樊曉旭，張皓博，劉蒙達，遲慶安，2，亓 菲，3，劉婷婷，孫淑芳，范偉興

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，國家動物結(jié)核病參考實驗室，山東青島 266032；2.海南省動物疫病預(yù)防控制中心，海南?？?571100；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109）

傳統(tǒng)ELISA方法的基本原理是將抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。將抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留了免疫活性，又保留了酶的活性。當(dāng)受檢物質(zhì)與酶標(biāo)抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合后，加入酶反應(yīng)底物，催化顯色，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺或有無，定性或定量分析受檢物質(zhì)。由于酶的催化效率很高，故可放大反應(yīng)效果，提高檢測的敏感度[1]。但是，傳統(tǒng)ELISA方法由于受讀取方式限制，靈敏度僅達到皮摩爾（即pg/mL）水平，且需要將受檢物質(zhì)進行稀釋以達到反應(yīng)所需的體積。

1971年，Engvall和Perlmann報道了利用ELISA定量測定IgG的研究技術(shù)，使其成為測定液體樣本中微量物質(zhì)的方法。2014年，基于ELISA原理，美國Quanterix公司開發(fā)了單分子免疫陣列（single molecule array，Simoa）技術(shù)，用磁珠捕獲免疫復(fù)合物，并單獨封閉在Simoa圓盤的微孔中，遵循泊松分布進行分析，實現(xiàn)數(shù)字化形式的ELISA檢測，又稱“數(shù)字ELISA”[2]。

相比傳統(tǒng)ELISA，Simoa技術(shù)具有6點優(yōu)勢：（1）靈敏度高。其靈敏度為傳統(tǒng)ELISA技術(shù)的1 000倍以上，檢測下限達到fg/mL，實現(xiàn)了超低豐度蛋白的有效檢測和定量，節(jié)約珍貴樣本，減少基質(zhì)效應(yīng)。（2）全自動化。基于Quanterix Simoa HD-1數(shù)字式單分子免疫陣列分析儀，試驗過程不依賴操作人員，從而保證結(jié)果的重復(fù)性和精準(zhǔn)性。（3）多重檢測。能同時完成多達 10 種目標(biāo)分子的檢測。（4）重復(fù)性好。試驗結(jié)果的批間變異系數(shù)（CVs）低于10%。（5）線性范圍高。檢測的動態(tài)范圍超過4個數(shù)量級。（6）自主研發(fā)。可根據(jù)試驗?zāi)康倪M行方案開發(fā)和優(yōu)化，適合科研創(chuàng)新研究。為了解Simoa技術(shù)在傳染病診斷中的應(yīng)用情況，本文綜述了其原理及在新冠病毒感染、肺結(jié)核、朊病毒病等傳染病診斷中的應(yīng)用進展。

1 原理

Simoa檢測中，選取的是含有順磁性的磁珠（直徑2.7 μm），磁珠表面附著抗體捕獲劑，具有10種熒光標(biāo)記，包含25萬個捕獲抗體附著點。通常，將50萬粒磁珠添加到100 μL樣品中，使磁珠數(shù)量遠大于目標(biāo)分子數(shù)量。檢測時，加入生物素標(biāo)記的檢測抗體以及親和素偶聯(lián)的酶和底物。順磁性磁珠附著捕獲抗體，特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白，再連接酶標(biāo)抗體，引入陣列。將磁珠上樣到Simoa圓盤后，磁珠在重力作用下沉積在陣列表面，其中一小部分落入反應(yīng)孔中，其余浮在水面上。利用油將單個磁珠封閉在直徑4.25 μm、深3.25 μm的反應(yīng)孔（well）中進行反應(yīng)，取代水介質(zhì)和多余磁珠，同時避免信號擴散和交叉反應(yīng)。每21.6萬個反應(yīng)孔組成一組陣列（array），每24個陣列再組成一張圓盤（disc），使用CCD攝像頭捕獲反應(yīng)孔中超過閾值的檢測信號，標(biāo)記為“開孔（on well）”和“關(guān)孔（off well）”。通過計算“on well”在陣列中的比例，依據(jù)泊松分布理論，計算同時含有珠子和熒光產(chǎn)物孔的數(shù)量相對于含有珠子孔的總數(shù)的比值來確定測試樣品中的蛋白質(zhì)濃度（圖1）。與傳統(tǒng)方法相比，Simoa技術(shù)能夠通過數(shù)字方式而不是通過測量全部模擬信號來確定濃度，因此這種檢測單一免疫復(fù)合物的方法被稱為“數(shù)字ELISA”。此外，磁珠可進行多重?zé)晒鈽?biāo)記，通過統(tǒng)計不同顏色熒光磁珠的“on well”數(shù)量，即可同步獲得多個檢測指標(biāo)的濃度定量值[3]。

圖1 Simoa 工作示意圖[3]

Simoa技術(shù)的關(guān)鍵在于磁珠和超微量反應(yīng)體系。在磁珠方面，磁珠與蛋白分子的比例大約為10:1的條件下，含有標(biāo)記免疫復(fù)合物磁珠遵循泊松分布，即蛋白質(zhì)在相對低濃度情況下，每個磁珠將捕獲單一的免疫復(fù)合物或未發(fā)生捕獲。例如，如果在0.1 mL（6萬個分子）樣本中捕獲了1 fmol蛋白質(zhì)并在50萬個磁珠上標(biāo)記，那么12%的磁珠將攜帶1個蛋白質(zhì)分子，88%的磁珠不攜帶任何蛋白質(zhì)分子。由于溶液中磁珠量大，磁珠間距很小，因此每個分子不到1 min可遇到1個磁珠，理論上所有分子都應(yīng)該與多個珠子發(fā)生相遇。這樣顯著提高了與固定捕獲表面的結(jié)合效率。之后清洗磁珠，去除非特異性結(jié)合蛋白，與生物素標(biāo)記的檢測抗體和β-半乳糖苷酶標(biāo)記的鏈霉親和素一起孵育。每一個捕捉到單個蛋白質(zhì)分子的磁珠都被一種酶標(biāo)記，而不捕獲分子的磁珠保持無標(biāo)記狀態(tài)。

在超微量反應(yīng)體系方面。Simoa技術(shù)將酶產(chǎn)生的熒光團限制在極小的體積（約40 fL，1 fL=10-15L），且每個孔反應(yīng)體系僅為50 fL，約為ELISA反應(yīng)體系的1/（20億）。熒光產(chǎn)物分子局部濃度相對較高，不但提高了酶底物的反應(yīng)效率，而且還指數(shù)級降低了熒光信號的擴散和背景信號的干擾，從而提高了對低豐度蛋白的檢測靈敏度，使檢測單分子變?yōu)榭赡堋?/p>

2 應(yīng)用

當(dāng)前，Simoa技術(shù)可測量血清、血漿、腦脊液、尿液、細胞提取物等基質(zhì)中的蛋白質(zhì)，可應(yīng)用于腫瘤、神經(jīng)、免疫炎癥和傳染性疾病等領(lǐng)域，實現(xiàn)對極低含量的生物標(biāo)志物超高靈敏度檢測。例如，通過Simoa技術(shù)檢測腫瘤每個發(fā)展階段的生物標(biāo)志物水平，辨別出生物標(biāo)志物的微小變化，監(jiān)測評估癌癥發(fā)生風(fēng)險，鑒別良性與惡性腫瘤細胞，評價患者對治療的敏感度，從而為癌癥早期診斷、治療提供新的手段。傳統(tǒng)技術(shù)只能在腦脊髓液中檢測到低水平的神經(jīng)學(xué)生物標(biāo)志物，而Simoa技術(shù)能在更早階段檢測到血液中極低水平的標(biāo)志物，為改善腦損傷和腦病的診斷方式提供可能[4]。在疾病初期，諸多關(guān)鍵炎癥因子，如IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ、TNF-α等表達量極低。傳統(tǒng)ELISA等方法受靈敏度的限制無法檢測這些指標(biāo)，導(dǎo)致研究中經(jīng)常出現(xiàn)空缺值；基于Simoa技術(shù)，可提高靈敏性，成功檢測血清和血漿中引發(fā)炎癥的分子及抗炎癥的分子，改善免疫性疾病的診斷和治療效果。在傳染病潛伏期和出現(xiàn)免疫反應(yīng)前，Simoa技術(shù)可檢測到生物標(biāo)志物，實現(xiàn)更早期的診斷，顯著降低傳染病傳播概率，從而為傳染病篩查、治療開發(fā)以及疾病監(jiān)測提供幫助。

2.1 新冠肺炎診斷

2020年12月28日，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）發(fā)布了緊急使用Simoa?半定量新冠病毒（SARS-CoV-2）IgG抗體檢測授權(quán)書，批準(zhǔn)使用全自動高通量免疫分析儀器Simoa HD-X Analyzer?檢測并定量血清或EDTA血漿中IgG抗體。Simoa檢測的目標(biāo)是人體針對新冠病毒刺突蛋白區(qū)域產(chǎn)生的抗體，因此可通過檢測疑似感染或最近密切接觸者中的IgG抗體進行新冠肺炎診斷。臨床研究結(jié)果顯示，在PCR結(jié)果呈陽性后15 d或更長時間內(nèi)，Simoa抗體檢測敏感性達100%，特異性達99.2%。此外，新冠病毒的刺突蛋白包含多個亞單位，共同介導(dǎo)病毒進入人類細胞，是疫苗設(shè)計的作用靶點。因此，Simoa技術(shù)可用于測定疫苗免疫誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)。另一項研究利用Simoa技術(shù)開發(fā)了新冠病毒刺突蛋白、S1亞單位、核衣殼蛋白的抗原檢測方法，檢測限（LOD）分別為5 pg/mL（0.07 pmol/L）、70 pg/mL（0.39 pmol/L）和0.02 pg/mL（0.4 fmol/L）。在64例新冠病毒核酸檢測陽性患者中，41例檢測到S1亞單位和核衣殼抗原。在這些患者中，血清轉(zhuǎn)化后（5±1）d，血漿中病毒抗原完全被清除，鼻咽RT-PCR檢測結(jié)果呈陽性后（15±5）d，病毒抗原被清除。高濃度S1亞單位抗原患者與ICU入院率（77%）和插管時間（1 d內(nèi)）的相關(guān)性有統(tǒng)計學(xué)意義[5]。這提示Simoa檢測新冠病毒抗原的方法可幫助監(jiān)測疾病感染進程。通過Simoa檢測分析廣泛的超敏感蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物，包括關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)細胞因子和趨化因子，有望實現(xiàn)早期高靈敏度診斷，以區(qū)分新冠肺炎輕癥和重癥患者。

2.2 活動性肺結(jié)核診斷

全世界約有17億人為肺結(jié)核潛伏性感染者（LTBI），其中5%～15%會發(fā)展為活動性肺結(jié)核。對可能發(fā)展為活動性結(jié)核病的潛伏感染患者需要及時采取治療，以避免出現(xiàn)耐藥性問題。目前，遲發(fā)型超敏反應(yīng)皮試試驗、γ干擾素釋放分析（IGRA）均無法區(qū)分潛伏性感染和活動性結(jié)核，雖然QuantiFERON?-TB Gold Plus對IGRA作了進一步改進，選取結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白（ESAT-6和CFP10）作為刺激抗原刺激感染患者產(chǎn)生γ干擾素并進行定量，但是當(dāng)陽性對照值較低或陰性對照有較高的背景反應(yīng)時，所得到的結(jié)果被認為是“不確定的”。這種不確定結(jié)果通常與淋巴細胞減少、人免疫缺陷病毒（HIV）感染或免疫抑制治療導(dǎo)致的免疫缺陷有關(guān)?；赟imoa技術(shù)，γ干擾素檢測較IGRA方法靈敏度提高100倍，能夠進一步鑒別IGRA不確定結(jié)果中的真陽性和陰性樣本，進而幫助針對不同患者采取相適應(yīng)的臨床管理措施[6]。

利用Simoa技術(shù)測定活動性肺結(jié)核患者接受治療前后尿中總IP-10及其激動劑/拮抗劑的含量，并將健康獻血者和肺炎患者作為對照。結(jié)果顯示：與健康獻血者相比，活動性肺結(jié)核患者的總IP-10和激動劑IP-10水平顯著升高；相反，活動性肺結(jié)核患者的IP-10水平與肺炎患者的IP-10水平?jīng)]有差異。IP-10水平升高與肺結(jié)核和肺炎相關(guān)，提示其變化與急性炎癥有關(guān)[7]，說明利用Simoa技術(shù)檢測IP-10，有望幫助診斷活動性結(jié)核病，監(jiān)測結(jié)核病治療效果。

2.3 艾滋病診斷

定量病毒生長分析（QVOA）是一種檢測逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制能力的體外病毒誘導(dǎo)試驗方法，但其精度和動態(tài)范圍有限，且需要的細胞數(shù)量龐大。通常，檢測到可誘導(dǎo)的病毒RNA并不一定表明產(chǎn)生了子代病毒，更準(zhǔn)確的是檢測具免疫相關(guān)性的病毒蛋白含量變化，但傳統(tǒng)ELISA在靈敏度上不能滿足要求?；诖耍藗冮_發(fā)了超靈敏p24定量分析的Simoa技術(shù)測定HIV生長。選取1 μL培養(yǎng)細胞進行Simoa檢測，在感染后第14天通過超敏感Simoa技術(shù)（檢出限為0.003 pg/mL，定量限為0.01 pg/mL）測量發(fā)現(xiàn)上清液中存在HIV p24，而直到第21天采用標(biāo)準(zhǔn)ELISA（檢出限為4.3 pg/mL，定量限為6.25 pg/mL）才發(fā)現(xiàn)上清液中存在HIV p24[8]。在一項針對成人患者抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療研究中，利用Simoa技術(shù)測定病毒生長發(fā)現(xiàn)，HIV的指數(shù)級復(fù)制只發(fā)生在CD32-CD4+T細胞中（平均變化=17.46 pg/mL，P=0.038）。在CD32hi CD4+T細胞中誘導(dǎo)的前病毒復(fù)制水平較低，隨著時間的推移沒有顯著增加（平均變化=0.026 pg/mL，P=0.234），并且僅能通過Simoa技術(shù)檢測到，提示在圍產(chǎn)期已感染HIV的青少年中，潛伏感染過程中病毒主要儲存在CD32-CD4+T細胞中，這為制定針對性的治療策略提供了參考和依據(jù)[9]。同樣，在評價猴免疫缺陷病毒（SIV）生長中，基于Simoa建立了一種超靈敏的SIV-Gag-p27檢測方法。該方法的定量限（LOQ）為0.1 pg/mL，靈敏度是傳統(tǒng)ELISA的100倍，線性范圍為0.08～250.00 pg/mL（傳統(tǒng)ELISA的線性范圍為62.5～2 000.0 pg/mL）。Simoa技術(shù)可提高早期診斷的靈敏性，相比傳統(tǒng)ELISA，提前6 d檢測到陽性，且與SIV-RNA病原學(xué)檢測結(jié)果高度一致，從而幫助評估非人靈長類動物中傳染性SIV的持續(xù)復(fù)制和再激活情況[10]。

2.4 朊病毒病診斷

羊瘙癢病是由朊病毒感染綿羊和山羊引起的一種致命的神經(jīng)退行性疾病。羊瘙癢病的早期診斷依賴于腦組織中病理性朊蛋白的檢測。目前還無法通過檢測血液生物標(biāo)志物實現(xiàn)活體動物的癢病確診。神經(jīng)絲光蛋白（NfL）是一種68 kDa的細胞骨架中間絲蛋白，在神經(jīng)元軸突中表達，并在神經(jīng)元受損時釋放到腦脊液（CSF）和血液中，可作為一種新的生物標(biāo)志物，用于神經(jīng)退行性疾病和其他人類神經(jīng)疾病的診斷、預(yù)后和治療監(jiān)測。通過Simoa檢測發(fā)現(xiàn)，在感染初期患癢病動物的血清中Nfl含量中位數(shù)比正常對照高15倍以上，而出現(xiàn)臨床癥狀的癢病病羊血清Nfl含量與無癥狀病羊無顯著差異[11]，提示可在癢病臨床癥狀出現(xiàn)前利用Simoa技術(shù)檢測活體動物血清Nfl水平，提高對癢病早期檢測的能力，從而有望用于人類克雅氏癥的診斷。

3 展望

3.1 開發(fā)個性化診斷試劑盒

基于Simoa技術(shù)和開放的用戶設(shè)計研發(fā)平臺（HD-1分析儀），利用實驗室自制的抗體，可進一步開發(fā)超靈敏數(shù)字ELISA試劑盒，滿足診斷需要。自制分析開發(fā)過程分為3個階段：首先，制備一批捕獲磁珠和生物素化檢測試劑，要求磁珠濃縮液符合單體標(biāo)準(zhǔn)（＞75%的微珠為單體），并且初始運行的校準(zhǔn)曲線達到所需的靈敏度水平；其次，在初次制備試劑盒滿足目標(biāo)要求的基礎(chǔ)上，大批量制備試劑盒；最后，可進一步優(yōu)化條件，提高磁珠偶聯(lián)抗體的接合水平、抗體的生物素化水平，滴定分析試劑濃度，改變緩沖條件，或調(diào)整培養(yǎng)時間，以增加信號強度，降低背景干擾。降鈣素原是全身炎癥、細菌感染、敗血癥等多種臨床癥狀的標(biāo)志物。然而，在健康個體中，這種蛋白質(zhì)的基線水平通常遠低于當(dāng)前ELISA的定量下限（LLoQ）。通過使用不同的偶聯(lián)濃度固定捕獲抗體，以及不同的生物素水平標(biāo)記檢測抗體，測試捕獲和檢測抗體的配置組合。通過優(yōu)化SβG結(jié)合物的濃度，對測定方法進行微調(diào)。通過幾周的時間，Simoa檢測降鈣素原的靈敏度比傳統(tǒng)ELISA提高了100倍。在未來，研究人員可在幾天之內(nèi)利用全自動HD-1分析儀將現(xiàn)有的ELISA轉(zhuǎn)換為更高靈敏度的Simoa技術(shù)，并可根據(jù)自身檢測目的開發(fā)單一、多重病種的Simoa診斷方法。

3.2 開發(fā)便攜式POC現(xiàn)場診斷套裝

對于一些慢性疾病和潛伏期較長的疾病，需要提高診斷的靈敏性，提高基層一線對疾病的早期發(fā)現(xiàn)能力。如在區(qū)分活動性肺結(jié)核和潛伏感染時，利用Simoa技術(shù)檢測白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）、白細胞介素-18（IL-18）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）4種宿主血液蛋白，并同時檢測抗結(jié)核抗原Ag85B的抗體，從而提高了診斷方法的靈敏性和特異性[12]，使得檢測感染潛伏期中特定生物標(biāo)志物的細微變化成為可能，做到“一落葉而知秋”。同時，Simoa技術(shù)也可以動態(tài)監(jiān)測傳染病感染過程及疫苗免疫后宿主的反應(yīng)和變化。目前配套的全自動HD-1分析儀體積較大，無法滿足現(xiàn)場和基層的需求。未來應(yīng)對設(shè)備進一步改造，使儀器“變小”“變輕”，結(jié)合相應(yīng)的Simoa診斷策略，開發(fā)便攜式POC診斷套裝，實現(xiàn)傳染病早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預(yù)的目標(biāo)。

4 結(jié)語

相比傳統(tǒng)ELISA，Simoa技術(shù)的優(yōu)勢在于將現(xiàn)有檢測的靈敏度提高約1 000倍，使以前難以或不可能測量的生物標(biāo)記物的檢測和量化成為可能，從而開辟了新的應(yīng)用領(lǐng)域，以解決生命科學(xué)研究、生物制藥和體外診斷領(lǐng)域尚未滿足的重大需求。目前，該技術(shù)在一些重大傳染病如新冠肺炎、結(jié)核病、艾滋病、癢病中的診斷優(yōu)勢已逐漸凸顯。未來，在疫病防控領(lǐng)域，通過優(yōu)化設(shè)備，降低檢測成本，開發(fā)相關(guān)病種的試劑盒，有望利用Simoa技術(shù)提高疫病的綜合診斷能力，實現(xiàn)“早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預(yù)”的目標(biāo)。此外，還可將該技術(shù)應(yīng)用于疫苗免疫后的評價，為疫病防控提供參考和依據(jù)。