趙小娜，張云云，王增斌，宋 雪，魯周民

（西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

枇杷（Eriobotrya japonicaLindl.）為薔薇科枇杷屬常綠小喬木，原產(chǎn)于中國[1]，作為常綠亞熱帶特色果樹，已成為秦嶺以南的優(yōu)勢果樹產(chǎn)業(yè)。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國栽培面積近13萬 hm2，占世界栽培面積80%以上[2]。其果實、葉、花、種子、根均在人類醫(yī)療中發(fā)揮著重要作用[3]，枇杷葉作為傳統(tǒng)中草藥具有清肺止咳、降逆止嘔等功效[4]，是傳統(tǒng)的藥食兼用果樹。在華南地區(qū)，枇杷樹1 a可抽3～4 次梢，分別為春梢、夏梢、秋梢和冬梢[5]，以春梢和夏梢生長量最大，因此，枇杷葉資源十分豐富。作為枇杷栽培的副產(chǎn)物，枇杷葉中三萜酸、黃酮含量均高于花和果實[6-7]，具有極高的藥用價值。目前，有關(guān)枇杷葉藥理學(xué)研究一直是本領(lǐng)域的研究熱點。其所含的三萜類物質(zhì)具有止咳平喘、抗炎、抗菌免疫和抗腫瘤作用，黃酮化合物具有抗氧化、保肝護(hù)腎等作用[8]，多糖對腎炎有一定的治療作用[9]。此外，枇杷葉提取物還用于緩解心血管疾病和糖尿病等慢性代謝病[10]，治療急性肺損傷[11]和骨質(zhì)疏松[12]等。

在枇杷生產(chǎn)栽培管理中，常對春梢做摘心處理[13]并摘除果穗基部春梢以提高果實品質(zhì)和產(chǎn)量；采果后進(jìn)行修剪管理，疏除密生枝、徒長枝等果樹整形[14]時，會疏除大量的夏梢新葉，從而使大量春、夏梢新葉被廢棄，造成浪費(fèi)。而針對枇杷新葉伸長生長過程和新葉伸長生長期主要成分含量變化規(guī)律鮮見報道。如能實現(xiàn)對這部分枇杷春夏梢新葉的合理利用，對于增加果農(nóng)經(jīng)濟(jì)收益、豐富枇杷葉加工產(chǎn)品和推動產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展具有重要意義。在日本，枇杷葉茶作為一種健康的飲品被廣泛飲用，枇杷葉還可以和其他原料混合制得復(fù)合發(fā)酵茶[15]，不僅能抑制餐后高三酰甘油癥[16]，還能調(diào)節(jié)血糖水平[17]。目前市場上枇杷葉茶均以成熟葉加工而成[18]，枇杷新葉清香柔軟具備制茶基礎(chǔ)。本研究以春、夏新發(fā)枇杷葉為材料，在伸長生長過程定期進(jìn)行主要成分測定，并對以不同長度夏梢新葉加工的葉茶進(jìn)行品質(zhì)分析，旨在揭示枇杷葉新芽伸長過程中主要成分含量變化規(guī)律以及對制茶效果的影響，為枇杷新葉的合理利用提供理論技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枇杷葉采自西北農(nóng)林科技大學(xué)南校區(qū)實生枇杷園。于2019年枇杷春、夏梢新葉開始發(fā)芽后，選取同一時期發(fā)芽的新梢進(jìn)行標(biāo)記，從新葉發(fā)芽生長到2 cm左右時的3月24日和6月24日開始采樣，每隔5 d采樣一次，每次都選取最早長出的第1、2葉位的新葉，共采樣6 次。6 次的新葉樣品長度范圍分別為2～5（記為a）、6～9（b）、10～13（c）、14～16（d）、17～19 cm（e）和20～23 cm（f）。

沒食子酸（分析純） 天津市光伏精細(xì)化工研究所；VC、葡萄糖（均為分析純） 廣東光華科技有限公司；水溶性VE（Trolox） 美國Sigma公司；沒食子酸、蘆丁、熊果酸、綠原酸、新綠原酸、兒茶素（均為優(yōu)級純） 上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈、冰醋酸（均為色譜純） 美國TEDIA公司；2,4,6-三吡啶三吖嗪、福林-酚（均為分析純）北京索萊寶生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH）（分析純）東京化成工業(yè)公司；2,2’-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-amino-di (3-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6) ammonium salt，ABTS） 上海藍(lán)季生物科技有限公司；草酸（分析純） 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；水合茚三酮、偏磷酸（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；高氯酸、冰乙酸、九水硝酸鋁（均為分析純） 成都市科隆化學(xué)品有限公司；香草醛（分析純） 西安中信精細(xì)化工有限責(zé)任公司；硫脲、過硫酸鉀（均為分析純） 天津博迪化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JYL-C022E料理機(jī) 九陽股份有限公司；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；DGG-9140A型恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DK-S24型恒溫水浴鍋上海森信實驗儀器有限公司；KH-500DE型數(shù)控超聲清洗儀 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；350-8519型萬分之一分析天平 瑞士普利賽斯公司；H1850型臺式高速離心機(jī) 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；UV-1240型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；1260液相色譜系統(tǒng) 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

鮮葉樣品采集后即帶回實驗室，用刷子清理葉片上灰塵等雜質(zhì)，剔除葉柄和有蟲害及顏色不一致的葉片，分兩部分處理。其中一部分液氮研磨后置于－80 ℃冰箱備用，用于測定總酚、黃酮、三萜酸和可溶性糖含量；另一部分于室內(nèi)（室溫25 ℃）攤開晾置3 h、使少量失水后用于制茶。先采用常壓蒸汽殺青2 min，冷卻后，采用傳統(tǒng)手工揉捻10 min，至掌心有濕潤汁液為度，于100 ℃熱風(fēng)烘干40 min，制得枇杷葉茶。將制好的枇杷葉茶置于料理機(jī)中高速粉碎，過60 目篩，自封袋密封置于干燥器中，用于測定總酚、黃酮、三萜酸、可溶性糖、酚類單體和水浸出物等成分含量及抗氧化活性。每類樣品3 次重復(fù)。

1.3.2 功能成分指標(biāo)測定

取1.000 g枇杷葉茶或者鮮樣干粉加入15 mL 50%乙醇溶液，在溫度30 ℃、功率100 W條件下超聲提取40 min，10 000×g離心10 min，重復(fù)1 次，合并上清液，定容至30 mL，用于黃酮、總酚、三萜酸、抗氧化活性的測定。

黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定：采用硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法[4]；總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定：采用福林-酚比色法，參考GB/T 8313—2013《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》；三萜酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定：采用香草醛-高氯酸比色法[19]；抗氧化活性測定：采用ABTS陽離子自由基清除法、DPPH自由基清除法和鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法[20-21]。

1.3.3 營養(yǎng)成分指標(biāo)測定

取0.300 g茶葉干粉或鮮樣加入5 mL蒸餾水，水浴鍋中沸水浴45 min，6 000×g離心10 min，重復(fù)1 次，合并上清液，蒸餾水定定容至10 mL，用于VC、游離氨基酸、可溶性總糖的測定。

VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定：采用鉬藍(lán)比色法，參考王玉林等[22]的方法，略有改動；游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定：參考GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測定》方法；可溶性總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定：采用蒽酮-硫酸比色法，參考徐美蓉等[23]的方法，略有改動；水浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定：參考GB/T 8305—2013《茶 水浸出物測定》方法。

1.3.4 酚類組分測定

參考霍宇航等[24]的方法，并作適當(dāng)修改。酚類提取液制備：稱取不同長度的枇杷葉茶干粉0.200 g左右，加入4 mL無水乙醇，浸提24 h，在設(shè)定溫度30 ℃，功率為100 W，超聲提取40 min，12 000×g離心15 min，取上清液過濾待用。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備：精密稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg、兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg和綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg置于50 mL棕色瓶中，甲醇定容；新綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg和異槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg置于25 mL棕色瓶中，甲醇定容。得到?jīng)]食子酸、兒茶素、綠原酸、新綠原酸、蘆丁和異槲皮苷質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.1、0.8 0.8 0.8 mg/mL。

ZORBAX SB-18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相：去離子水（A）、甲醇（B）、乙腈（C）和5%冰乙酸（D）；洗脫體積流量0.4 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；檢測波長：沒食子酸和兒茶素為275 nm，新綠原酸和綠原酸為330 nm，異槲皮苷和蘆丁為360 nm；柱溫30 ℃。梯度洗脫條件見表1，標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖見圖1。

表1 HPLC法的梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions for HPLC

圖1 標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖Fig.1 Chromatograms of standard samples

1.3.5 感官評價

取3.0 g茶樣，置于白色紙杯中，注入150 mL沸水沖泡4 min，依次濾除茶葉，組織9 名經(jīng)過培訓(xùn)的人員組成評審小組從外形、湯色、滋味、香氣和葉底進(jìn)行評審描述。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0軟件和Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，Origin Pro 2020軟件進(jìn)行繪圖，對數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷新葉伸長生長過程中主要成分變化

如圖2所示，主要功能成分在春梢和夏梢之間以及不同葉長之間存在顯著差異（P＜0.05）。由圖2可知，黃酮、總酚和三萜酸3 種成分含量在春梢和夏梢枇杷新葉伸長期變化趨勢基本一致，隨著葉長增加總體呈下降趨勢，可溶性總糖含量呈先上升后下降趨勢，且夏梢枇杷新葉主要成分含量總體高于春梢（P＜0.05）。葉長為6～9 cm的春梢和夏梢新葉黃酮、總酚和三萜酸含量最高，春梢分別為（48.44±1.08）、（23.79±1.11）、（23.83±0.20）mg/g，夏梢分別為（62.42±2.81）、（26.85±0.86）、（31.74±3.40）mg/g，長度2～5 cm的新葉中含量低于6～9 cm，這可能是由于新生葉前期生長中表面絨毛較多導(dǎo)致測定時產(chǎn)生誤差造成的。夏梢新葉生長時，由于氣溫較高和光照較強(qiáng)，光合作用使可溶性總糖快速積累，其含量在長度6～9 cm的葉片中達(dá)到最高，為（29.72±2.00）mg/g，而在春梢新葉生長時，葉片光合作用強(qiáng)度較小，可溶性總糖在新葉長到長度14～16 cm時達(dá)到最高，為（19.51±2.50）mg/g，之后又隨著葉片的快速伸長呈緩慢下降趨勢。

圖2 春梢和夏梢枇杷新葉主要功能成分隨葉長變化Fig.2 Changes in main functional components in spring and summer loquat leaves with length

較多研究顯示，枇杷葉黃酮、三萜酸等成分含量在新葉、成熟葉和老葉的變化過程呈遞增趨勢[5,25]，本研究結(jié)果表明，在枇杷新葉伸長期黃酮、總酚、三萜酸含量隨葉長的增加呈下降趨勢。這是枇杷葉從發(fā)芽到掉落不斷進(jìn)行物質(zhì)積累和消耗，而在新葉伸長生長這一階段，可能由于快速展葉導(dǎo)致這些功能物質(zhì)分散到單位質(zhì)量葉片中的含量變小而呈下降趨勢，當(dāng)葉片不再伸長時，又會隨著物質(zhì)不斷積累而呈增加趨勢。

2.2 夏梢枇杷新葉長度對制茶效果的影響

2.2.1 枇杷新葉長度對葉茶功能成分及抗氧化性的影響

枇杷葉茶中黃酮、總酚、三萜酸和可溶性總糖含量隨葉長的變化與鮮葉中的變化趨勢一致（圖3A）。枇杷葉茶中黃酮含量最高，三萜酸含量最低。其中黃酮和總酚隨葉長的增加下降幅度相對較大，長度2～5 cm新葉所制葉茶黃酮和總酚含量分別為（251.26±0.24）mg/g和（100.93±6.87）mg/g，分別比長度20～23 cm新葉所制葉茶高出1.2 倍和1.08 倍?？扇苄钥偺呛腿扑嶙兓鄬^平緩，長度10～13 cm新葉所制葉茶可溶性總糖含量（（130.64±16.16）mg/g）顯著高于其他5 個長度（P＜0.05），三萜酸含量以長度6～9 cm新葉所制葉茶最高（（60.47±4.12）mg/g）。

圖3 不同長度枇杷新葉所制葉茶主要功能成分含量（A）及抗氧化值（B）的變化Fig.3 Changes in main functional components (A) and antioxidant activity (B) of tea produced from loquat leaves of different lengths

枇杷葉茶ABTS值、DPPH值和FRAP值隨葉長增加總體呈明顯下降趨勢，其中ABTS值最高，DPPH值次之，F(xiàn)RAP值最?。▓D3B）。長度2～5 cm新葉所制葉茶3 種抗氧化值最高，為（775.28±54.84）、（725.40±7.30） μmol/g和（568.18±22.76） μmol/g，分別比長度20～23 cm新葉所制葉茶高出0.87、0.98、0.89 倍。

有研究表明，枇杷葉經(jīng)炮制后黃酮、多糖和熊果酸含量高于生品[26-27]，本研究中枇杷新葉制茶后黃酮、總酚、三萜酸和可溶性總糖含量及抗氧化性高于鮮葉，且黃酮含量增加最多。這可能是由于枇杷嫩葉中黃酮類物質(zhì)較多，而黃酮苷是綠色茶湯的重要組成部分，在制茶過程中，高溫使黃酮苷水解脫去苷類配基變成黃酮或黃酮醇，茶葉苦味降低同時黃酮含量增加[28]。ABTS、DPPH和FRAP三種抗氧化方法所測結(jié)果與黃酮、總酚和三萜酸含量存在極顯著正相關(guān)[29]。

2.2.2 枇杷新葉長度對葉茶水浸出物營養(yǎng)成分的影響

對不同長度夏梢新葉加工的葉茶進(jìn)行水浸出物、VC和游離氨基酸測定，結(jié)果如表2所示。枇杷葉茶水浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)在30.40%～34.72%之間，不同長度枇杷新葉所制葉茶水浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不顯著。水浸出物中VC含量在4.98～7.63 mg/g之間，以長度6～13 cm新葉所制葉茶的含量顯著高與其他長度新葉所制葉茶（P＜0.05）。水浸出物中游離氨基酸含量在4.61～5.80 mg/g之間，以長度2～5 cm新葉所制葉茶顯著高于其他長度（P＜0.05）。茶葉中含有能溶于水的可溶性物質(zhì)，其組成和含量綜合決定著茶葉品質(zhì)，一般茶葉水浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%～48%[30]。本實驗所制枇杷葉茶水浸出物含量在其范圍之中，在6 個長度范圍新葉所制葉茶之間變化不明顯。

表2 不同長度枇杷新葉所制葉茶水浸出物、VC和游離氨基酸含量Table 2 Contents of water extract, vitamin C and free amino acids in tea produced from loquat leaves of different lengths

2.2.3 枇杷新葉長度對葉茶酚類組分的影響

如表3所示，6 種酚類單體物質(zhì)含量隨葉長的增加基本都呈逐漸降低趨勢。兒茶素是枇杷葉茶中含量最高的單體物質(zhì)，新綠原酸次之。在長度2～5 cm新葉所制葉茶中，兒茶素、新綠原酸、綠原酸、異槲皮苷和沒食子酸含量最高，分別為（617.56±247.02）、（159.06±40.72）、（121.54±32.40）、（27.54±5.90）、（24.65±1.22） mg/100 g，顯著高于其他長度新葉所制葉茶（P＜0.05）。蘆丁是枇杷葉茶中含量最低的單體物質(zhì)，其中以長度10～13 cm新葉所制葉茶含量最高為（4.08±0.55） mg/100 g，顯著高于其他長度新葉所制葉茶（P＜0.05）。

表3 不同長度枇杷新葉制茶酚類組分方差分析結(jié)果Table 3 Contents of polyphenols in tea produced from loquat leaves of different lengths mg/100 g

2.3 感官品質(zhì)分析

如圖4所示，隨著葉長增加其所制葉茶沖泡色澤逐漸加深。長度分別為2～5、6～10 cm和10～13 cm新葉所制葉茶湯色嫩綠明亮，而長度為14～16 cm新葉所制葉茶湯色深黃欠亮，17～19 cm長度新葉所制葉茶湯色淺黃明亮，長度為20～23 cm新葉所制葉茶可能由于葉長增長葉綠素溶解少茶湯色澤最淺且明亮。其中，2～5 cm和6～10 cm長度新葉所制葉茶清爽偏淡，葉底為幼葉，嫩綠尚勻齊。長度為10～13 cm新葉所制葉茶香味獨特，葉底為小葉，嫩綠勻齊，消費(fèi)者接受度高。14～16、17～19 cm和20～23 cm長度新葉所制葉茶清香微澀，葉底為較大葉子，黃綠欠勻齊，消費(fèi)者接受度低。

圖4 不同長度枇杷新葉所制葉茶沖泡的湯色Fig.4 Comparison of color of tea infusions from loquat leaves of different lengths

2.4 PCA結(jié)果

對6 個長度枇杷新葉所制葉茶的16 項基本指標(biāo)進(jìn)行PCA，通過降維處理簡化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，選取特征值大于1且累計方差貢獻(xiàn)率大于85%的PC，得出各PC因子載荷值、特征值、方差貢獻(xiàn)率和方差累計貢獻(xiàn)率。結(jié)果如表4、5所示。提取到3 個PC，方差累計貢獻(xiàn)率達(dá)到96.954%，解釋了原始指標(biāo)的幾乎全部信息。所以可用這3 個PC指標(biāo)代替原來16 個指標(biāo)所表達(dá)的信息。3 個PC特征值分別為10.395、3.433和1.685。從因子載荷矩陣結(jié)果看，PC1可反映黃酮、總酚、三萜酸、新綠原酸、綠原酸、兒茶素、異槲皮苷、VC、ABTS、DPPH和FRAP這些功能性指標(biāo)信息，方差貢獻(xiàn)率達(dá)到64.967%；PC2主要反映蘆丁、沒食子酸、游離氨基酸和可溶性總糖的信息，方差貢獻(xiàn)率為21.455%；水浸出物信息以PC3反映，方差貢獻(xiàn)率為10.532%。

表4 3 個主成分的特征向量、特征根、貢獻(xiàn)率、累計貢獻(xiàn)率及因子權(quán)重Table 4 Characteristic vectors, characteristic roots, contribution rates,cumulative contribution rates and factor weights of three principal components

根據(jù)PCA中篩選出的3 個PC初始因子載荷矩陣計算6 個長度范圍枇杷新葉所制葉茶的PC得分，PC1、PC2中長度2～5 cm新葉所制葉茶得分最高，PC3中長度20～23 cm新葉所制葉茶得分最高。通過綜合PCA公式得到綜合得分可以看出，隨著葉長的增加，所制葉茶的綜合得分依次遞減，以長度2～5 cm枇杷新葉所制葉茶綜合得分最高，綜合排名第一。長度2～5、6～9 cm和10～13 cm三個范圍枇杷新葉所制葉茶綜合得分均為正值。

2.5 聚類分析

枇杷葉茶實際加工過程中，長度2～5 cm的枇杷新生葉前期生長中表面絨毛較多導(dǎo)致制茶率低，為得到最佳制茶長度范圍，對不同長度枇杷新葉所制葉茶各項指標(biāo)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖5所示。在歐氏距離0.6處可以把黃酮、總酚、新綠原酸、綠原酸、兒茶素、異槲皮苷及3 種抗氧化指標(biāo)先聚為一類。其中黃酮和新綠原酸、綠原酸、FRAP抗氧化指標(biāo)，總酚和ABTS抗氧化指標(biāo)，兒茶素、異槲皮苷和DPPH指標(biāo)最先聚為一類，能夠首先聚在一起的指標(biāo)表明它們之間相關(guān)性最強(qiáng)，枇杷葉茶中黃酮類和多酚類化合物是影響FRAP、ABTS和DPPH抗氧化活性的重要因素，與現(xiàn)有研究結(jié)果一致[29,31-32]。當(dāng)歐氏距離為5時，可將葉茶聚為2 類，其中長度2～5、6～9 cm和10～13 cm這3 個范圍枇杷新葉所制葉茶聚為一類，而長度14～16、17～19 cm和20～23 cm枇杷新葉所制葉茶聚為另一類。聚類結(jié)果與PCA結(jié)果基本一致。

圖5 不同長度枇杷新葉所制葉茶各項指標(biāo)聚類熱圖Fig.5 Clustering heat map for bioactive components in tea produced from loquat leaves of different lengths

3 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，枇杷春梢和夏梢新葉伸長生長過程中，葉片中主要成分含量在不同季節(jié)以及伸長生長過程的不同長度之間變化明顯。黃酮、總酚和三萜酸的含量都隨新葉伸長生長過程呈逐漸下降趨勢，而可溶性總糖含量先升高后下降；在這一過程中，夏梢枇杷新葉主要成分含量顯著高于春梢；不同長度夏梢新葉加工的葉茶功能成分和營養(yǎng)成分比較豐富，主要成分含量高于鮮葉；枇杷葉茶中黃酮、總酚、三萜酸、酚類單體成分和抗氧化性能及沖泡的水浸出物中VC和游離氨基酸含量都隨葉長的增加呈顯著下降趨勢，可溶性總糖呈先上升后下降趨勢。枇杷發(fā)芽后伸長生長過程的新葉可用于葉茶加工，以長度范圍在2～13 cm之間的新葉具有最佳的制茶適性。