張家意丘韶麟陳苑廖瑋

(1.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東 廣州 511442；2.廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，廣東 廣州 511442； 3.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 511442)

引言

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是一種廣譜抗菌藥物，對(duì)大部分細(xì)菌有抑制、殺菌作用。正因其抑菌性強(qiáng)、藥效佳，氯霉素曾在水產(chǎn)、畜禽養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛使用，使得養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)業(yè)穩(wěn)定增益。從應(yīng)用演化成濫用，氯霉素殘留對(duì)動(dòng)物、人體都有著極大危害，至今仍威脅我國(guó)水產(chǎn)品的安全，危害著產(chǎn)業(yè)發(fā)展和群眾生命健康的同時(shí)也對(duì)我國(guó)國(guó)際地位造成影響。根據(jù)農(nóng)村農(nóng)業(yè)部第250號(hào)公告[1]《食品動(dòng)物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》，嚴(yán)禁氯霉素藥物在動(dòng)物源食品中使用，可見(jiàn)政府對(duì)違禁藥物的監(jiān)管力度大，也從側(cè)面表現(xiàn)問(wèn)題的嚴(yán)峻性。2016年高裕鋒等[2]對(duì)廣東省部分地區(qū)市場(chǎng)銷售的150批次水產(chǎn)品進(jìn)行氯霉素殘留情況調(diào)查，調(diào)查結(jié)果顯示，氯霉素檢出率為11.33%。2019年宋安華等[3]對(duì)廣州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)抽檢的2702批次水產(chǎn)品進(jìn)行快篩分析，分析結(jié)果得出，蝦類的氯霉素殘留不合格率達(dá)到17.39%。

目前，最常見(jiàn)檢測(cè)氯霉素殘留的方法有微生物法、免疫分析法、色譜法、串聯(lián)質(zhì)譜法，以及新型技術(shù)，如分子印跡法、電化學(xué)傳感器、生物芯片法、拉曼光譜等[4]。其中，免疫分析法主要包括酶聯(lián)分析法(ELISA)、膠體金免疫分析法(GICA)等。國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管總局發(fā)布的2019年第41號(hào)公告[5]《保健食品中西地那非和他達(dá)拉非的快速檢測(cè) 膠體金免疫層析法》等13項(xiàng)食品快速檢測(cè)方法里發(fā)布了《KJ201905水產(chǎn)品中氯霉素的快速檢測(cè) 膠體金免疫層析法》。膠體金免疫層析法是應(yīng)用于快速快篩方法和產(chǎn)品中最多的快檢技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)在于特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短，適用于現(xiàn)場(chǎng)大批量樣品的篩查檢測(cè)。隨著國(guó)家推動(dòng)快速檢測(cè)方法，對(duì)快速檢測(cè)工作的規(guī)范管理要求也在不斷提高。李濤等[6]對(duì)于水產(chǎn)品中氯霉素快速檢測(cè)產(chǎn)品的驗(yàn)證性評(píng)價(jià)及分析中表明，通過(guò)對(duì)氯霉素快速檢測(cè)試劑盒進(jìn)行技術(shù)指標(biāo)的評(píng)價(jià)，符合要求的適宜在現(xiàn)場(chǎng)實(shí)際監(jiān)管中推廣使用。

膠體金免疫層析法也存在缺點(diǎn)，產(chǎn)品性能方面，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性的現(xiàn)象；產(chǎn)品呈現(xiàn)效果方面，會(huì)出現(xiàn)顯色效果不佳、斷線影響結(jié)果判斷等。因此，此方法對(duì)于樣品基質(zhì)的適用性和前處理方法仍需要不斷改進(jìn)。本次實(shí)驗(yàn)是通過(guò)使用符合國(guó)家規(guī)定的快速檢測(cè)方法以及性能評(píng)價(jià)符合規(guī)范要求的快檢產(chǎn)品來(lái)完成水產(chǎn)品中氯霉素殘留的快檢實(shí)驗(yàn)，在氯霉素快檢試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)規(guī)定的操作步驟基礎(chǔ)上通過(guò)2種不同的樣品前處理方式，分別在樣品提取前、凈化后進(jìn)行改良，觀察膠體金卡實(shí)驗(yàn)結(jié)果的呈現(xiàn)效果，以使基層快檢員在使用膠體金免疫層析法檢測(cè)氯霉素殘留的過(guò)程中能夠提高使用效果，對(duì)可能存在基質(zhì)干擾樣品的檢測(cè)結(jié)果判讀更有把握。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器設(shè)備

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品(1mg·mL-1，北京曼哈格生物科技有限公司)；石油醚、乙酸乙酯、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；甲醇(色譜純，美國(guó)霍尼韋爾B&J公司)；氯霉素殘留檢測(cè)試紙條(內(nèi)含試劑及檢測(cè)卡，北京勤邦生物技術(shù)有限公司)。

搗樣機(jī)(JYL-C020E，九陽(yáng))；電子天平(AR323CN，奧豪斯儀器有限公司)；旋渦混合器(MS3 basic S025，德國(guó)IKA公司)；離心機(jī)(2-4，上海拖莫斯科學(xué)儀器有限公司)；樣品濃縮儀(Pro-12L，南京百思威科技發(fā)展有限公司)；單道手動(dòng)可調(diào)移液器(20～200μL、1～5mL，芬蘭biohit實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司)；恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 快檢試劑盒的選擇

本實(shí)驗(yàn)所使用的快檢試劑盒氯霉素殘留檢測(cè)試紙條為廣東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布《食品快速檢測(cè)已評(píng)價(jià)產(chǎn)品目錄》中的合格快檢產(chǎn)品，產(chǎn)品標(biāo)示檢出限0.1μg·kg-1。

1.3 2種前處理方式

原提取和脫脂提取。

1.4 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.4.1 樣品的選取及制備

本次實(shí)驗(yàn)的樣品共3種，分別是牡蠣(生蠔)、鳙魚(yú)(大頭魚(yú))、豬肉。獲取方式是在當(dāng)?shù)夭煌r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)所銷售的產(chǎn)品中進(jìn)行隨機(jī)采購(gòu)，采購(gòu)數(shù)量要同時(shí)滿足快檢實(shí)驗(yàn)及本次實(shí)驗(yàn)需求。

每種樣品經(jīng)過(guò)去頭、去皮、去內(nèi)臟，取可食部位約100～150g，用搗樣機(jī)均勻絞碎，絞碎后的樣品冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 提取

1.4.2.1 原提取

稱取1.4.1制備好的樣品2.00g(±0.01g)置于15mL離心管中，加入4mL提取劑(乙酸乙酯)；使用旋渦混合器渦動(dòng)2min后，4000r·min-1離心5min。

1.4.2.2 脫脂提取

把1.4.1制備好的樣品放置玻璃燒杯中，加入石油醚，浸沒(méi)過(guò)杯中樣品高度，使用玻璃棒讓樣品與石油醚混勻反應(yīng)；開(kāi)啟水浴鍋，溫度調(diào)至60℃，把石油醚與樣品混勻后的樣品燒杯放在水浴鍋孔上，讓石油醚充分揮發(fā)。

1.4.3 濃縮

移取3mL上層有機(jī)相至10mL離心管中，再置于50～60℃的樣品濃縮儀通過(guò)氮?dú)饬骰蚩諝饬飨麓蹈伞?/p>

1.4.4 復(fù)溶

向吹干的試管中依次加入0.2mL樣本復(fù)溶液(磷酸鹽緩沖液)，用旋渦混合器渦動(dòng)2min充分混勻，使試管內(nèi)壁上的殘留物溶解，靜置后待測(cè)。

1.4.5 測(cè)定

從原包裝中取出氯霉素快速檢測(cè)試紙條，吸取75μL樣品待測(cè)液于試紙條的加樣孔中，液體流動(dòng)時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，反應(yīng)10min，根據(jù)結(jié)果示意圖進(jìn)行判讀。從原包裝中取出的氯霉素快速檢測(cè)試紙條使用時(shí)應(yīng)回溫至室溫，并在1h內(nèi)使用。

1.4.6 判讀

通過(guò)對(duì)比試紙條的控制線(C線)和檢測(cè)線(T線)的顏色深淺進(jìn)行結(jié)果判讀。由于長(zhǎng)時(shí)間放置會(huì)引起檢測(cè)線顏色的變化，需在規(guī)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行結(jié)果判讀，結(jié)果判讀分3種情況。陰性(-)：檢測(cè)線(T線)顏色比控制線(C線)顏色深或者檢測(cè)線(T線)顏色與控制線(C線)顏色相當(dāng)，表明樣品中氯霉素含量低于方法檢測(cè)限，見(jiàn)圖1。陽(yáng)性(+)：檢測(cè)線(T線)不顯色或檢測(cè)線(T線)顏色比控制線(C線)顏色淺，表明樣品中氯霉素含量高于方法檢測(cè)限，見(jiàn)圖2。無(wú)效：控制線(C線)不顯色，表明不正確操作或試紙條/檢測(cè)卡無(wú)效，見(jiàn)圖3。

圖1 陰性結(jié)果圖 圖2 陽(yáng)性結(jié)果圖 圖3 無(wú)效結(jié)果圖

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)使用氯霉素快速檢測(cè)試紙條分別按照2種方法對(duì)本次3種基質(zhì)的樣品分別完成了3組(每組4份)的快速檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，添加氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品到各組分樣品中，添加濃度分別是0μg·kg-1、0.05μg·kg-1(0.5倍檢出水平)、0.1μg·kg-1(1.0倍檢出水平)，每個(gè)濃度做2個(gè)平行樣。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯總

3 結(jié)論

3種基質(zhì)的樣品使用原提取或脫脂提取進(jìn)行前處理得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均能符合說(shuō)明書(shū)的判定要求，通過(guò)添加對(duì)應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)得出的陰陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果均能達(dá)到試劑盒標(biāo)示的檢測(cè)水平要求。

原提取的樣品點(diǎn)板效果比經(jīng)過(guò)脫脂提取后的樣品點(diǎn)板效果要好，具體體現(xiàn)：C/T線顏色較深，2條線對(duì)比較為明顯，易于結(jié)果判定；C/T線不易出現(xiàn)斷線情況，不容易影響結(jié)果判定；即使過(guò)了有效判定時(shí)間，結(jié)果也不會(huì)改變。

石油醚是低沸點(diǎn)烷烴組成的非極性有機(jī)溶劑，加入樣品后可以與動(dòng)物中的脂肪酸互溶，石油醚沸點(diǎn)較低，容易揮發(fā)，故可以通過(guò)加入石油醚至樣品中進(jìn)行脫脂。脫脂后的樣品再按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，可以提高判定結(jié)果的準(zhǔn)確度。