朱顯亮，周長品，賈翠蓉，翁啟杰，李發(fā)根

(中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所, 熱帶林業(yè)研究國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510520)

桉樹起源于澳大利亞及其附近島嶼，是桃金娘科(Myrtaceae)桉屬(Eucalyptus)、杯果木屬(Angophora)和傘房屬(Corymbia)的總稱[1-2]。我國自1890年引種桉樹，至今已有100余年歷史[3]。據(jù)全國第9次森林資源清查，我國桉樹人工林面積已達(dá)546萬 hm2，占全國人工林總面積6.8%。桉樹是我國重要的工業(yè)用材樹種，其生長和材性性狀是重要的經(jīng)濟(jì)性狀，直接影響人工林產(chǎn)量及紙漿產(chǎn)量和質(zhì)量，對于桉樹生長和材性的遺傳改良一直備受育種者重視。在桉樹中，對巨桉(E.grandis)已完成全基因組測序[4]。同時(shí)，研究者在多個(gè)桉樹群體的種源、家系及無性系間進(jìn)行了生長及材性性狀遺傳分析，但不同群體的分析結(jié)果不盡相同[5-8]。目前為止，對于桉樹中許多重要經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳基礎(chǔ)及調(diào)控機(jī)理都知之甚少。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)是指基因組水平上由單個(gè)核苷酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性[9]。SNP具有分布密度高、遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)、易于高通量檢測和分型的特點(diǎn)[10]。利用SNP標(biāo)記研究桉樹復(fù)雜性狀遺傳變異規(guī)律，對于揭示桉樹重要性狀的分子調(diào)控機(jī)制具有重要意義。關(guān)聯(lián)分析是進(jìn)行復(fù)雜性狀解析的一種有力工具，利用關(guān)聯(lián)分析可獲得與目標(biāo)性狀緊密相關(guān)的分子標(biāo)記或候選基因[11]。目前，利用關(guān)聯(lián)分析已在桉樹生長[12-13]、材性[14-16]、抗病性[17-18]等方面開展研究，挖掘了一些與生長和材性相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)和候選基因。但林木的生長與木材的形成受復(fù)雜多層次網(wǎng)絡(luò)調(diào)控和微效多基因控制，可能有大量的基因參與其中[19]，仍需加大力度開展桉樹重要經(jīng)濟(jì)性狀候選基因的發(fā)掘。

尾葉桉(E.urophylla)和細(xì)葉桉(E.tereticornis)雜種具有生長迅速、抗風(fēng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高的特點(diǎn)，在華南沿海地區(qū)廣泛種植[20]。本研究以尾細(xì)桉F1全同胞子代試驗(yàn)林為研究對象，對各F1子代的樹高、胸徑和木材基本密度進(jìn)行測定及表型遺傳分析；篩選這3個(gè)性狀的極端表型個(gè)體，利用測序分型(genotyping by sequencing, GBS)方法開發(fā)SNP位點(diǎn)；通過關(guān)聯(lián)分析挖掘與尾細(xì)桉生長和木材基本密度顯著相關(guān)的位點(diǎn)，為桉樹分子標(biāo)記輔助育種選擇提供標(biāo)記資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料

研究群體包含320個(gè)尾細(xì)桉F1子代，來源于母本尾葉桉(x-30)和父本細(xì)葉桉(13443-05)的雜交子代扦插后營建的無性系試驗(yàn)林[21]。試驗(yàn)林位于廣東省鶴山市共和鎮(zhèn)，于2006年6月造林，采用隨機(jī)完全區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)無性系設(shè)置4次重復(fù)，單株小區(qū)，株行距為2 m×3 m。

1.2 表型性狀分析

2014年1月對試驗(yàn)林全部植株進(jìn)行表型測定。樹高和胸徑測量分別使用超聲波測高儀(VertexIII,瑞典)和測樹胸徑尺測定。木材基本密度通過生長錐法鉆取樹木1.3 m處南北向的木芯，參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 1933—2009以排水法測定。性狀統(tǒng)計(jì)及相關(guān)性分析利用SAS V6.3。

1.3 極端表型個(gè)體選擇

在試驗(yàn)林320個(gè)F1子代中篩選樹高(height,H)、胸徑(diameter,D)和木材基本密度(basic density,ρ)的極高和極低表型各6個(gè)開展關(guān)聯(lián)分析。由于表型性狀間的極端個(gè)體有部分重疊，最終共選擇了21個(gè)個(gè)體。極端表型個(gè)體與群體間的差異顯著性采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采集極端表型個(gè)體樹干中部、南向的健康葉片，以塑封袋密封后于干冰中臨時(shí)保存，之后保存于-80 ℃冰箱用于DNA提取。

1.4 GBS文庫構(gòu)建及SNP標(biāo)記開發(fā)

DNA提取采用改良CTAB法[22]，GBS文庫構(gòu)建主要參照Poland等[23]的建庫流程，QubitTM3.0測定文庫濃度后使用微流控毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(LabChip GX Touch 24,美國)檢測文庫質(zhì)量。雙端測序(PE 150)由北京貝瑞基因的高通量測序平臺(tái)Illumina HiSeq 2500完成。

SNP開發(fā)主要流程為：采用Stacks V2.5[24]進(jìn)行下機(jī)數(shù)據(jù)的拆分并過濾低質(zhì)量序列，利用Bowtie2 V2.2.2.9[25]將過濾后的序列比對到巨桉參考基因組(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)。利用GATK V3.8[26]開發(fā)SNP后通過VCFtools V0.1.13[27]進(jìn)行過濾，SNP過濾標(biāo)準(zhǔn)為：SNP支持的reads數(shù)目4條以上，數(shù)據(jù)缺失率小于30%，次要等位基因頻率(MAF)>0.05。剔除缺失率大于50%的位點(diǎn)，保留高質(zhì)量的SNP。

1.5 標(biāo)記-性狀關(guān)聯(lián)分析及候選基因定位

采用單因素方差分析法[28]開展關(guān)聯(lián)分析，以P<0.001為閾值篩選與目標(biāo)性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP，并根據(jù)Bonferroni(α=0.05)多重檢驗(yàn)校正后的閾值確定極顯著關(guān)聯(lián)SNP。利用巨桉參考基因組信息定位關(guān)聯(lián)SNP的候選基因，利用Blast2GO[29]進(jìn)行候選基因功能注釋與分類。根據(jù)基因注釋信息，以及結(jié)合相應(yīng)文獻(xiàn)報(bào)道，初步了解候選基因的基本生物學(xué)功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 尾細(xì)桉F1代的表型分析

研究群體中尾細(xì)桉F1子代的樹高、胸徑和木材基本密度均呈現(xiàn)連續(xù)分布(圖1)，且偏度、峰度較小(表1)，表型值近似符合正態(tài)分布。其中樹高和木材基本密度的偏度均接近-1，整體分布偏向高值，表明該試驗(yàn)林長勢優(yōu)，樹高及木材基本密度呈中上水平的子代居多。所選樹高、胸徑、木材基本密度的極端個(gè)體與群體間的差異均顯著(P<0.001)。樹高、胸徑的變異系數(shù)分別為17.38%和26.19%，而木材基本密度僅為7.51%，表明生長性狀比木材密度的遺傳變異大。

圖1 尾細(xì)桉試驗(yàn)林的生長性狀和木材密度分布及所選極端表型個(gè)體

表1 試驗(yàn)群體表型數(shù)據(jù)參數(shù)

2.2 尾細(xì)桉生長性狀與木材密度相關(guān)性分析

生長性狀與木材基本密度間均呈顯著正相關(guān)(P<0.01)(表2)。其中，樹高與胸徑間的相關(guān)性最高，為0.792；樹高與木材基本密度次之，為0.559；而木材基本密度與胸徑間的相關(guān)性最低，為0.480。表明生長性狀之間的相關(guān)性高于生長性狀與木材材性間的相關(guān)性。

表2 生長性狀與木材基本密度相關(guān)性

2.3 GBS測序質(zhì)量及SNP開發(fā)

通過高通量測序，在21個(gè)尾細(xì)桉極端表型個(gè)體中獲得的原始序列數(shù)為5 568 416～14 002 206，經(jīng)過濾低質(zhì)量的序列后，得到的高質(zhì)量序列數(shù)為4 966 451～12 404 893(表3)。質(zhì)控后，高質(zhì)量序列的Q30值介于85.6%～92.3%，平均GC含量為41.6%，與巨桉參考基因組的比對率為96.2%～97.8%，表明測序質(zhì)量較高。過濾低質(zhì)量位點(diǎn)后，最終保留15 185個(gè)高質(zhì)量SNP用于后續(xù)分析。

表3 各樣品的GBS測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.4 SNP標(biāo)記與表型性狀關(guān)聯(lián)分析

剔除缺失率大于50%的標(biāo)記后，最終用于關(guān)聯(lián)分析的標(biāo)記分別為10 432 (H)、10 849 (D)和10 495 (ρ)個(gè)。關(guān)聯(lián)分析獲得與樹高、胸徑及木材基本密度顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記分別為66、31和22個(gè)(圖2、表4)。通過比較3個(gè)性狀間的關(guān)聯(lián)SNP，在樹高與胸徑間發(fā)現(xiàn)6個(gè)多效性SNP，在樹高與木材基本密度間發(fā)現(xiàn)1個(gè)多效性SNP，在胸徑與木材基本密度間發(fā)現(xiàn)1個(gè)多效性SNP(圖3A)。經(jīng)Bonferroni多重檢驗(yàn)校正，共檢測到3個(gè)SNP與樹高極顯著關(guān)聯(lián)，其中1、5、6號(hào)染色體各分布1個(gè)；13個(gè)與胸徑極顯著關(guān)聯(lián)，其中2號(hào)染色體分布7個(gè)，7號(hào)染色體分布1個(gè)，11號(hào)染色體分布2個(gè)以及3個(gè)未錨定至巨桉參考基因組；3個(gè)與木材基本密度極顯著關(guān)聯(lián)，其中4號(hào)和7號(hào)染色體各分布1個(gè)以及1個(gè)未錨定巨桉參考基因組(表5)。這些位點(diǎn)與目標(biāo)性狀間存在強(qiáng)烈的關(guān)聯(lián)信號(hào)，可能為調(diào)控該性狀的主效位點(diǎn)。

紅線表示Bonferroni(α=0.05)校正的閾值，綠線表示-lg P =3.0的閾值。Red line indicates the Bonferroni-corrected threshold with an experimental type I error rate at α=0.05 and green line represents the threshold of -lg P =3.0.

表4 關(guān)聯(lián)標(biāo)記及候選基因分布情況

圖3 全部關(guān)聯(lián)標(biāo)記(A)及候選基因(B)韋恩圖

表5 各性狀極顯著關(guān)聯(lián)標(biāo)記信息

2.5 候選基因定位及GO功能分類

利用SNP位點(diǎn)的物理位置在巨桉參考基因組上進(jìn)行基因查找，共發(fā)掘候選基因40個(gè)(表4)，其中，樹高28個(gè)，23個(gè)功能已知；胸徑4個(gè)，3個(gè)功能已知；木材基本密度10個(gè)，9個(gè)功能已知。樹高與胸徑、樹高與木材基本密度中各定位到1個(gè)共有的候選基因(圖3B)。GO功能分類主要將生長和木材基本密度的相關(guān)候選基因歸為生物過程、分子功能和細(xì)胞成分3大類的52個(gè)GO terms(圖4)。在生物過程中，候選基因大部分富集在有機(jī)物代謝過程、主要代謝過程、細(xì)胞代謝過程和氮化合物代謝過程。在分子功能中，候選基因主要富集在雜環(huán)化合物結(jié)合和有機(jī)環(huán)化合物結(jié)合。在細(xì)胞組成中，候選基因主要位于細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器和膜固有成分。

圖4 候選基因GO功能分類

3 討 論

關(guān)聯(lián)分析可以在群體水平上分析性狀變異，準(zhǔn)確定位與目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)的基因或基因片段[30]。早先在赤桉(E.camaldulensis)[12]、藍(lán)桉(E.globulus)[15]、大花序桉(E.cloeziana)[16]和檸檬桉(C.citriodora)[17]等桉樹中開展的關(guān)聯(lián)研究多使用直接來源于天然群體的種質(zhì)資源。這些種質(zhì)資源中富含大量的等位變異，有利于提高關(guān)聯(lián)位點(diǎn)和基因地檢測，然而不足之處在于天然群體中復(fù)雜的群體結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系會(huì)影響檢測結(jié)果。盡管可以通過一些統(tǒng)計(jì)模型解決部分問題[31]，但更重要的是在未馴化的天然群體中獲得的關(guān)聯(lián)標(biāo)記還需要面臨如何轉(zhuǎn)化為有用育種信息的難題。而在人工選育的優(yōu)質(zhì)育種群體中獲得的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，可以更直接有效地應(yīng)用于實(shí)際的育種工作中[32]?；谠摾碚摶A(chǔ)，最近兩個(gè)研究報(bào)道了經(jīng)人工選育后的桉樹雜種育種群體的關(guān)聯(lián)分析[13,18]。與先前的研究[13, 18]相比，盡管本研究也使用了人工構(gòu)建的尾細(xì)桉雜種群體，但筆者重點(diǎn)關(guān)注了其中一些具有極端表型的個(gè)體。通過對極端表型個(gè)體進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，在生長和木材密度中共獲得111個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記，進(jìn)一步豐富了桉樹現(xiàn)有的基因組資源。同時(shí)也表明，基于人工育種群體的極端表型個(gè)體篩選相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)位點(diǎn)是一種快速、經(jīng)濟(jì)和有效的策略。但值得注意的是，這種策略可能降低了對于生長和木材形成中具有微效作用的基因位點(diǎn)的檢測能力，為保證關(guān)聯(lián)分析的檢測效力和精度，應(yīng)提高檢測樣本的數(shù)量。此外，關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果還需要驗(yàn)證，如使用不同親本群體、標(biāo)記及相關(guān)的生理生化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等。

基于Bonferroni多重檢驗(yàn)校正方法以確定極顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，3、13和3個(gè)SNP分別與樹高、胸徑和木材基本密度極顯著關(guān)聯(lián)，這些SNP所在的區(qū)域可能存在調(diào)控桉樹生長和木材性狀的主效基因位點(diǎn)。其中，在2號(hào)染色體上檢測到了生長性狀(胸徑)的強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)信號(hào)。基于全基因組的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)掃描，先前的研究[13,18]鑒定了桉樹2號(hào)染色體22.0 Mb和36.4 Mb的臨近位置存在生長性狀的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，與本研究的結(jié)果一致。此外，筆者在1、4、5、6、7和11號(hào)染色體的部分區(qū)域也檢測到了與目標(biāo)性狀間的強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)信號(hào)。與以往研究中[33-35]利用QTL定位鑒定的生長和木材密度相關(guān)位點(diǎn)的位置部分一致。桉樹的生長和木材密度均受眾多基因位點(diǎn)調(diào)控，但由于研究群體的遺傳背景不同，以及表型受基因型與環(huán)境的影響等，本研究鑒定的關(guān)聯(lián)區(qū)域與先前研究鑒定的QTL區(qū)域有所差異。另一方面，這些差異的位點(diǎn)可能為本研究在尾細(xì)桉中發(fā)現(xiàn)的與生長和木材密度相關(guān)的新標(biāo)記位點(diǎn)。

通過對關(guān)聯(lián)SNP進(jìn)行注釋初步定位了40個(gè)與生長和木材密度相關(guān)的候選基因，共富集在52個(gè)GO terms?；蚬δ茏⑨尫治霰砻髌涔δ苤饕c植物抗逆性、生物與非生物脅迫、轉(zhuǎn)錄因子家族等相關(guān)。胸徑(Eucgr.C02139)和樹高(Eucgr.L00646)中均發(fā)現(xiàn)與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I (topoisomerase I, TOP I)合成相關(guān)的候選基因。TOP I通過催化DNA鏈的瞬時(shí)斷裂和連接，從而控制DNA的復(fù)制、重組、轉(zhuǎn)錄等過程，在植物整個(gè)生長發(fā)育過程都發(fā)揮重要作用[36-37]。研究顯示，TOP I對于擬南芥(Arabidopsisthaliana)的莖及花中的干細(xì)胞維持十分重要[38]，推測TOP I可能在桉樹中也發(fā)揮著類似的作用。一些與抗逆性相關(guān)的基因可能在尾細(xì)桉的生長和木材形成中發(fā)揮重要作用。如，樹高(Eucgr.F04201)和木材基本密度(Eucgr.G02820)中均發(fā)現(xiàn)與蛋白激酶(protein kinases, PK)合成相關(guān)的候選基因。PK是植物體內(nèi)一類重要的與抗逆相關(guān)的調(diào)節(jié)因子，植物通過膜受體PK感知外界脅迫信號(hào)，從而啟動(dòng)相應(yīng)的生理生化反應(yīng)來抵抗危害[39]。類似功能的還有樹高候選基因Eucgr.G00235，其與葉綠體熱激蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)合成有關(guān)。HSP是植物細(xì)胞受到高溫或其他脅迫時(shí)產(chǎn)生的一類功能性蛋白[40]，其一旦產(chǎn)生，將極大增強(qiáng)植物的抗逆性。在煙草(Nicotianatabacum)[41]和擬南芥[42]中轉(zhuǎn)HSP70基因，可顯著提高其耐熱性和耐旱性?；谏鲜鲅芯浚P者推測與抗逆性相關(guān)的候選基因主要通過調(diào)節(jié)植物的應(yīng)激能力和抵抗能力，進(jìn)而對生長及木材合成造成間接影響。此外，先前的研究表明多效性基因在調(diào)控桉樹生長及材性性狀方面具有重要作用[34]。本研究對樹高、胸徑和木材基本密度分別進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，其中8個(gè)SNP和2個(gè)候選基因可能在調(diào)控生長和材性性狀方面具有多效性作用。盡管這些多效性基因位點(diǎn)的鑒定可能受表型性狀間本身的相關(guān)性，以及在取材上的部分重疊影響。但控制林木數(shù)量性狀的基因普遍存在一因多效現(xiàn)象[43]，多效性基因可能同時(shí)參與不同遺傳調(diào)控，可應(yīng)用于育種中多個(gè)性狀改良，是今后的研究重點(diǎn)。后期將開展QTL精細(xì)定位進(jìn)一步解析尾細(xì)桉生長及材性變異規(guī)律。

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秦鐵崖聽喬十二郎介紹自己是他表姐夫的好朋友，既感到滑稽，也感到溫暖，隨即對老太醫(yī)說：“不用客氣，飲茶清談，也很不錯(cuò)?！?/p>

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