ)研究也證實了“從肝論治”復(fù)方加味柴胡疏肝湯的抗癲癇作用[20]。但是，加味柴胡疏肝湯中柴胡-鉤藤配伍抗癲癇作用機制尚未有相關(guān)的報道，因此本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)初步揭示柴胡-鉤藤配伍對顳葉癲癇的治療作用機制。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)篩選出柴胡-鉤藤配伍治療顳葉癲癇的有效成分有41種，治療靶點共116個；構(gòu)建了“PPI網(wǎng)絡(luò)”和“柴胡-鉤藤藥對有效成分-治療靶點-KEGG通路-顳葉癲癇”多維關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，篩選出核心治療靶點PTGS2。結(jié)果表明：柴胡-鉤藤配伍的同一種有效成分可作用于多個治療靶點，同一個治療靶點亦可對應(yīng)多種有效成分；同一個治療靶點可參與多條信號通絡(luò)，同一條信號通路亦可富集多個治療靶點。因此，柴胡-鉤藤配伍治療顳葉癲癇是通過多成分、多靶點、多通路共同起作用的。116個治療靶點之間均有直接或間接的相互作用關(guān)系，而核心靶點PTGS2在“成分-靶點-通路-疾病”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)和“PPI網(wǎng)絡(luò)”中均發(fā)揮著重要的作用，它可能在柴胡-鉤藤藥對治療顳葉癲癇的機制中有著重要的意義。此外，本研究通過分子對接技術(shù)預(yù)測了核心治療靶點與柴胡-鉤藤配伍有效成分的結(jié)合性。結(jié)果表明：柴胡-鉤藤配伍對顳葉癲癇的療效顯著可能是由于其多種有效成分均與顳葉癲癇中的藥物靶點之間的結(jié)合性良好有關(guān)。

本研究篩選的核心治療靶點環(huán)氧合酶-2(PTGS2)是一種合成炎性介質(zhì)前列腺素的酶，已被廣泛報道在癲癇發(fā)作過程中被誘導(dǎo)，被認(rèn)為是癲癇治療的潛在神經(jīng)治療靶點[21]。研究表明，PTGS2在顳葉癲癇的急性期和慢性期表達(dá)均顯著上調(diào)，而在潛伏期表達(dá)不明顯，通過靶向PTGS2阻斷前列腺素級聯(lián)反應(yīng)已被認(rèn)為是干預(yù)顳葉癲癇急性發(fā)作或癲癇持續(xù)狀態(tài)的一種方法[22-23]。癲癇發(fā)作后，包括白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子α(TNFα)、環(huán)氧合酶-2(PTGS2)等關(guān)鍵炎癥介質(zhì)的表達(dá)明顯增加，可能導(dǎo)致腦內(nèi)繼發(fā)性損傷，增加癲癇反復(fù)發(fā)作的可能性。在癲癇大腦特定區(qū)域PTGS2水平的升高有助于識別癲癇引起的腦部炎癥區(qū)域，因此，PTGS2抑制劑對顳葉癲癇、炎癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病起到治療和干預(yù)作用[24]。綜上，PTGS2與顳葉癲癇的發(fā)病及治療密切相關(guān)。因此，PTGS2用于分子對接驗證靶點與藥物有效成分的結(jié)合情況具有一定的可靠性。

靶點功能分析結(jié)果表明，治療靶點共影響了157個GO生物功能；涉及157個KEGG信號通路。治療靶點主要影響的離子結(jié)合、兒茶酚胺結(jié)合、多巴胺結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體的活動、多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)受體活動、類固醇激素受體活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合、蛋白結(jié)合等生物學(xué)功能與文獻(xiàn)中報道相一致，均與癲癇及顳葉癲癇等的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[25-29]。

治療靶點富集的KEGG信號通路中，與顳葉癲癇的發(fā)病相關(guān)的主要有IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、內(nèi)分泌的阻力(Endocrine resistance)、多巴胺能神經(jīng)突觸(Dopaminergic synapse)、VEGF信號通路等。顳葉癲癇的發(fā)病與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，而炎性細(xì)胞因子血清白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子均是介導(dǎo)炎癥發(fā)生的重要參與因素[30-31]。研究證實在顳葉癲癇患者中，血清白細(xì)胞介素的水平明顯升高[25]。促炎性IL-17信號通路在藥物難治性癲癇免疫組學(xué)結(jié)構(gòu)中起著主導(dǎo)的作用[32]。促炎因子IL-17具有增加血腦屏障的通透性和神經(jīng)元興奮性的作用，其促炎作用可能與顳葉癲癇的發(fā)作有關(guān)。腫瘤壞死因子α(TNF-α)可以通過調(diào)節(jié)谷氨酸受體的運輸，增加興奮性突觸的傳遞，從而導(dǎo)致包括顳葉癲癇在內(nèi)的癲癇發(fā)生率升高[33]。部分癲癇患者可伴有包括甲狀腺功能減退、生長減慢、體重異常、生殖和性功能障礙等在內(nèi)的內(nèi)分泌系統(tǒng)并發(fā)癥，這可能與內(nèi)分泌阻力有關(guān)[34]。多巴胺能系統(tǒng)作為腦內(nèi)重要的神經(jīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，對神經(jīng)元興奮性有重要影響。研究發(fā)現(xiàn)顳葉癲癇患者存在著多巴胺介導(dǎo)的神經(jīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)失衡，多巴胺在突觸中的持久性可能通過降低癲癇發(fā)作的閾值，從而導(dǎo)致癲癇更頻繁的發(fā)作[35]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號被證實是耐藥性顳葉癲癇的相關(guān)介質(zhì)。VEGF信號介導(dǎo)的腦血管重塑可能參與癲癇腦內(nèi)突觸神經(jīng)傳遞的調(diào)節(jié)。此外，VEGF的產(chǎn)生及其受體在內(nèi)皮細(xì)胞中的激活改變了血腦屏障的通透性，并可能加強神經(jīng)元損傷和癲癇的發(fā)作[36-37]。綜上，本研究篩選的116個治療靶點中，其富集的主要生物學(xué)功能及信號通路與顳葉癲癇密切相關(guān)，且與文獻(xiàn)報道大致相同。

近年的臨床研究發(fā)現(xiàn)，對于使用卡馬西平治療無效的顳葉癲癇患者，添加左乙拉西坦可提高其療效，且優(yōu)于添加丙戊酸鈉[38]。而卡馬西平聯(lián)合丙戊酸鈉治療顳葉癲癇可減輕藥物的不良反應(yīng)[39]。因此，本研究選擇卡馬西平、左乙拉西坦、丙戊酸鈉作為對照藥物，進(jìn)行分子對接。結(jié)果表明：柴胡-鉤藤配伍的41種有效成分均可與核心治療靶點PTGS2結(jié)合良好，除了乙酸亞油醇酯(Linoleyl acetate)外，其余有效成分與核心靶點的結(jié)合性均優(yōu)于左乙拉西坦和丙戊酸鈉，且結(jié)合性優(yōu)于卡馬西平的有效成分有3種。這可能是柴胡-鉤藤配伍聯(lián)合西藥治療顳葉癲癇療效顯著的重要原因。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，初步挖掘了柴胡-鉤藤配伍治療顳葉癲癇的活性成分及成分作用的治療靶點、靶點的相互作用關(guān)系、GO生物學(xué)功能及KEGG信號通路；構(gòu)建“成分-靶點-通路-疾病”多維關(guān)系網(wǎng)絡(luò)；揭示柴胡-鉤藤配伍輔助治療顳葉癲癇的作用機制。結(jié)果表明：柴胡-鉤藤配伍的有效成分可能通過多靶點、多途徑、多通路對顳葉癲癇起到治療作用。

本研究探討柴胡與鉤藤的配伍具有理論上的創(chuàng)新性，也進(jìn)一步拓寬了柴胡-鉤藤配伍在臨床中的應(yīng)用，為本課題組在柴胡-鉤藤配伍應(yīng)用方面的深入研究奠定了良好的理論基礎(chǔ)。