聶小英，朱春曉，鄭東升，陳陽峰，李自強，肖深根*

(1 湖南農業(yè)大學 園藝學院, 長沙 410128；2 湖南天地恒一現(xiàn)代中藥產業(yè)有限公司， 湖南衡陽 421256)

草珊瑚(Sarcandraglabra(Thunb.)Nakai)屬金粟蘭科草珊瑚屬多年生常綠亞灌木,喜陰、忌強光，是林藥間套作優(yōu)選中藥材植物之一，林下郁閉度是影響植物生長發(fā)育的重要環(huán)境因素。研究表明，郁閉度為0.5～0.7的林分可種植喜陰性中藥材[1]。郁閉度的大小直接影響草珊瑚的生長及藥材的品質。草珊瑚適宜在郁閉度為0.5～0.7的環(huán)境生長，在郁閉度低于0.4、高于0.9時則生長不良[2-4]。魏家鴻等[5]報道蔭蔽桐林下間套作草珊瑚綜合效益可觀，且土壤水分涵養(yǎng)能力在6種模式中最強；楊城等[6]發(fā)現(xiàn)60%遮光下的草珊瑚生物量積累最佳；程龍軍等的研究表明草珊瑚具有良好的耐陰性，適當遮光處理可以減緩午休現(xiàn)象，提高其光合效率[7]。

草珊瑚喜陰，是林下套作重要的中藥材植物之一。目前對草珊瑚耐陰特性和林下套作研究大多以光合生理指標而確定其對光照的需求，存在一定的局限性；且前人對草珊瑚的研究多基于單一指標而進行試驗，試驗結果與實際生產存在一定的差距。基于此，該研究從光照環(huán)境出發(fā)，通過人工遮光模擬林下不同郁閉度，測定遮光處理下草珊瑚的光合作用參數，考察草珊瑚的光合作用對光照強度的響應特征，并對各處理葉片解剖結構及葉綠體超微結構進行觀測，從分子水平進一步解釋其對光照的需求和適應性，更加全面、系統(tǒng)地了解真實生長環(huán)境下草珊瑚對光照變化的響應規(guī)律，及其葉片解剖結構及植株形態(tài)的變化特征，探究草珊瑚耐陰性的強弱以及在湖南地區(qū)生長的最適光照條件，進而為草珊瑚人工栽培和林下間套作提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于2020年2-9月份在湖南省湖南天地恒一現(xiàn)代中藥產業(yè)有限公司育苗圃進行。選取2年生草珊瑚實生苗按行株距40 cm × 30 cm移栽，緩苗3個月后選取無病蟲害、長勢基本一致的植株進行相關試驗。

1.2 試驗設計

于2020年5月在苗圃內采用不同遮陽率遮陽網搭建高約1.5 m的遮陽小棚，設置全光照(L0，對照)以及50%(L50)、70%(L70)、90%(L90)的遮光環(huán)境，每個遮光處理間隔1 m。每處理50株，3次重復。期間進行相同田間管理，連續(xù)處理120 d后，進行各項指標的測定。

1.3 指標觀測

1.3.1 光合作用指標測定取草珊瑚植株頂部往下數第3對葉片，每株取4片，采用Li-6400XT便攜式光合作用測定儀測定光合有效輻射(PAR)和光合氣體交換參數凈光合速率(Pn)、蒸騰系數(Tr)、氣孔導度(Gs)和胞間二氧化碳濃度(Ci)[8]，并運用Photosynthesis Assistant3.0軟件按非直角雙曲線修正模型[9]計算光合作用特征參數最大凈光合速(Pnmax)、光補償點(LCP)、光飽和點(LSP)、暗呼吸速率(RD)及表觀量子效率(AQE)，3次重復。

1.3.2 葉片解剖結構觀察摘取頂部往下第3對健康無病蟲害葉片，每處理取4片。切取1 cm×1 cm的小塊，用70%FAA固定液固定24 h后，采用常規(guī)石蠟切片法[10]制片，用Nikon Eclipse E100光學顯微鏡觀察和拍照，每處理取6張切片，每切片取3個視野；同時，采用Image-Pro Plus 6.0軟件測定葉片解剖結構指標：葉片厚度、角質層厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度，并計算柵海比和組織密實度、組織疏松度。其中，(1)柵海比=柵欄組織厚度/海綿組織厚度；(2)組織密實度=柵欄組織厚度/葉片厚度；(3)組織疏松度=海綿組織厚度/葉片厚度。

1.3.3 葉綠體超微結構觀察每處理取頂部往下第3對健康無病蟲害葉片，每處理取4片，在葉脈兩側各取1 mm × 1 mm的方形小塊。用濃度2.5%戊二醛和1%鋨酸進行雙固定，固定后用pH 7.4磷酸緩沖液進行漂洗，再用不同濃度乙醇和丙酮溶液依次脫水，然后用不同比例丙酮和包埋劑滲透環(huán)氧樹脂包埋[11]，最后用LeicaUC7超薄切片機切片，于HT7800型透射電子顯微鏡下觀察拍照。

1.4 數據整理與分析

采用Excel進行數據整理與計算，采用SPSS 22.0進行數據方差分析，用Duncan法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 遮光對草珊瑚葉片表面光照強度和光合氣體交換參數的影響

2.1.1 葉片表面光合有效輻射日變化特征各遮光處理的草珊瑚葉片表面光合有效輻射(PAR)日變化曲線均呈現(xiàn)出先增后減的單峰型(圖1)，并均在12:00達到最大峰值；同期各遮光處理的PAR始終表現(xiàn)為L0>L50> L70> L90，且其日均值在各處理組間均差異顯著(表1)；同時，PAR的日變化幅度在全光照下最大，并隨著遮光程度的增加而逐漸減小。可見，各遮光處理達到了較好的調整光照強度的效果。

2.1.2 光合氣體交換參數日變化特征草珊瑚光合氣體交換參數的日變化曲線在各遮光處理間均相似(圖2)。其中，草珊瑚凈光合速率(Pn)日變化在各遮光處理下均呈雙峰型變化趨勢(圖2，A)，分別在10:00和14:00出現(xiàn)峰值，且在‘午休’時(12:00)出現(xiàn)谷值，在14:00達到最大值，14:00后急劇下降；與L0相比，遮光處理下‘午休’現(xiàn)象得到一定程度的減緩；草珊瑚Pn日均值表現(xiàn)為L70>L50> L90> L0(表1)，且各處理組間均差異顯著(P<0.05)。草珊瑚葉片的胞間二氧化碳濃度(Ci)日變化在各遮光處理下均呈先降后升再降再升的變化趨勢，8:00至10:00呈緩慢下降，10:00后略微上升，中午12:00后逐漸下降， 14:00后快速上升至最大值(圖2，B)；各遮光處理的Ci表現(xiàn)為L0>L90> L50> L70，且前兩者與后兩者間差異顯著；葉片在14:00前維持較高的Pn，CO2利用率較高，導致其相應的Ci下降(表1)。草珊瑚氣孔導度(Gs)和蒸騰速率(Tr)在各遮光處理下均呈單峰型日變化曲線(圖2，C、D)，并均在全光照下變化幅度最大，且均于12:00達到最大值；Gs和Tr日均值都表現(xiàn)為L0>L50> L70> L90，與相應Pn的表現(xiàn)一致，且L0顯著高于各遮光處理(P<0.05)，L50和L70處理又顯著高于L90處理，但L50和L70處理間差異不顯著(表1)。以上結果說明遮光處理顯著降低了草珊瑚葉面光合有效輻射和氣孔導度、蒸騰速率，減緩了光合‘午休’程度，顯著提高了凈光合速率，并以遮光70%處理效果較佳。

表1 不同遮光處理下草珊瑚葉片光合氣體交換參數日均值

L0、L50、L70、L90分別表示全光照及50%、70%和90%的遮光處理，下同圖1 不同遮光處理葉面光合有效輻射日變化L0，L50，L70，L90 stand for 0, 50%, 70% and 90% shading treatments, respectively; the same as belowFig.1 Diurnal variation of photosynthetically active radiation under different shading treatments

圖2 不同遮光處理草珊瑚葉片光合氣體交換參數日變化Fig.2 Diurnal variation curves of photosynthetic gas exchange parameters in leaves of S. glabra under different shading treatments

2.1.3 光響應曲線各遮光處理草珊瑚光響應曲線(圖3)的變化趨勢基本一致，隨著環(huán)境光照強度的增加，凈光合速率先迅速增加，達到最大值后稍有下降并基本保持穩(wěn)定。其中，在各光照強度下，各遮光處理草珊瑚的凈光合速率均比全光照處理不同程度提高，并始終表現(xiàn)為L70>L50> L90> L0，且L70和L50處理明顯高于L0，而L90處理與L0較接近。

圖3 不同遮光處理下草珊瑚光響應曲線Fig.3 Light response curves of S. glabra under different shading treatments

同時，依據光響應曲線計算的光合特征參數(表2)顯示，草珊瑚最大凈光合速率(Pnmax)在遮光處理下均比L0處理不同程度提高，且L70和L50處理的增幅均達到顯著水平，并以L70處理最高且顯著高于其他處理(P<0.05)；草珊瑚光補償點(LCP)在各遮光處理下均顯著降低，且有隨著遮光率的增加而下降的趨勢，并以L70和L50處理較大，且顯著高于L90處理；光補償點(LSP)在L50和L70處理下比L0處理顯著增加，而在L90處理下比L0處理顯著降低，但L50和L70處理間無顯著差異；草珊瑚暗呼吸速率(Rd)與LSP的表現(xiàn)相似，在L50和L70處理下顯著高于L0處理，在L90處理下稍低于L0處理，而L50與L70處理之間無顯著差異；草珊瑚表觀量子效率(AQE)在遮光處理下均顯著升高，并有隨遮光率的增加而逐漸上升的趨勢，并以L90處理最大且與其他處理組差異顯著(P<0.05)。以上結果說明適當遮光處理降低了草珊瑚葉片的光補償點，提高了葉片光飽和點和表觀量子效率，顯著提高了葉片最大凈光合速率，并以70%遮光處理效果最佳。

表2 不同遮光處理下草珊瑚光合特征參數

2.2 遮光對草珊瑚葉片解剖結構的影響

2.2.1 葉表皮特征各遮光處理草珊瑚葉片解剖結構和觀測結果(圖4，表3)顯示，隨著遮光率的增加，葉片厚度先增后減，且L50和L70處理增幅達到顯著水平，L70處理稍有降低；角質層厚度逐漸變薄，且各遮光處理降幅均達到顯著水平，但遮光處理間無顯著差異；上下表皮均由1層細胞構成，上表皮細胞呈橢圓形或近長方形，排列緊密，下表皮細胞呈不規(guī)則形狀緊密排列，上下表皮厚度在各遮光處理下均不同程度增加，但僅L70處理增幅達到顯著水平。草珊瑚葉片厚度、上下表皮厚度均在L70處理下達到最大值。

2.2.2 葉肉結構特征遮光處理使草珊瑚葉肉組織結構發(fā)生明顯變化(圖4)。其中，在L0處理下，柵欄組織由1層細胞組成，細胞呈橢圓形或長橢圓形，排列整齊，有一定細胞間隙，細胞較短；海綿組織分布疏散、細胞間隙大、呈不規(guī)則排列；葉肉細胞內葉綠體數量較少。在L50和L70處理下，柵欄組織均由2層細胞組成，細胞呈橢圓形或近方形，第1層排列整齊，具一定細胞間隙，第2層部分細胞消失；海綿組織呈長橢圓形或橢圓形，不規(guī)整排列，在整體葉肉結構中占比最大；兩者葉肉細胞中的葉綠體數量明顯增加。在L90處理下，柵欄組織由2層細胞組成，但下層部分細胞消失，細胞變短，呈橢圓形，具一定細胞間隙；海綿組織呈不規(guī)則疏松排列，細胞間隙大。

同時，表3顯示，隨著遮光率的增加，各處理柵欄組織和海綿組織的厚度先增加后降低，且均不同程度地高于L0處理；柵欄組織和海綿組織厚度在L50與L70處理間均差異不顯著(P>0.05)，但兩者均顯著大于L0和L90處理，L90處理柵欄組織厚度也與L0處理差異顯著(P<0.05)。柵欄組織厚度/海綿組織厚度(柵海比)、組織密實度均隨著遮光強度增加呈先增后減的變化趨勢，并均以L70處理最大，且各遮光處理均顯著高于全光照(L0)處理，而各遮光處理間均差異不顯著(P>0.05)；組織疏松度全光照與各遮光處理之間均差異不顯著(P>0.05)。

表3 不同遮光處理下草珊瑚葉片解剖結構指標

2.2.3 葉片葉綠體超微結構在全光照(L0)條件下，草珊瑚葉肉細胞結構完好，未出現(xiàn)質壁分離現(xiàn)象(圖5，A)。同時，葉綠體細長，部分葉綠體膜破裂，出現(xiàn)解體現(xiàn)象，葉綠體內含有1～2個淀粉粒，部分淀粉粒出現(xiàn)空洞現(xiàn)象；基粒類囊體變形，片層減少、空隙大，基質類囊體變形嚴重，排列散亂；在葉綠體內分布少量嗜鋨顆粒，線粒體結構完整，呈圓球形，單個或數個聚集分布在葉綠體細胞上(圖5，B)。在L50處理下，葉肉細胞和葉綠體結構完整，葉綠體呈橢圓形或紡錘型緊密分布在細胞內壁；少數葉綠體含有淀粉粒，淀粉粒體積小；基粒類囊體片層排列規(guī)整，基質類囊體排列緊密，葉綠體上分布有較多的嗜鋨顆粒。在L70處理下，葉肉細胞和葉綠體結構完整；葉綠體多呈紡錘型，緊密分布在細胞內壁，葉綠體內出現(xiàn)1～3個淀粉粒，淀粉粒體積較?。换ｎ惸殷w和基質類囊體排列緊密，垛疊規(guī)整；在葉綠體內分布少量嗜鋨顆粒，線粒體單個或數個聚集分布在葉綠體內。在L4處理下，葉肉細胞結構完整，葉綠體呈長圓形緊密分布在細胞內壁，結構受到輕微破壞；葉綠體內淀粉粒較少，且體積較??；基粒類囊體片層排列規(guī)整，部分基質類囊體片層排列松散；在葉綠體上分布少量的嗜鋨顆粒(圖5，A、B)。

UE.上表皮；LE.下表皮；PT.柵欄組織；ST.海綿組織；Ch.葉綠體圖4 不同遮光處理下草珊瑚葉片解剖結構UE. Upper epidermis; LE. Lower epidermis; PT. Palisade tissue; ST. Spongy tissue; Ch. ChloroplastFig.4 Anatomical structure of Sarcandra glabra leaves under different shading treatments

Ch.葉綠體；CM.細胞膜；CW.細胞壁；Mi.線粒體；GL.基粒片層，SL.基質片層；OG.嗜鋨顆粒圖5 不同遮光處理下草珊瑚葉肉細胞結構(A)和葉綠體超微結構(B)Ch. Chloroplast; CM. Cell membrane; CW. Cell wall; Mi. Mitochondrion; GL. Grana lamellae; SL. Stromal lamellae; OG. Osmiophilic granulesFig.5 Mesophyll cell structure (A) and chloroplast ultrastructure (B) of S. glabra leaves under different shading treatments

2.3 遮光對草珊瑚植株生長的影響

草珊瑚喜陰，忌強光，遮光減小了太陽輻射強度，提高了葉片光合效率，導致其植株生長形態(tài)發(fā)生顯著變化(表4)。其中，草珊瑚株高、地徑、葉面積及生物量均隨著遮光率的增加而先增后減，且各遮光處理均不同程度地高于全光照處理(L0)；各生長指標在L50和L70處理下均顯著高于L0和L90處理，并以L70處理最高，其除地徑以外的指標也顯著高于L50處理。以上說明全光照和重度遮光處理對草珊瑚的生長產生嚴重的脅迫，適度遮光能顯著促進草珊瑚植株的生長。

表4 不同遮光處理草珊瑚生長指標

3 討 論

光照是影響植物生長發(fā)育和進行光合作用最直接的環(huán)境因素之一[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，遮光處理對草珊瑚的光合效率有顯著影響。全光照和遮光處理的草珊瑚葉片Pn日變化均呈雙峰變化，分別于10:00和14:00出現(xiàn)峰值；遮光處理下，草珊瑚葉片具有較低的Ci、Gs、Tr，維持較高的Pn；70%遮光并未對草珊瑚的生長產生抑制作用，但全光照和90%重度遮光對草珊瑚的生長產生明顯的抑制作用。從而說明草珊瑚具有一定的光可塑性。同時，不同處理草珊瑚的光響應曲線差異顯著。50%和70%遮光處理草珊瑚葉片LCP顯著低于全光照處理，而其LSP和AQE則高于全光照處理，同時遮光處理下葉片能維持較高的Pn?？梢?，全光照下過剩的強光對草珊瑚產生光抑制，而遮光處理顯著提高了葉片光合能力，說明草珊瑚具有一定的耐陰性和喜陰性，這與前人的研究結果基本一致[6-7]。

同時，葉片作為進行光合作用的植物器官，外界光照的變化勢必會影響葉片形態(tài)、表皮、柵欄組織和海綿組織厚度及細胞形態(tài)，進而影響其光合特征。研究表明，表皮厚度減小、柵欄組織和海綿組織發(fā)達是葉片適應弱光的一種生理特性[14-15]；而近方形的柵欄細胞可提高軸面和側面的葉綠體分布密度，海綿組織厚度的相對增加，排列疏松，有利于提高葉片對光能的利用率[13]。本研究結果表明，隨著遮光率的增加，草珊瑚葉片表皮細胞厚度在整個葉肉結構占比減小，柵欄組織和海綿組織發(fā)達，柵欄組織細胞長度逐漸變短，排列變得疏松；而海綿組織厚度顯著增加，排列疏松；此外，遮光處理下葉肉細胞中葉綠體數量顯著高于全光照處理，說明草珊瑚葉片的解剖結構受光照強度的影響較大。

另外，已有研究發(fā)現(xiàn)葉片超微結構的變化能極大地影響其光合能力，而葉綠體基粒和基粒片層數目及基粒片層的密集排列有利于增加光合效率[16]。本研究結果表明，在全光照處理下，草珊瑚葉綠體結構出現(xiàn)較嚴重變形，出現(xiàn)解體現(xiàn)象，葉綠體基粒和基質片層顯著減少，垛疊散亂，表明在全光照強度下草珊瑚表現(xiàn)出嚴重的光抑制，嚴重影響了葉肉細胞的正常功能；而在50%和70%遮光處理下，草珊瑚葉肉細胞和葉綠體結構完整，基粒類囊體和基質類囊體片層結構發(fā)達，葉片捕獲光能力增強；但在重度遮光下(90%)，葉綠體變細長，基粒類囊體和基質類囊體片層出現(xiàn)松散，葉片光能捕獲能力下降，這可能與極端弱光條件下，光合有效輻射較低，葉綠體合成受限有關。

綜上所述，草珊瑚在適度(50%和70%)遮光條件下，草珊瑚葉片柵欄組織和海綿組織發(fā)達，柵欄組織細胞長度變短，海綿組織厚度顯著增加，細胞排列疏松，葉綠體數量顯著增加；葉肉細胞和葉綠體結構完整，基粒類囊體和基質類囊體片層結構發(fā)達，葉片捕獲光能力增強；葉片具有較低的蒸騰速率、氣孔導度和胞間二氧化碳濃度，光合‘午休’現(xiàn)象得到有效緩解，具有更高的凈光合速率；株高、地徑、葉面積及生物量顯著增加。草珊瑚具有較強的耐陰性，適度遮光有利于植株生長，全光照或者過度郁閉則會嚴重抑制生長。本研究從葉片解剖結構、葉綠體超微結構、葉片光合特性和植株生長等方面探究了不同遮光處理對草珊瑚生長的影響，證明50%～70%遮光環(huán)境最有利于草珊瑚進行光合作用及光合產物積累和生物量增加，從而顯著促進植株生長。因此，在人工栽培時可適當進行遮光處理，在林下間套作時可優(yōu)選中郁閉度的林分。