余 欣，董 陽(yáng)，劉 靜，農(nóng)慧蘭，鄭 煥，陶建敏

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院， 南京 210095)

葡萄(VitisL.)是一種被廣泛種植的水果作物[1]，可以為人類的日常飲食提供纖維素、維生素和抗氧化劑等豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2]。這些豐富的營(yíng)養(yǎng)成分是葡萄的內(nèi)在品質(zhì)，而葡萄的外在品質(zhì)對(duì)于水果作物葡萄來(lái)說(shuō)也格外重要，果實(shí)形狀就是葡萄重要的外在品質(zhì)之一。多種多樣的葡萄果形，在一定程度上影響了葡萄的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及消費(fèi)選擇[3]。根據(jù)葡萄不同果形特性，將葡萄果粒形狀分為11種：扁圓形(obloid)、圓形(round)、近圓形(nearly round)、橢圓形(broad lipsoid)、長(zhǎng)橢圓形(narrow lipsoid)、卵圓形(ovoid)、倒卵圓形(obovoid)、雞心形(heart-shape)、束腰形(waist shape)、彎形(curved shape)和圓柱形(cylindric)[4]。其中，彎形和束腰形品種屈指可數(shù)[4]，如‘美人指’為束腰形，‘金手指’為彎形[5]；而長(zhǎng)橢圓形、倒卵圓形、扁圓形和雞心形等果形的品種數(shù)量較少，最為常見(jiàn)的是橢圓形[4]。果實(shí)是植物器官之一，而植物器官的形狀主要受單個(gè)細(xì)胞的幾何形狀及其細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)軸的方向控制，所有這些過(guò)程都高度依賴于微管(microtubules, MT)動(dòng)力[6]。

IQ67結(jié)構(gòu)域(IQ67 domain, IQD)蛋白家族是一種古老的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白(calmodulin binding proteins, CaMBPs)，起源于陸地植物的早期進(jìn)化過(guò)程[7]。擬南芥和水稻的IQD基因系統(tǒng)發(fā)育分析表明，主要的IQD基因譜系起源于單子葉和雙子葉植物分化之前[8]。IQD蛋白的顯著特征是具有較高的等電點(diǎn)和絲氨酸殘基頻率[8]，且編碼的IQD蛋白中包含67個(gè)保守氨基酸殘基的植物特異性結(jié)構(gòu)域——IQ67結(jié)構(gòu)域。IQ67結(jié)構(gòu)域的特征是3種不同鈣調(diào)素募集基序(IQ、1-5-10和1-8-14)的獨(dú)特和重復(fù)排列。IQD蛋白家族被認(rèn)為是潛在的控制微管動(dòng)態(tài)性、穩(wěn)定性和組織性的微管相關(guān)網(wǎng)絡(luò)蛋白(microtubule-associated network protein, MAP)家族，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性和植物的發(fā)育起重要作用。微管是細(xì)胞骨架的重要組成部分，微管相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)控制微管的動(dòng)態(tài)性、穩(wěn)定性和組織性以生成各種微管陣列[9-10]，從而使細(xì)胞骨架形成一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的網(wǎng)絡(luò)。微管陣列作為結(jié)構(gòu)支撐附著在質(zhì)膜(plasma membrane, PM)上[11]，并通過(guò)引導(dǎo)纖維素合成酶復(fù)合物(cellulose synthase complex, CSCs)來(lái)確定細(xì)胞擴(kuò)張的方向[12]。微管細(xì)胞骨架還介導(dǎo)了不同物質(zhì)的胞內(nèi)運(yùn)輸[13-14]，并且有助于胞吐作用[15-18]。研究表明，Ca2+信號(hào)的傳導(dǎo)可以激活細(xì)胞骨架組織相關(guān)蛋白鈣調(diào)蛋白/鈣調(diào)蛋白類蛋白(calmodulin/calmodulin-like proteins, CaM/CML)從而調(diào)節(jié)翻譯后的IQD功能[19]。Ca2+-CaM/CML信號(hào)參與了對(duì)細(xì)胞骨架組織的控制過(guò)程[20]。IQD蛋白可以在發(fā)育中的植物組織中根據(jù)環(huán)境變化解析相應(yīng)激素(如生長(zhǎng)素)水平和Ca2+水平變化，從而使微管分支和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，指導(dǎo)細(xì)胞的伸長(zhǎng)和擴(kuò)張，最終驅(qū)動(dòng)器官形狀變化[21]。在葡萄中，通過(guò)研究微管相關(guān)蛋白以解析果形變化分子機(jī)制的相關(guān)研究較少。

迄今為止，已經(jīng)在多個(gè)物種(擬南芥、水稻和番茄等)中鑒定出IQD基因家族，并報(bào)道了IQD基因家族中多個(gè)成員的功能[8, 22-28]。IQD家族基因不僅在果實(shí)等器官形狀的調(diào)控中起作用[29-32]，還在干旱和鹽脅迫等逆境響應(yīng)[26-27]、赤霉素反應(yīng)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)[33]以及通過(guò)脫落酸信號(hào)通路調(diào)節(jié)種子的萌發(fā)[34]中起著重要作用，AtIQD1基因還被報(bào)道可以影響與硫代葡萄糖酸鹽代謝相關(guān)的多個(gè)基因的表達(dá)，起到對(duì)生物攻擊進(jìn)行防御反應(yīng)的作用[35]。據(jù)報(bào)道，在擬南芥和水稻中，IQD家族成員可以與CaM、CML和微管結(jié)合蛋白(KLCR1)及微管相關(guān)蛋白SPIRAL2(SPR2)相互作用，根據(jù)外源生長(zhǎng)素和鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)調(diào)節(jié)微管結(jié)構(gòu)[29, 36-37]。

番茄SUN/SlIQD12是IQ67結(jié)構(gòu)域(IQD)蛋白質(zhì)家族成員[31, 38]。SUN/SlIQD12是控制番茄(Solanumlycopersicum)果實(shí)伸長(zhǎng)的主要基因之一[30]，對(duì)果形的影響比OVATE基因要顯著[39]。張亞光等[3]利用番茄SUN基因，在美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)中查找葡萄基因組中序列相似性最高的同源序列，命名為VvSUN。本研究在前人研究[31-32]基礎(chǔ)上，選擇葡萄IQD基因家族中與葡萄VvSUN基因以及番茄SUN基因具有較高同源性的VvIQD10基因，通過(guò)比較6個(gè)不同葡萄果形品種VvIQD10基因的表達(dá)量推測(cè)該基因可能和葡萄果形相關(guān)，從橢圓形品種葡萄‘天山’中克隆出VvIQD10基因，對(duì)其進(jìn)行序列分析，并利用煙草瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)對(duì)VvIQD10蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，對(duì)VvIQD10蛋白及其靶蛋白鈣調(diào)素類蛋白(VvCML)互作關(guān)系進(jìn)行研究，以期能夠從基因角度解析VvIQD10基因促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)，進(jìn)而導(dǎo)致葡萄果形變化的分子機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料采于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)湯山葡萄試驗(yàn)基地，以束腰形品種葡萄‘美人指’、彎腰形品種葡萄‘金手指’、長(zhǎng)橢圓形品種葡萄‘天山’和‘魏可’、近圓形品種葡萄‘陽(yáng)光玫瑰’和‘紅環(huán)’(圖1)開(kāi)花期花序?yàn)樵囼?yàn)材料，采用平棚架避雨栽培，常規(guī)田間管理，以圓錐花序穗肩頂端小穗上一半的花開(kāi)放為盛花期，分別在盛花期采集小穗，液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆?；煙草為本氏煙草，生長(zhǎng)于22～24 ℃長(zhǎng)日照條件(光照16 h/黑暗8 h)的溫室中。

圖1 不同果形的葡萄品種Fig.1 Grape varieties with different fruit shapes

實(shí)驗(yàn)所需pCAMBIA1302-GFP植物表達(dá)載體、pGBKT7和pGADT7酵母載體、nEYFP和cEYFP雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)(bimolecular fluorescence complementation test, BiFC)載體均為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹(shù)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有保存材料；酵母菌株誘餌菌株Y2H Gold和捕獲菌株Y187購(gòu)自南京酶普利斯生物公司；大腸桿菌DH5α和根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105購(gòu)于上海吐露港生物科技有限公司；中間載體pClone007 Blunt Simple購(gòu)于北京擎科生物科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒和重組克隆試劑盒(ClonExpress?UltraOne Step Cloning Kit)購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；金擔(dān)子素A(AbA)和α-半乳糖苷酶顯色底物(X-α-gal)購(gòu)自翊圣生物科技(上海)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1VvIQD10基因表達(dá)分析利用植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN)分別提取‘美人指’、‘金手指’、‘天山’、‘魏可’、‘陽(yáng)光玫瑰’和‘紅環(huán)’葡萄盛花期花序總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行cDNA合成。以cDNA為模板，使用Beacon Designer 7.0軟件(Premier Biosoft Internaition, USA)設(shè)計(jì)的引物(表1)進(jìn)行熒光定量PCR分析。反應(yīng)體系按SYBR Green PCR Master Mix (TaKaRa)說(shuō)明書進(jìn)行。以VvUbiquitin為內(nèi)參，由ABI 7300 system軟件完成試驗(yàn)程序的操作和數(shù)據(jù)的導(dǎo)出，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析[40]，用Excel 2010和SPPSS 20.0軟件進(jìn)行作圖和顯著性分析。

表1 本研究中的引物序列

1.2.2VvIQD10基因及VvCML基因的克隆在NCBI中查找與番茄SUN(SlIQD12)基因和葡萄VvSUN(VvIQD7)進(jìn)化關(guān)系較近的葡萄基因組IQD家族成員VvIQD10(XM_010647400)序列[31-32]；查找相關(guān)文獻(xiàn)[36]，在NCBI中檢索與水稻基因組IQD家族中SUN同源基因OsIQD14的靶基因OsCaM1(XM_015766855.2)在葡萄中的同源基因VvCML(XM_003632182.3)。用‘天山’葡萄花期花序cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，回收目的條帶，連接到pClone007 Blunt Simple載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α后進(jìn)行鑒定并測(cè)序。

1.2.3VvIQD10基因的生物信息學(xué)分析利用BioXM軟件和ProtParam(https://web.expasy.org/prot param/)在線軟件對(duì)VvIQD10基因所編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行分析；ProtScale(https://web. expasy.org/protscale/)和SignalP 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)分別分析蛋白質(zhì)的疏水性和信號(hào)肽；TMHMM Server v. 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域；SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page= npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https:// swissmodel.expasy.org/)在線軟件分別預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)；Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.xfam.org/)分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；MEGA 10.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；ClustalX軟件比對(duì)不同物種的氨基酸序列。

1.2.4VvIQD10基因的亞細(xì)胞定位分析使用pCAMBIA 1302-GFP植物表達(dá)載體，用DNA連接酶(TaKaRa)連接目的基因和載體，構(gòu)建pCAMBIA 1302-GFP-VvIQD10瞬時(shí)表達(dá)載體。以空載體為陰性對(duì)照，通過(guò)熱擊法將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105中。將PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的菌液過(guò)夜培養(yǎng)至OD600為0.6后收集菌體。用含有10 mmol·L-1MES、10 mmol·L-1MgCl2、100 μmol·L-1乙酰丁香酮(As)的懸浮液重懸菌體至OD600為0.3，室溫避光孵育4 h。選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的4周齡本氏煙草，用無(wú)菌注射器吸取菌液注射，置于25 ℃的環(huán)境中(黑暗48 h/光照12 h)培養(yǎng)60 h，在Zeiss LSM 700激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白信號(hào)分布。

1.2.5 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)根據(jù)重組克隆試劑盒說(shuō)明書，構(gòu)建誘餌載體pGBKT7-VvIQD10/VvCML、獵物載體pGADT7-VvIQD10/VvCML。將重組載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化Y2H Gold和Y187酵母菌株，30 ℃暗培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落生長(zhǎng)狀況，檢測(cè)重組質(zhì)粒對(duì)酵母的毒性作用；觀察Y2H Gold[pGBKT7-VvIQD10/VvCML]在不同濃度(0、50、100、150和200 μL/mL)AbA的SD/-Trp固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行誘餌載體的抗性篩選；將Y2H Gold[pGBKT7-VvIQD10/VvCML]涂布在SD/-Trp、SD/-Trp-Leu、SD/-Trp/X-α-gal、SD/-Trp/X-α-gal/AbA固體培養(yǎng)基上，Y187[pGADT7-VvIQD10/VvCML]涂布在SD/-Leu、SD/-Trp-Leu、SD/-Leu/X-α-gal、SD/-Leu/X-α-gal/AbA固體培養(yǎng)基上，觀察菌落生長(zhǎng)狀況以判斷重組質(zhì)粒是否具有轉(zhuǎn)錄自激活活性。在雙雜交實(shí)驗(yàn)中，將誘餌質(zhì)粒和獵物質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化進(jìn)Y2H Gold酵母菌株，涂布于SD/-Trp-Leu固體培養(yǎng)基，30 ℃暗培養(yǎng)3～5 d。待菌落長(zhǎng)出后，將共轉(zhuǎn)化成功的陽(yáng)性單菌落挑出，加入SD/-Trp-Leu液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)12～15 h，稀釋至OD600為0.2時(shí)再依次稀釋5倍、50倍，取2 μL點(diǎn)到SD/-Trp-Leu-His-Ade、SD/-Trp-Leu-His-Ade/AbA/X-α-gal培養(yǎng)基上，30 ℃暗培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況。

1.2.6 雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)構(gòu)建雙分子熒光瞬時(shí)表達(dá)載體VvIQD10/VvCML-cEYFP和VvIQD10/VvCML-nEYFP。將構(gòu)建好的載體與空載兩兩組合瞬時(shí)侵染煙草表皮細(xì)胞，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化、侵染方法及觀察同VvIQD10基因的亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同葡萄品種的VvIQD10基因PCR分析

以‘美人指’、‘金手指’、‘天山’、‘魏可’、‘紅環(huán)’和‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄盛花期花序cDNA為模板，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。結(jié)果(圖2)顯示，VvIQD10基因在不同果形葡萄品種中均有表達(dá)。果形相對(duì)較長(zhǎng)的‘美人指’、‘金手指’、‘天山’和‘魏可’表達(dá)量較高，近圓形品種‘陽(yáng)光玫瑰’和‘紅環(huán)’的基因表達(dá)量明顯較低。

Sm.陽(yáng)光玫瑰;Rr.紅環(huán);Gf.金手指;Wi.魏可;Ti.天山;Mf.美人指。不同字母表示品種間差異顯著(P<0.05)圖2 不同葡萄品種中VvIQD10基因的表達(dá)Sm. Shine muscat; Rr. Red ring; Gf. Gold finger; Wi. Wink; Ti. Tianshan; Mf. Manicure finger. Different letters mean significant differences in different grape varieties at 0.05 levelFig.2 Expression of VvIQD10 gene in different grape varieties

2.2 葡萄VvIQD10、VvCML基因的克隆和VvIQD10基因序列分析

以‘天山’葡萄為材料，擴(kuò)增出VvCML，片段長(zhǎng)度為450 bp(圖3，A)。進(jìn)一步克隆出了VvIQD10(圖3，B)，測(cè)序并通過(guò)DNAMAN 8.0軟件將得到的序列與預(yù)測(cè)序列(XM_010655617.1)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示CDS區(qū)序列長(zhǎng)度一致，長(zhǎng)度為1 401 bp。起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG(圖4)。與NCBI中相比，第354位、510位、799位、814位核苷酸發(fā)生突變，分別由CAT、AGT、ATC、GAA突變成AAT、GGT、GTC、CAA，前兩者編碼的氨基酸并沒(méi)有發(fā)生變化，而后兩者編碼的氨基酸分別由異亮氨酸、谷氨酸轉(zhuǎn)變成纈氨酸和谷氨酰胺(圖4)。

M.DL2000；1. VvIQD10；2-4. VvCML 圖3 VvCML基因和VvIQD10基因克隆結(jié)果Fig.3 The result of VvCML and VvIQD10 gene cloning

ATG. 起始密碼子；TAG. 終止密碼子；方框內(nèi)為突變位點(diǎn)圖4 VvIQD10基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列ATG. Start codon；TAG. Stop codon；The mutation sites are in the boxFig.4 Nucleotide sequence and amino acid sequence of VvIQD10 gene

2.3 葡萄VvIQD10蛋白分析

VvIQD10基因編碼蛋白質(zhì)由466個(gè)氨基酸組成，其中酸性氨基酸有56個(gè)，堿性氨基酸有85個(gè)。預(yù)測(cè)編碼產(chǎn)物分子量為52.94 kD，等電點(diǎn)為10.64，不穩(wěn)定系數(shù)為80.25，為不穩(wěn)定親水性蛋白。SignalP 4.0預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白無(wú)信號(hào)肽。用TMHMM Server V. 2.0在線軟件對(duì)跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白不具有跨膜區(qū)域。Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，VvIQD10蛋白第136～154、160～174氨基酸位點(diǎn)為IQ基序，第354～428位點(diǎn)為未知功能的DUF4005結(jié)構(gòu)域，第381～426位點(diǎn)和第236～326位點(diǎn)分別為具有類IQ基序的融合蛋白IQCJ-SCHIP1 和NADH泛醌氧化還原酶亞單位NDUFA12。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[3,8]查找分析相關(guān)基序，發(fā)現(xiàn)其具有包含2個(gè)IQ基序、3個(gè)1-5-10基序以及2個(gè)1-8-14基序的IQ67結(jié)構(gòu)域(圖6)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示VvIQD10蛋白由46.78%的α螺旋，50.21%的隨機(jī)卷曲，2.58%的β折疊和0.43%的β轉(zhuǎn)角組成。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示該蛋白由一個(gè)PDB號(hào)為2dfs.1.A的結(jié)構(gòu)為模板建立，序列的相似性為0.3，范圍為134～194 aa，在IQ67結(jié)構(gòu)域所包含的區(qū)域內(nèi)。

圖5 葡萄和其他物種IQD蛋白的氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of amino acid sequences of IQD protein in grape and other species

圖6 VvIQD10基因中IQ67基序分析Fig.6 Analysis of IQ67 motif in VvIQD10 gene

用MEGA 10.0制作進(jìn)化樹(shù)，將VvIQD10蛋白和其他物種的IQD蛋白進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該蛋白與獼猴桃同源蛋白的親緣關(guān)系最近，和擬南芥、豌豆及甜橙等植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖5)。ClustalX比對(duì)分析后得出VvIQD10編碼的氨基酸序列與多種植物的相似度在43.29%～62.34%之間，IQ67結(jié)構(gòu)域在不同物種間較為保守(圖7)。

XP_030962527.1. 大葉櫟；XP_004229688.1. 番茄；XP_035545843.1. 胡桃；XP_017984100.1. 可可；XP_008231519.1. 梅；PSS09955.1. 獼猴桃；NP_196850.1. 擬南芥；KDO83249.1. 甜橙；KAF3653480.1. 甜椒；XP_029125524.1. 木豆；XP_016482094.1. 煙草；XP_015881920.1. 棗；黑色方框內(nèi)為IQ67結(jié)構(gòu)域圖7 葡萄VvIQD10蛋白和其他物種IQD蛋白的氨基酸序列比對(duì)XP_030962527.1. Quercus lobata; XP_004229688.1. Solanum lycopersicum; XP_035545843.1. Juglans regia; XP_017984100.1. Theobroma cacao; XP_008231519.1. Prunus mume; PSS09955.1. Actinidia chinensis var. chinensis; NP_196850.1. Arabidopsis thaliana; KDO83249.1. Citrus sinensis; KAF3653480.1. Capsicum annuum; XP_029125524.1. Cajanus cajan；XP_016482094.1. Nicotiana tabacum; XP_015881920.1. Ziziphus jujuba; In the box is the IQ67 domainFig.7 Amino acid sequence alignment of grape VvIQD10 protein and other IQD proteins

Bar = 35 μm，下同圖8 VvIQD10蛋白在煙草葉片表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位Bar = 35 μm, the same as belowFig.8 Subcellular localization of VvIQD10 protein in tobacco leaf cells

2.4 VvIQD10蛋白亞細(xì)胞定位

為研究VvIQD10蛋白在細(xì)胞中的分布情況，在煙草表皮細(xì)胞中進(jìn)行亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建表達(dá)載體pCAMBIA 1302-GFP-VvIQD10，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草。結(jié)果表明，VvIQD10蛋白在煙草表皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中都有分布，在細(xì)胞中可見(jiàn)微管清晰的絲狀結(jié)構(gòu)。而在以pCAMBIA 1302空載體轉(zhuǎn)化的對(duì)照組中，綠色熒光蛋白在細(xì)胞的各個(gè)部位都有分布(圖8)。由此可初步判定，VvIQD10蛋白主要定位于微管和質(zhì)膜。

2.5 VvIQD10和VvCML蛋白互作驗(yàn)證

為驗(yàn)證VvIQD10基因在植物細(xì)胞中所起的作用，構(gòu)建了誘餌載體pGBKT7-VvIQD10/VvCML、獵物載體pGADT7-VvIQD10/VvCML。將重組載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化酵母菌株后進(jìn)行重組質(zhì)粒的毒性檢測(cè)和自激活檢測(cè)，證明重組誘餌質(zhì)粒和獵物質(zhì)粒均對(duì)酵母沒(méi)有毒性作用，且pGADT7-VvIQD10、pGADT7-VvCML不具有轉(zhuǎn)錄激活活性；為抑制誘餌載體酵母生長(zhǎng)，通過(guò)抗性篩選后選擇150 μL/mL AbA濃度為抑制誘餌載體pGBKT7-VvCML酵母生長(zhǎng)最佳濃度，200 μL/mL AbA濃度為抑制誘餌載體pGBKT7-VvIQD10酵母生長(zhǎng)最佳濃度。雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，誘餌載體和獵物載體共轉(zhuǎn)化的Y2H Gold酵母菌株能在SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基上長(zhǎng)出白色單菌落；Y2H Gold [pGADT7-VvIQD10+pGBKT7-VvCML]、Y2H Gold [pGADT7-VvCML+pGBKT7-VvIQD10]和陽(yáng)性對(duì)照在SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His、SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His/X-a-gal/AbA培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng)，且在SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His/X-a-gal/AbA培養(yǎng)基上長(zhǎng)出藍(lán)色單菌落，而陰性對(duì)照在這兩種培養(yǎng)基上不能夠生長(zhǎng)。說(shuō)明蛋白VvIQD10與蛋白VvCML之間存在互作(圖9)。

2.6 雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)

為驗(yàn)證酵母雙雜交的蛋白質(zhì)互作結(jié)果，構(gòu)建重組載體VvIQD10/VvCML-cEYFP和VvIQD10/VvCML-nEYFP以進(jìn)行雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)。將重組載體和空載體兩兩組合共轉(zhuǎn)化煙草表皮細(xì)胞，利用共聚焦顯微鏡觀察黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein, YFP)熒光圖像，分別在光、明場(chǎng)和融合場(chǎng)中拍攝黃色熒光部位(圖10)。結(jié)果表明，VvIQD10和VvCML蛋白間存在互作，此結(jié)果與酵母雙雜交結(jié)果一致。并且，VvIQD10蛋白和VvCML蛋白主要在微管和質(zhì)膜中互作，這和VvIQD10基因的亞細(xì)胞定位結(jié)果相吻合。

圖10 煙草表皮細(xì)胞中VvCML蛋白與VvIQD10蛋白相互作用的BiFC分析Fig.10 BiFC analysis of the interactions among VvCML protein and VvIQD10 in tobacco epidermal cells

3 討 論

本試驗(yàn)選取和葡萄VvSUN基因以及番茄SUN基因相似性較高的基因VvIQD10，通過(guò)比較6個(gè)不同葡萄果形品種VvIQD10基因的表達(dá)量推測(cè)該基因可能和葡萄果形相關(guān)，并在橢圓形葡萄品種‘天山’中克隆出該序列。與NCBI中預(yù)測(cè)基因相比，克隆出的VvIQD10基因發(fā)生了點(diǎn)突變，但突變位點(diǎn)不在功能結(jié)構(gòu)域內(nèi)，這可能是由于測(cè)序品種和試驗(yàn)品種不同造成的。通過(guò)分析VvIQD10蛋白的理化特性，發(fā)現(xiàn)其具有較高等電點(diǎn)，這和IQD家族蛋白的性質(zhì)相吻合，其具有較高等電點(diǎn)可能是IQD蛋白與微管和質(zhì)膜通過(guò)靜電相互作用所必須具備的條件[29]。對(duì)VvIQD10蛋白的功能域IQ67結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，其所含的基序種類和數(shù)目與VvSUN相同[3]，但基序所包含的部分氨基酸種類發(fā)生了變化，這一變化可能影響蛋白的表達(dá)途徑和作用強(qiáng)度。多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果顯示，在葡萄、獼猴桃、煙草、番茄、甜椒、擬南芥、可可、梅、棗、胡桃和甜橙等十多種植物中，VvIQD10基因與獼猴桃同源基因親緣關(guān)系最近，并且在13種植物中具有相似的保守結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明IQD基因功能是相對(duì)保守的。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果顯示，VvIQD10蛋白同時(shí)定位于微管(MT)和質(zhì)膜(PM)，說(shuō)明此基因編碼的產(chǎn)物不僅在MT上有功能，而且在PM上起作用。前人研究表明，IQD蛋白是植物中PM子結(jié)構(gòu)域的組成部分，它們可能將CaM/CML介導(dǎo)的Ca2+信號(hào)局部限制在PM中的特定位置，并在空間上將功能不同的CaM/CML信號(hào)模塊分開(kāi)[29]。

為進(jìn)一步驗(yàn)證VvIQD10蛋白在微管和質(zhì)膜上的作用，對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)互作實(shí)驗(yàn)。酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)表明，VvIQD10蛋白可以和細(xì)胞骨架組織相關(guān)蛋白VvCML在微管和質(zhì)膜中發(fā)生互作。IQD蛋白可能通過(guò)S-?；饔酶街赑M上，將IQD-CaM/CML復(fù)合物錨定在Ca2+通道入口處來(lái)激活通道。通道被激活后，在通道入口處附近產(chǎn)生陡峭的游離Ca2+濃度梯度，引起Ca2+傳感器蛋白(CaM/CML)的激活。相關(guān)研究推測(cè)，與被激活的IQD信號(hào)復(fù)合物相結(jié)合的蛋白可能是驅(qū)動(dòng)蛋白輕鏈相關(guān)(kinesin light chain-related, KLCR)/纖維素-微管解偶聯(lián)(cellulose-microtubule uncoupling, CMU)蛋白家族的成員[7, 41-42]。KLCR / CMU可以在MT和PM的連接處通過(guò)抵抗MT對(duì)纖維素合酶復(fù)合物(CSCs)的推動(dòng)力來(lái)增加MT的穩(wěn)定性[43]，并可能間接影響纖維素沉積。

由此可以推出，葡萄VvIQD10蛋白在特定的PM子結(jié)構(gòu)域中和鈣調(diào)蛋白類蛋白(CML)結(jié)合，形成VvIQD10-VvCML復(fù)合物，激活Ca2+通道后形成的Ca2+濃度梯度使VvCML被激活。隨后，VvIQD10-VvCML復(fù)合物與微管結(jié)合蛋白結(jié)合(KLCR/CMU)，來(lái)參與對(duì)細(xì)胞骨架組織的控制，從而改變微管分支和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，指導(dǎo)細(xì)胞的伸長(zhǎng)和擴(kuò)張，最終使植物器官形狀發(fā)生變化。根據(jù)前人對(duì)葡萄VvSUN基因超表達(dá)促進(jìn)番茄果形變長(zhǎng)的研究[32]，再根據(jù)本試驗(yàn)中對(duì)與VvSUN基因同一家族中同源性較高的VvIQD10基因功能的研究結(jié)果，推測(cè)VvIQD10可能也在葡萄果實(shí)形狀變化中起著至關(guān)重要的作用，但具體功能還需進(jìn)行超表達(dá)和基因沉默來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。