李雪寶，周 璇，鄢 波

(西南林業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院， 昆明 650224)

纖枝短月蘚(Brachymeniumexile)屬于真蘚科短月蘚屬[1]，能在裸露的巖壁和極端干旱的環(huán)境中生存，具有較強的耐旱能力。研究植物抗旱基因，培育耐旱植物，對改善生態(tài)環(huán)境具有重要意義。

由于非生物脅迫嚴(yán)重限制了植物的生長發(fā)育，一系列防御機制已經(jīng)進化，以提高植物的抗逆性，包括組織結(jié)構(gòu)、化學(xué)物質(zhì)和表達蛋白的反應(yīng)[2-3]。其中，晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白(LEA)是一種高度親水性的蛋白質(zhì)，最早是在棉花胚胎發(fā)育后期的子葉中發(fā)現(xiàn)的[4]，隨后在小麥、甘藍型油菜、番茄、印度芥菜等植物中也發(fā)現(xiàn)LEA蛋白的存在[5-8]，LEA蛋白在植物界具有廣泛的分布。但它并不是植物界所特有的，在細菌、真菌和一些無脊椎動物中也存在LEA蛋白[9-11]。

根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸基序和保守結(jié)構(gòu)特點，LEA蛋白家族的分類存在差異，按照Pfam domain分類法[12]，本研究所用的LEA5蛋白屬于LEA5族(對應(yīng)以往分類法中的D19[13]和group 1[14])，該LEA蛋白一般由80～153個富含甘氨酸的序列組成，其最顯著的特征是含有高度保守的20個氨基酸基元序列[15]。

此外，研究表明大部分的LEA蛋白對干旱、高滲性等各種非生物脅迫具有響應(yīng)機制。例如，小麥TaEm蛋白(LEA5族)可以提高釀酒酵母對高鹽的耐受能力[16]；大麥HVA1蛋白(LEA3族)的過度表達顯著提高了轉(zhuǎn)基因小麥和水稻對干旱脅迫的耐受性[17]；AtLEA4-1d蛋白在芥菜中的過度表達可以顯著增強轉(zhuǎn)基因植物對干旱和鹽脅迫的適應(yīng)性[8]；OsLEA3-2蛋白的過表達可以改善轉(zhuǎn)基因擬南芥和水稻在鹽脅迫和干旱條件下的生長[18]。因此，LEA蛋白在植物非生物脅迫反應(yīng)中的生物學(xué)功能越來越受到重視。

目前，有關(guān)苔蘚植物L(fēng)EA5基因的研究較少。本研究對纖枝短月蘚LEA5基因序列及其啟動子元件進行分析，并對LEA5基因的表達及耐鹽性進行了探究，為進一步探討LEA5基因結(jié)構(gòu)及其耐鹽性之間的關(guān)系提供依據(jù)，也為進一步研究LEA5基因的耐鹽保護機制奠定基礎(chǔ)，為提高植物耐鹽性的分子育種提供了潛在的應(yīng)用前景。

1 材料和方法

1.1 植物材料

纖枝短月蘚采于西南林業(yè)大學(xué)，選取該苔蘚植株的不同發(fā)育時期及不同組織(孢子體部分及配子體部分)，立即用液氮速凍后保存于-80 ℃。

1.2 方 法

1.2.1 纖枝短月蘚LEA5基因ORF的克隆采用OMEGA公司的總RNA提取試劑盒提取纖枝短月蘚的總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(全式金)，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

根據(jù)本課題組已有的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，結(jié)合載體序列設(shè)計同源臂引物L(fēng)EA5-PF(GATGACGATGACAAGATGGCTTCCCGGGAGGAG)和LEA5-PR(AATTCGAAGATCTCGTCACTCGTTTGTAA-ACTTAGAC)。以纖枝短月蘚cDNA第一鏈為模板，進行PCR擴增。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.2.2 纖枝短月蘚LEA5基因啟動子的擴增取新鮮的纖枝短月蘚置于預(yù)冷的研缽中，加入適量的液氮充分研磨，具體操作參照北京天根公司的小量植物(葉)DNA抽提試劑盒說明書。

以纖枝短月蘚DNA為模板，結(jié)合LEA5基因序列設(shè)計啟動子引物L(fēng)EA5-1R(GTACCTTCTGCGAGGTGCTCTTGGGC)、LEA5-2R(ACGATGGACTCCAGTCCGGCCGAAGCCATTCTCGTT-GTGCTC)和LEA5-3R(GATGATCAGAAGATA-AGCAAGTGTAGG)，分別作為第一輪、第二輪、第三輪特異引物， LAD1-1、LAD1-2、LAD1-3、LAD1-4、AC1引物序列及HiTail-PCR擴增程序參照Liu等的研究[19]，第三輪PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，選擇約1 000 bp條帶進行PCR產(chǎn)物回收，PCR產(chǎn)物回收后連接到克隆載體pMD18-T中，送生工生物工程股份有限公司進行測序。

1.2.3LEA5基因的熒光定量分析選擇LEA5基因進行熒光定量PCR分析，根據(jù)獲得的LEA5基因序列，設(shè)計熒光定量引物L(fēng)EA5-QF(CTCGCAGAAGGACGTAGCAAG)和LEA5-QR(CTCATCAATGTCGATGTTCTGC)。以Actin基因為內(nèi)參基因，設(shè)計引物A-F(CTGTACGGCAACATCGTGCTG)和A-R(CCAGACACTGTACTTCCTCTC)，以cDNA為模板，按照TB Green?Premix Ex TaqTM Ⅱ說明書，采用2-ΔΔCt法。

1.2.4 纖枝短月蘚LEA5基因原核表達分析用KpnⅠ和SacⅠ(TaKaRa公司)對pThioHis A載體進行雙酶切。將純化的酶切產(chǎn)物與目的基因進行重組，具體操作參照Vazyme公司的Clon ExpressⅡOne step Cloning Kit的操作說明書，獲得重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒送生工生物工程股份有限公司進行測序。

將構(gòu)建成功的重組表達質(zhì)粒以及空載體分別轉(zhuǎn)化至表達菌株E.coliBL 21 (DE 3)中。誘導(dǎo)表達后進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.5 重組菌耐鹽性分析將重組菌株與對照菌株接種到LB(100 μg/mL Amp)液體培養(yǎng)基中，于37 ℃，220 r/min 過夜培養(yǎng)。次日按照1∶100比例擴大培養(yǎng)至OD600為0.5時，加入終濃度為1 mmol/L IPTG進行誘導(dǎo)表達至OD600為0.8，做10倍梯度稀釋(1∶10；1∶100；1∶1000)。從各稀釋度的菌液取10 μL，點到添加300、500、700 mmol/L NaCl和500、700、900 mmol/L KCl脅迫培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)2 d，每個實驗重復(fù)3次，觀察菌斑生長情況，并拍照保存。

1.2.6 生物信息學(xué)分析利用ExPASy-ProtParam分析氨基酸的理化性質(zhì)；利用NetPhos 3.1 Server軟件預(yù)測磷酸化位點[20]；利用NetOGlyc 1.1 Server軟件預(yù)測O-糖基化位點；利用NetNGlyc 1.0 Server 預(yù)測N-糖基化位點；利用SOPMA軟件進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及分析；利用Swiss-Model通過同源建模建立三級模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖枝短月蘚LEA5基因序列及蛋白的結(jié)構(gòu)分析

轉(zhuǎn)錄組序列分析表明，該基因包含189 bp 5′-UTR和285 bp 3′-UTR，其開放閱讀框為267 bp，編碼88個氨基酸(圖1)。Pfam分析得出，LEA5蛋白在2～61氨基酸位點含有LEA5族結(jié)構(gòu)域。分析表明該蛋白屬于LEA5族。

圖1 纖枝短月蘚LEA5基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide acids and deduced amino acids sequences of LEA5 gene from B. exile

利用protparam預(yù)測LEA5基因所編碼的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為9 157.81 Da，理論等電點4.72，分子式C377H608N120O142S2，LEA5基因所編碼蛋白的氨基酸組成中，Gly含量最高，占總氨基酸的15.9%；其次為Ala和Glu，均占總氨基酸的13.6%。脂肪系數(shù)為51.25，平均親水性為-1.011，為親水蛋白；不穩(wěn)定指數(shù)為35.77，屬穩(wěn)定性蛋白。

預(yù)測發(fā)現(xiàn)LEA5蛋白發(fā)生磷酸化修飾的位點共有6個。其中，絲氨酸的磷酸化位點最多，為4個；而蘇氨酸的磷酸化位點和酪氨酸的磷酸化位點各1個。LEA5蛋白沒有發(fā)生N-糖基化的位點，可能發(fā)生O-糖基化的修飾位點有5個。

使用SOPMA軟件預(yù)測LEA5蛋白的二級結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，該蛋白主要由α螺旋(alpha helix)、β轉(zhuǎn)角(beta turn)、無規(guī)則卷曲(random coil)和延伸鏈(extended strand)構(gòu)成，其中α螺旋和無規(guī)則卷曲最多，分別占氨基酸序列的44.32%和38.64%，其次為β轉(zhuǎn)角(12.50%)，延伸鏈最少(4.55%)。通過Swiss-Model對LEA5蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行同源建模，預(yù)測的LEA5蛋白三級結(jié)構(gòu)中有2個α螺旋和3個β折疊。

2.2 纖枝短月蘚LEA5基因啟動子的擴增與分析

以纖枝短月蘚DNA為模板，通過HiTail-PCR擴增LEA5基因啟動子序列，選擇第4泳道約為1 000 bp條帶進行回收(圖2)，最終獲得了LEA5基因啟動子序列1 053 bp。

M. Marker；1-4. 分別與引物L(fēng)AD1-1、LAD1-2、LAD1-3、LAD1-4結(jié)合的HiTail-PCR擴增產(chǎn)物圖2 纖枝短月蘚LEA5基因啟動子HiTail-PCR擴增M. Marker; 1-4. HiTail-PCR production combined with LAD1-1, LAD1-2, LAD1-3 and LAD1-4, respectivelyFig.2 HiTail-PCR production of LEA5 gene promoter from B. exile

啟動子元件分析結(jié)果顯示，LEA5基因啟動子具有典型的CAAT box元件。在LEA5基因啟動子區(qū)含大量非生物脅迫響應(yīng)順式作用元件，主要包括脫落酸響應(yīng)元件(abscisic acid responsive element，ABRE)、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(methyl jasmonate response element，CGTCA-motif)、赤霉素響應(yīng)元件(gibberellin re-sponse element，GARE-motif)以及MYB結(jié)合位點(MYB binding site，MBS)，且含有多個MYB和MYC元件，這2類元件都屬于轉(zhuǎn)錄因子作用元件，與干旱或ABA誘導(dǎo)的表達調(diào)控有關(guān)，此外，還含有G-box、Wbox、TCCC-motif、TCT-motif、TGACG-motif 等元件。

2.3 纖枝短月蘚LEA5基因熒光定量分析

熒光定量結(jié)果顯示，在正常情況下，LEA5基因在纖枝短月蘚的不同時期及不同部位中皆有表達，在纖枝短月蘚無性世代的孢子體中表達量最高，有性世代的配子體次之，無性世代的配子體最低，不同組織的F檢驗非常顯著(P<0.05)，說明正常情況下不同組織的表達量不同。Tukey檢驗可以得出，無性世代的孢子體和無性世代的配子體間表達量差異顯著，有性世代的配子體與其他2個組織間差異不顯著(圖3)。

1.無性世代的孢子體；2.無性世代的配子體；3.有性世代的配子體。不同字母表示組織間差異顯著圖3 纖枝短月蘚不同組織中LEA5基因的表達分析1. Sporophyte of the asexual generation; 2. Gametophyte of the asexual generation; 3. Gametophyte of the sexual generation. Different letters indicate significant difference in different tissues Fig.3 Expression analysis of LEA5 gene in different tissues of B. exile

2.4 纖枝短月蘚LEA5基因原核表達分析

將對照菌(BL21/pThiohis A)和重組菌(BL21/LEA5)在37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.5，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)，其中對照菌誘導(dǎo)6 h，重組菌分別誘導(dǎo)1、2、4和6 h。SDS-PAGE結(jié)果顯示：與對照菌相比，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌在約22 kD處有一條目標(biāo)蛋白表達條帶，并且隨著誘導(dǎo)時間的延長表達量增加，而僅含有空載體的對照菌則在約16 kD處有一條較小的硫氧還蛋白(為pThiohis A載體中的蛋白)表達條帶 (圖4)。

M. Marker；1.誘導(dǎo)6 h的BL21/pThiohis A；2-5為分別誘導(dǎo)1、2、4、6 h的BL21/LEA5圖4 BL21/pThiohis A和BL21/LEA5的原核表達M. Marker; 1. BL21/pThiohis A induced for 6 h; 2-5. BL21/LEA5 induced for 1, 2, 4 and 6 h, respectivelyFig.4 Prokaryotic expression of BL21/pThiohis A and BL21/LEA5

2.5 重組菌耐鹽性分析

為檢驗LEA5蛋白的重組菌對高鹽的耐受性，首先確定合適的鹽(NaCl或KCl)脅迫濃度。將空載體對照菌(BL21/pThiohis A)和重組菌(BL21/LEA5)進行IPTG誘導(dǎo)。再將等份的相同細胞密度的菌液分別涂布在添加外源NaCl(300、500和700 mmol/L)和KCl(500、700和900 mmol/L)的培養(yǎng)基上。結(jié)果顯示，當(dāng)稀釋1 000倍時，BL21/pThiohis A和BL21/LEA5在300 mmol/L NaCl培養(yǎng)基平皿上菌斑數(shù)目超過1 000，二者的生長情況無明顯差別；在500 mmol/L NaCl培養(yǎng)基上，BL21/pThiohis A和BL21/LEA5的菌斑數(shù)目為10～600，二者的生長情況差別較??；在700 mmol/L NaCl培養(yǎng)基上，BL21/pThiohis A和BL21/LEA5菌斑數(shù)目為0～150，BL21/LEA5菌斑數(shù)目明顯多于BL21/pThiohis A。在700 mmol/L KCl脅迫下，BL21/pThiohis A和BL21/LEA5表現(xiàn)出與500 mmol/L NaCl相似的生長情況(表1)。因此，選擇500 mmol/L NaCl和700 mmol/L KCl作為脅迫培養(yǎng)基的鹽濃度。

表1 BL21/pThioHis A和BL21/LEA5在鹽脅迫條件下的菌斑數(shù)目

將BL21/pThiohis A和BL21/LEA5進行IPTG誘導(dǎo)，按0、10、100和1 000倍進行稀釋，將等份的菌液分別點在普通培養(yǎng)基和鹽脅迫(500 mmol/L NaCl和700 mmol/L KCl)培養(yǎng)基上，2 d后觀察平板上菌斑生長情況。結(jié)果顯示，在普通培養(yǎng)基上，不同稀釋倍數(shù)的BL21/pThiohis A和BL21/LEA5的菌斑數(shù)相近。在含500 mmol/L NaCl的培養(yǎng)基上，未稀釋和稀釋10倍的BL21/pThiohis A和BL21/LEA5菌斑數(shù)目較多，二者生長情況無明顯差別；在菌液稀釋100倍和1 000倍時，BL21/pThiohis A和BL21/LEA5菌斑數(shù)目差異較大， BL21/LEA5菌斑數(shù)目明顯多BL21/pThiohis A。在700 mmol/L KCl的培養(yǎng)基上，BL21/pThiohis A和BL21/LEA5表現(xiàn)出與500 mmol/L NaCl類似的生長情況。由此可知，LEA5蛋白的表達使大腸桿菌獲得了對高鹽(500 mmol/L NaCl和700 mmol/L KCl)的耐受能力(圖5)。

圖5 BL21/LEA5和BL21/pThioHis A在普通和鹽脅迫下的生長情況Fig.5 Growth situation of BL21/LEA5 and BL21/pThiohis A under normal and salt stress

3 討 論

順式作用元件是重要的分子開關(guān)，有助于了解基因表達調(diào)控信息。研究表明多數(shù)LEA家族基因啟動子具有大量與非生物脅迫的調(diào)控有關(guān)的元件[21]。ABA在植物逆境脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮著信號分子的作用，ABRE元件是響應(yīng)ABA的主要順式作用元件，MYC和MYB與ABA誘導(dǎo)基因的表達調(diào)控有關(guān)[22-23]。本研究中LEA5基因啟動子含有ABRE、MYC和 MYB等順式作用元件，表明LEA5基因在植物逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。同時，LEA5啟動子區(qū)還含有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(CGTCA-motif)，推測LEA5基因可能對茉莉酸甲酯具有響應(yīng)機制。此外，LEA5基因啟動子含有MYB結(jié)合位點(MYB binding site，MBS)、TGACG-motif、W-box等元件，W-box是WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合元件，而WRKY是植物參與各種生物與非生物脅迫應(yīng)答的主要轉(zhuǎn)錄因子[24]。這些都表明，LEA5基因在纖枝短月蘚的抗逆性中起著非常重要的作用，有深入研究的價值。

熒光定量結(jié)果顯示，LEA5基因在不同時期及不同部位中皆有表達，且在無性世代的孢子體中表達量最高，有性世代的配子體次之，無性世代的配子體最低，揭示LEA5基因可能在無性世代孢子體的生長發(fā)育過程中起重要作用，其具體的機制還需進一步探究。

高鹽脅迫引起細胞脫水，損傷細胞內(nèi)的蛋白和細胞膜。大量研究表明LEA基因的表達能夠提高植物的耐鹽性，有研究者將大豆的PM11、PM30、PM2基因分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，重組菌在高鹽脅迫下的存活率均明顯提高[25-26]；還有研究表明SmLEA、SmLEA2基因的過表達提高了大腸桿菌對鹽脅迫的耐受性[27-28]。本研究結(jié)果顯示，重組菌(BL21/LEA5)的耐鹽性高于對照菌(BL21/pThioHis A)，說明LEA5基因提高了大腸桿菌的耐鹽功能，這與前人的研究結(jié)果一致。

綜上所述，纖枝短月蘚LEA5基因啟動子區(qū)域含有與非生物脅迫的調(diào)控有關(guān)的順式作用元件，且在纖枝短月蘚不同時期及不同部位均有表達，LEA5基因的異源表達提高了大腸桿菌的耐鹽性，可見LEA5基因在纖枝短月蘚抗逆性中發(fā)揮重要功能。LEA5基因作為一個普遍存在于植物中的抗逆基因，與植物的抗逆性密不可分，將外源LEA5基因轉(zhuǎn)入常見的植物中，培育具有抗旱、耐鹽堿等逆境的植物新品種，這對實際的生產(chǎn)具有重要意義。