高 霞，陳 輝，譚 敏，李玉秀，何泓霖

（1.湖南新程檢測(cè)有限公司，湖南 株洲 412000；2.工業(yè)和信息化部電子第五研究所，廣東 廣州 510000）

氟蟲(chóng)腈商品名為銳勁特，是法國(guó)拜耳作物科學(xué)公司（原羅納-普朗克公司）于1987年開(kāi)發(fā)的苯基吡唑類光譜殺蟲(chóng)劑[1-3]，由于氟蟲(chóng)腈具有殺蟲(chóng)譜廣、殺蟲(chóng)效果好、時(shí)效長(zhǎng)、不影響作物生長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)曾于20世紀(jì)90年代后期在我國(guó)大范圍推廣和應(yīng)用[4-5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，大量攝入含一定濃度氟蟲(chóng)腈的食品會(huì)損傷消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、腎臟、甲狀腺等[6-7]。氟蟲(chóng)腈在環(huán)境中穩(wěn)定性較差，能代謝出成毒性更強(qiáng)的氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜和氟蟲(chóng)腈亞砜3 種代謝物[8]，世界衛(wèi)生組織將氟蟲(chóng)腈列為對(duì)人類有中等毒性化學(xué)品[9]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部、工業(yè)和信息化部、環(huán)境保護(hù)部于2009年聯(lián)合發(fā)布的1157號(hào)公告中明確規(guī)定自2009年10月1日起，除衛(wèi)生用、玉米等部分旱田種子包衣劑外，在我國(guó)境內(nèi)停止銷售和使用含氟蟲(chóng)腈成分的農(nóng)藥制劑[10]。我國(guó)于2020年2月15日實(shí)施的GB 2763—2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定了氟蟲(chóng)腈在蔬菜中的最大殘留限量為0.02 mg/kg，此最大殘留限量為氟蟲(chóng)腈及其3 種代謝物之和，以氟蟲(chóng)腈表示[11]。國(guó)外方面，歐盟委員會(huì)于2020年5月18日實(shí)施的2019/1792號(hào)條例修訂了氟蟲(chóng)腈在多種產(chǎn)品中的最大殘留限量，修訂后氟蟲(chóng)腈在蔬菜中的最大殘留限量為0.005 mg/kg，此最大殘留限量也為氟蟲(chóng)腈及其3 種代謝物之和。

目前測(cè)定食品中氟蟲(chóng)腈檢測(cè)方法主要有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-21]、氣相色譜-電子電離源-質(zhì)譜法[21-25]、氣相色譜-負(fù)化學(xué)源電離-質(zhì)譜法[21,26-27]和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[21,28-30]。而目前的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和報(bào)道文獻(xiàn)方法中大多集中在氟蟲(chóng)腈原藥檢測(cè)上，也有部分對(duì)氟蟲(chóng)腈代謝物檢測(cè)進(jìn)行研究，但多集中在對(duì)動(dòng)物源食品，且多采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜-電子電離源-質(zhì)譜法和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，鮮有采用氣相色譜-負(fù)化學(xué)源電離-質(zhì)譜法檢測(cè)蔬菜中氟蟲(chóng)腈及其代謝物的報(bào)道。GB 2763—2019規(guī)定蔬菜中氟蟲(chóng)腈采用SN/T 1982—2007《進(jìn)出口食品中氟蟲(chóng)腈殘留量檢測(cè)方法 氣相色譜-質(zhì)譜法》檢測(cè)，該方法采用的是氣相色譜-負(fù)化學(xué)源電離-質(zhì)譜法，但只檢測(cè)氟蟲(chóng)腈原藥，不涉及其代謝物氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜和氟蟲(chóng)腈亞砜。氟蟲(chóng)腈及其3 種代謝物分子結(jié)構(gòu)中含有6 個(gè)氟原子、2 個(gè)氯原子和1 個(gè)氰基基團(tuán)，具有較強(qiáng)的電負(fù)性?；瘜W(xué)源電離是軟電離方式，對(duì)基質(zhì)和色譜柱流失沒(méi)有響應(yīng)，采用化學(xué)源檢測(cè)負(fù)離子，相對(duì)電子電離源譜圖更簡(jiǎn)單，選擇性更好、辨識(shí)度更高，也能獲得更高的檢測(cè)靈敏度。

綜上所述，建立蔬菜中氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留量的氣相色譜-負(fù)化學(xué)源電離-質(zhì)譜檢測(cè)方法迫在眉睫。本實(shí)驗(yàn)基于QuEChERS前處理方法，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化，結(jié)合氣相色譜-負(fù)化學(xué)源電離-質(zhì)譜法對(duì)蔬菜中氟蟲(chóng)腈及其3 種代謝物氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜和氟蟲(chóng)腈亞砜的檢測(cè)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，本方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，可以滿足蔬菜中氟蟲(chóng)腈及其3 種代謝物的快速檢測(cè)需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菠菜、辣椒、豇豆、甘藍(lán)、黃瓜 市購(gòu)；氟蟲(chóng)腈、氟蟲(chóng)腈砜標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥96%） 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；氟甲腈、氟蟲(chóng)腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（100 μg/mL，溶劑為丙酮） 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所；乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA，40～63 μm）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18，40～63 μm）、石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB，120～400 目）、尼龍過(guò)濾膜（0.22 μm） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；乙腈、丙酮（均為色譜級(jí)） 美國(guó)TEDIA公司；氯化鈉、無(wú)水硫酸鎂（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ7000氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有Chromeleon 7分析軟件） 美國(guó)Thermo Fisher公司；TG18均質(zhì)器德國(guó)IKA公司；VORTEX-6渦旋混合器 江蘇海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司；H2050R冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DC系列24位防腐型水浴氮吹儀上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；Transferpette?移液器德國(guó)Brand公司。

1.3 方法

1.3.1 試樣制備

取代表性樣品約1 000 g，切碎后用均質(zhì)器充分?jǐn)囁榫鶆?，放入聚乙烯瓶中，于?0 ℃冰箱中保存。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取10 g均質(zhì)后樣品于50 mL具塞離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋混勻1 min，再振蕩提取3 min，加入5 g MgSO4和2 g NaCl，劇烈振蕩1 min，5 000 r/min離心1 min，取2 mL上清液于預(yù)先加入50 mg PSA、25 mg C18、25 mg GCB和100 mg MgSO4的離心管中，劇烈振蕩1 min，10 000 r/min離心1 min，取上清液1 mL于40 ℃水浴中氮?dú)獯蹈?，加? mL丙酮，渦旋溶解，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，待氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取氟蟲(chóng)腈和氟蟲(chóng)腈砜適量，以丙酮為溶劑，配制質(zhì)量濃度為100 μg/mL的氟蟲(chóng)腈和氟蟲(chóng)腈砜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于－20 ℃低溫保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別準(zhǔn)確吸取氟蟲(chóng)腈、氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜和氟蟲(chóng)腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各1 mL，用丙酮稀釋至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，于－20 ℃低溫保存。

空白基質(zhì)提取液：樣品在1.3.2節(jié)進(jìn)行前處理后進(jìn)行儀器分析，當(dāng)氟蟲(chóng)腈及其3 種代謝物的定性和定量離子信噪比均小于3時(shí)，可確定樣品為空白基質(zhì)，空白基質(zhì)按照1.3.2節(jié)前處理，獲得空白基質(zhì)提取液。

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確吸取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用空白基質(zhì)提取液稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/L和10.0 μg/L的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，供氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。

1.3.4 氣相色譜-質(zhì)譜條件

1.3.4.1 氣相色譜條件

TR-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣模式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣體積1 μL；載氣為高純氦氣；載氣流速1 mL/min；程序升溫：初始溫度100 ℃，保持1 min，以80 ℃/min升至220 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min升至280 ℃，保持1 min。

1.3.4.2 質(zhì)譜條件

傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度150 ℃；四極桿溫度150 ℃；負(fù)化學(xué)源電離；選擇離子監(jiān)測(cè)；溶劑延遲3 min；反應(yīng)氣：甲烷（純度≥99.999%）；反應(yīng)氣流速1.25 mL/min。氟蟲(chóng)腈及其代謝物的檢測(cè)參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 氟蟲(chóng)腈及其代謝物的檢測(cè)參數(shù)Table 1 Chromatographic and MS parameters for fipronil and its metabolites

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀配備的定量分析軟件Chromeleon 7和Microsoft Excel對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析和統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 氟蟲(chóng)腈及其代謝物的檢測(cè)參數(shù)優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

嘗試相同規(guī)格（30 m×0.25 mm，0.25 μm）不同固定相的石英毛細(xì)管色譜柱，包括TG-1MS色譜柱（100%二甲基聚硅氧烷）、TG-5MS色譜柱（5%苯基/95%二甲基聚硅氧烷）和TR-5MS色譜柱（5%苯基聚硅氧烷），結(jié)果發(fā)現(xiàn)氟蟲(chóng)腈及其3 種代謝物在3 種色譜柱上均有保留，但在TR-5MS上峰形較好（圖1），因此選擇TR-5MS作為本實(shí)驗(yàn)分析用色譜柱。

圖1 氟蟲(chóng)腈及其代謝物總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatogram of fipronil and its metabolites

2.1.2 質(zhì)譜參數(shù)的確定

以負(fù)化學(xué)源電離為質(zhì)譜源，采用全掃描離子模式掃描氟蟲(chóng)腈及其3 種代謝物的特征離子，質(zhì)量掃描范圍設(shè)置為m/z100～500，氟蟲(chóng)腈、氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜和氟蟲(chóng)腈亞砜的全掃描質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。根據(jù)各化合物的氣相色譜-質(zhì)譜圖確定特征碎片離子（表1）并建立選擇離子監(jiān)測(cè)方法進(jìn)行后續(xù)分析。

圖2 氟蟲(chóng)腈及其代謝物全掃描質(zhì)譜圖Fig.2 Full-scan mass spectra of fipronil and its metabolites

2.2 前處理方法優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

農(nóng)殘檢測(cè)中，常用提取溶劑有乙腈、丙酮、乙酸乙酯等，本實(shí)驗(yàn)以添加量為5.0 μg/kg的黃瓜為研究對(duì)象，對(duì)比乙腈、酸化乙腈（1%乙酸）、丙酮、乙酸乙酯和正己烷作為提取溶劑對(duì)氟蟲(chóng)腈及其3 種代謝物的提取效果，結(jié)果見(jiàn)圖3。乙腈和酸化乙腈對(duì)4 種化合物的提取回收率高于丙酮、乙酸乙酯和正己烷，乙腈和酸化乙腈對(duì)氟蟲(chóng)腈、氟甲腈和氟蟲(chóng)腈亞砜的提取回收率接近，均為100%左右，但乙腈對(duì)氟蟲(chóng)腈砜的提取回收率優(yōu)于酸化乙腈，故本研究選用乙腈為提取溶劑。

圖3 提取溶劑對(duì)回收率的影響Fig.3 Effect of extraction solvents on recoveries of fipronil and its metabolites

2.2.2 提取溶劑用量的確定

以黃瓜為研究對(duì)象，準(zhǔn)確稱量10.0 g樣品，添加量為5.0 μg/kg時(shí)，分別考察乙腈用量為10、15、20、25、30 mL時(shí)對(duì)農(nóng)藥殘留的提取效果，結(jié)果見(jiàn)圖4。采用20 mL乙腈能達(dá)到充分提取目標(biāo)分析物的目的，繼續(xù)增加乙腈用量，提取效果未見(jiàn)明顯改善。

圖4 提取溶劑用量對(duì)回收率的影響Fig.4 Effect of extraction solvent volume on recoveries of fipronil and its metabolites

2.2.3 凈化方法的優(yōu)化

蔬菜樣品經(jīng)乙腈提取后，會(huì)有有機(jī)酸、色素、蠟質(zhì)、維生素等雜質(zhì)進(jìn)入提取液中，本研究采用農(nóng)藥殘留檢測(cè)常用的QuEChERS凈化方法對(duì)提取液進(jìn)行凈化，QuEChERS常用吸附劑有PSA、C18和GCB等，PSA通過(guò)陰離子交換吸附脂肪酸、有機(jī)酸、極性色素以及糖類等干擾物，C18可除去非極性的干擾物如脂類、花青素、蠟質(zhì)等，GCB作為弱極性或非極性吸附劑，能有效去除疏水性化合物，如葉綠素、葉黃素、類胡蘿卜素等色素和甾醇等。為探討PSA、C18和GCB的用量對(duì)氟蟲(chóng)腈及其代謝物回收率影響及無(wú)水MgSO4對(duì)凈化液的除水效果，以2 mL添加量為5.0 μg/kg黃瓜基質(zhì)的提取離心后的上清液為研究對(duì)象，PSA選取25、50、100 mg三水平，C18選取12.5、25、50 mg三水平，GCB選取12.5、25、50 mg三水平，無(wú)水MgSO4選取100、150、200 mg三水平做正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2、3。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果（n=3）Table 2 Orthogonal array design with experimental results for optimization of sorbent combinations (n= 3)

由表3可以看出，PSA、C18、GCB和MgSO4的平均極差值分別為8.3%、7.3%、10.1%和4.1%，4 個(gè)因素對(duì)加標(biāo)回收率的主次影響順序?yàn)镚CB、PSA、C18和MgSO4，從表3四種吸附劑各水平下整體平均回收率可以看出各因素的最好水平分別為PSA水平2，GCB水平2、C18水平2、MgSO4水平1，即4 種吸附劑的最佳組合為PSA 50 mg、GCB 25 mg、C1825 mg、MgSO4100 mg，此組合并未出現(xiàn)在正交試驗(yàn)表中，通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，氟蟲(chóng)腈、氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜和氟蟲(chóng)腈亞砜的加標(biāo)回收率分別為93.4%、94.6%、98.1%和99.3%，整體優(yōu)于表2中數(shù)據(jù)。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 3 Result analysis of orthogonal array design%

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率兩者比值，比值越接近1，則基質(zhì)效應(yīng)越小。本研究考察氟蟲(chóng)腈及其3 種代謝物在菠菜、辣椒、豇豆、甘藍(lán)和黃瓜中的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表4。氟蟲(chóng)腈及其3 種代謝物在5 種蔬菜中存在不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，氟蟲(chóng)腈及其3 種代謝物中氟蟲(chóng)腈的基質(zhì)效應(yīng)最大、氟甲腈的基質(zhì)效應(yīng)最小，5 種蔬菜中菠菜的基質(zhì)效應(yīng)最大、黃瓜的基質(zhì)效應(yīng)最小。為克服基質(zhì)效應(yīng)，本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

表4 氟蟲(chóng)腈及代謝物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、LOD和LOQTable 4 Calibration equations, coefficients of determination, liner ranges, LODs and LOQs for fipronil and its metabolites

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1 線性范圍、LOD和LOQ結(jié)果

在優(yōu)化的分析條件下，配制氟蟲(chóng)腈及其代謝物質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μg/L的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定后，以農(nóng)藥定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，農(nóng)藥基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以添加回收樣品峰響應(yīng)值為3 倍信噪比為方法檢出限（limit of detection，LOD），以10 倍信噪比為方法定量限（limit of quantitation，LOQ）。如表4所示，氟蟲(chóng)腈及其代謝物在0.2～10.0 μg/L線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，LOD為0.2～0.3 μg/kg，LOQ為1.0 μg/kg，低于GB 2763—2019標(biāo)準(zhǔn)和歐盟委員會(huì)（EU）2019/1792號(hào)條例規(guī)定的氟蟲(chóng)腈在蔬菜中的最大殘留限量。

2.4.2 加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果

在菠菜、辣椒、豇豆、甘藍(lán)和黃瓜5 種空白樣品中添加適量氟蟲(chóng)腈及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液，使添加水平分別為L(zhǎng)OQ、5 倍LOQ和10 倍LOQ。每個(gè)添加水平進(jìn)行6 次平行實(shí)驗(yàn)。采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，結(jié)果見(jiàn)表5。4 種化合物的平均加標(biāo)回收率在88.9%～105.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在2.2%～7.6%之間，方法具有較好的回收率和重復(fù)性。證明前處理方法及氣相色譜-負(fù)化學(xué)源電離-質(zhì)譜法靈敏、準(zhǔn)確、高效，適用于各種類別蔬菜中4 種農(nóng)藥殘留的同時(shí)測(cè)定。

表5 5 種蔬菜基質(zhì)中4 種農(nóng)藥的平均回收率和精密度（n=6）Table 5 Average spiked recoveries and precision for fipronil and its metabolites in five vegetables (n= 6)

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用本方法測(cè)定了市售菠菜、辣椒、豇豆、甘藍(lán)和黃瓜5 種蔬菜中的氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留，在一批豇豆樣品中檢出了氟蟲(chóng)腈和氟蟲(chóng)腈亞砜，含量分別為64.2 μg/kg和3.1 μg/kg，二者之和以氟蟲(chóng)腈表示為66.7 μg/kg，超過(guò)GB 2763—2019規(guī)定的氟蟲(chóng)腈在蔬菜中0.02 mg/kg的最大殘留限量，為不合格樣品。圖5為檢出氟蟲(chóng)腈和氟蟲(chóng)腈亞砜殘留的陽(yáng)性豇豆樣品的總離子流色譜圖。

圖5 陽(yáng)性豇豆樣品中氟蟲(chóng)腈及其代謝物總離子流色譜圖Fig.5 TIC chromatogram of fipronil and its metabolites in positive cowpea samples

3 結(jié) 論

本研究建立了氣相色譜-負(fù)化學(xué)源電離-質(zhì)譜法測(cè)定蔬菜中氟蟲(chóng)腈及其3 種代謝物殘留的檢測(cè)方法。與標(biāo)準(zhǔn)方法及已有報(bào)道相比，本方法涵蓋了GB 2763—2019及歐盟委員會(huì)限量規(guī)定中的氟蟲(chóng)腈的全部殘留標(biāo)志物檢測(cè)，本方法樣品前處理簡(jiǎn)便快速、回收率高，LOQ及精密度均能滿足痕量分析要求，可用以蔬菜中氟蟲(chóng)腈及其代謝物殘留量的測(cè)定。