葉精勤，肖 葉，閻 俊，許長華，汪立平，盧 瑛

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

河豚魚肉味腴美、鮮嫩可口，我國東南沿海地區(qū)、越南、韓國、日本和美國等許多地區(qū)和國家均有吃河豚的習(xí)慣，但由于河豚魚的肝臟、卵巢、血液等[1]內(nèi)臟含有大量的河豚毒素，食用河豚魚導(dǎo)致的中毒事故屢次發(fā)生[2]。為了保證消費(fèi)者的食用安全，我國從1990年開始禁止食用河豚，原衛(wèi)生部在1990年11月20日公布《水產(chǎn)品衛(wèi)生管理辦法》中的第3條明確規(guī)定：“河豚魚有劇毒，不得流入市場”[1]。2016年9月7日農(nóng)業(yè)部辦公廳與國家食品藥品監(jiān)督管理總局聯(lián)合發(fā)布了《關(guān)于有條件放開養(yǎng)殖紅鰭東方鲀和養(yǎng)殖暗紋東方鲀加工經(jīng)營》的通知，通知稱“按照先行先試、逐步開放的原則，先行有條件地放開養(yǎng)殖紅鰭東方鲀和養(yǎng)殖暗紋東方鲀2 個(gè)品種產(chǎn)品的加工經(jīng)營”[1]。通知中對(duì)養(yǎng)殖紅鰭東方鲀和養(yǎng)殖暗紋東方鲀中河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）含量仍有明確規(guī)定，其含量不得超過2.2 mg/kg。隨著河豚魚的市場化程度逐步加深，消費(fèi)量逐年上升，其食用的安全性也成為關(guān)注的重點(diǎn)，有效地控制河豚魚中的TTX可推進(jìn)河豚魚市場的健康發(fā)展。

乳酸菌是一類無芽孢的革蘭氏陽性菌，以單糖和雙糖為基質(zhì)，發(fā)酵產(chǎn)物為乳酸[3]，主要有球菌和桿菌兩大類，屬兼性厭氧菌，目前自然界已發(fā)現(xiàn)18 個(gè)乳酸菌屬。乳酸菌是一類重要的益生菌，主要分布在腸道中，可平衡動(dòng)物腸道內(nèi)微生物及其相關(guān)代謝產(chǎn)物，（例如消減貝類毒素、黃曲霉毒素等多種有毒有害物質(zhì)），還可抑制有害菌在腸道的繁殖，以此增加機(jī)體免疫功能[4]。Vasama等[5]發(fā)現(xiàn)活性和非活性鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus均可脫除麻痹性貝毒素，消除率為77.0%～97.2%。Bovo等[6]評(píng)估了7 株乳酸菌去除脫脂牛奶中黃曲霉毒素M1的能力，發(fā)現(xiàn)二者混合后，在相同的接觸時(shí)間，熱滅活乳酸菌細(xì)胞對(duì)黃曲霉毒素M1的去除率明顯高于活細(xì)胞，熱滅活乳酸菌細(xì)胞對(duì)黃曲霉毒素M1的去除率明顯高于活細(xì)胞，且鼠李糖乳桿菌、保加利亞乳桿菌和乳雙歧桿菌的熱滅活細(xì)胞對(duì)黃曲霉毒素M1的去除率最高，其均大于33%。Serrano-Ni?o等[7]研究了5 種益生菌菌株結(jié)合黃曲霉毒素M1的能力，在第0小時(shí)乳酸菌對(duì)黃曲霉毒素的結(jié)合效率介于19.95%～25.43%之間，隨著時(shí)間的變化，黃曲霉毒素M1的吸附效果并沒有明顯的變化。Ismail等[8]也發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素和乳酸菌可在剛接觸的幾分鐘內(nèi)迅速結(jié)合。Sarlak等[9]發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌是降低游離黃曲霉毒素M1中效果最優(yōu)的益生菌菌株。當(dāng)益生菌的菌株接種量為7（lg（CFU/mL）），反應(yīng)pH值為4.5時(shí)，吸附脫脂奶中游離黃曲霉毒素M1效果最優(yōu)，安全性、經(jīng)濟(jì)性最好。Zhao Hongfei等[10]發(fā)現(xiàn)乳桿菌L.plantarumB7和L.pentosusX8對(duì)伏馬毒素有很高的去除效率。葛娜等[11]發(fā)現(xiàn)短乳桿菌CICC20023菌粉對(duì)橙汁中細(xì)交鏈孢菌酮酸的去除率達(dá)86.98%。Endo等[12]發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌JCM1134對(duì)7 種金屬離子有明顯吸附消除作用。徐穎等[13]發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌對(duì)鉛的耐受性較好，當(dāng)吸附pH值為6、初始濕菌添加質(zhì)量濃度為1 g/L時(shí)，雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌對(duì)鉛的吸附率分別為97.44%、96.87%。趙思佳等[14]發(fā)現(xiàn)5 株高壓滅活組的乳酸菌對(duì)丙烯酰胺有很強(qiáng)的吸附能力，吸附能力最強(qiáng)的是植物乳桿菌ATCC8014，其對(duì)丙烯酰胺吸附率高達(dá)96.53%。根據(jù)現(xiàn)有的乳酸菌消減有毒、有害物質(zhì)的報(bào)道，可以發(fā)現(xiàn)乳酸菌能夠消減貝類毒素、黃曲霉毒素等多種有毒有害物質(zhì)，具有效率高、特異性強(qiáng)、綠色無污染等優(yōu)勢，是毒素消減的有效方法。丁婕等[15]發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌對(duì)TTX毒性有明顯的消減效果。

為進(jìn)一步探明消減的作用方式，實(shí)驗(yàn)首先對(duì)鼠李糖乳桿菌進(jìn)行活化、熱滅活、破碎共3 種方式處理并消減TTX，初步判斷鼠李糖乳桿菌與TTX的作用方式后，再對(duì)鼠李糖乳桿菌進(jìn)行組分分離探究不同組分對(duì)TTX免疫活性的影響，并進(jìn)一步通過化學(xué)掩蔽菌體表面的氨基和羧基并結(jié)合傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析鼠李糖乳桿菌的作用位點(diǎn)和作用基團(tuán)，探討鼠李糖乳桿菌對(duì)TTX的消減作用方式，以期為河豚魚加工后的高值化利用及副產(chǎn)物的無害化處理提供理論支撐，也為研究海洋生物毒素的去除機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）標(biāo)準(zhǔn)品美國Sigma公司；6F7河豚毒素單克隆抗體由上海海洋大學(xué)水產(chǎn)品加工與儲(chǔ)藏實(shí)驗(yàn)室制備；TTX標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%） 上海諾冉生物科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（tris (hydroxymethyl) methyl aminomethane，Tris）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）（均為分析純） 生工生物工程（上海）股份有限公司；三氯乙酸（trichloroacetic，TCA）、酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法顯色劑、NaCl、KCl、KH2PO4、Na2HPO4、HCl溶液（4 mol/L）、MgCl2（0.02 mol/L）、蔗糖溶液（0.5 mol/L）（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；吐溫-20 上海阿拉丁生化科技有限公司；硒化鋅窗口片天津博天勝達(dá)公司；鼠李糖乳桿菌由上海海洋大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；HS-3垂直混合器 寧波新芝生物科技股份有限公司；PL2002電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TS-8脫色搖床江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；Spotlight 400傅里葉變換紅外光譜儀（DTGS檢測器及Spectrum 100通用ATR UATR附件） 德國Perkin Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 鼠李糖乳桿菌的活化培養(yǎng)

將凍存于－80 ℃的鼠李糖乳桿菌接入MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h，連續(xù)活化3 代后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 河豚毒素檢測抗原的制備

根據(jù)劉敏慧等[16]的抗原制備方法進(jìn)行部分修改。向2 mL離心管中加入630 μL質(zhì)量濃度為1 mg/mL TTX標(biāo)準(zhǔn)品和410 μL BSA標(biāo)準(zhǔn)品，再逐滴加入10 μL體積分?jǐn)?shù)為37%的甲醇溶液后旋渦振蕩15 s直至加滿126 μL便停止滴液，將制備溶液置于垂直混合器上避光混合72 h。

1.3.3 鼠李糖乳桿菌不同處理樣品的制備

1.3.3.1 熱滅活菌體的制備

根據(jù)Ge Na等[17]的熱滅活菌體制備方法進(jìn)行部分修改。鼠李糖乳桿菌菌落數(shù)生長至108CFU/mL時(shí)，取1 mL菌液，以4 ℃、12 000 r/min離心10 min后收集沉淀，再用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗沉淀2 次后重懸，置于98 ℃恒溫水浴鍋中熱滅活1 h后，以4 ℃、12 000 r/min離心10 min后收集沉淀，PBS清洗3 次后離心、收集沉淀，于4 ℃保存以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3.3.2 活化菌體的制備

鼠李糖乳桿菌的菌落數(shù)生長至108CFU/mL時(shí)，取1 mL菌液，以4 ℃、12 000 r/min離心10 min后收集菌體沉淀，PBS清洗3 次后離心、收集沉淀，于4 ℃保存以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3.3.3 菌體碎片的制備

按照活化菌體制備方的法得到菌體重懸液，添加溶菌酶至終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，于30 ℃恒溫反應(yīng)2 h，再用提前設(shè)置功率為400 W的超聲波破碎儀持續(xù)超聲破碎樣品20 min[18]。以4 ℃、12 000 r/min離心10 min后收集沉淀，PBS清洗3 次后離心、收集沉淀，于4 ℃保存以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3.4 鼠李糖乳桿菌菌體不同組分的分離

1.3.4.1 去除胞外多糖

參照Chaabane等[19]去除胞外多糖（extracellular polysaccharide，EPS）的方法進(jìn)行部分修改。調(diào)整鼠李糖乳桿菌的菌落數(shù)為108CFU/mL時(shí)，取1 mL菌液，以4 ℃、12 000 r/min離心10 min后收集沉淀，用滅菌PBS清洗2 次菌體后重懸，置于沸水浴中加熱30 min后，快速冷卻至室溫，以4 ℃、12 000 r/min離心15 min后收集沉淀，4 ℃保存以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3.4.2 制備原生質(zhì)體

將0.01 mol/L Tris-HCl溶液、0.02 mol/L MgCl2溶液和0.5 mol/L蔗糖溶液混勻后，用濃度4 mol/L的HCl溶液調(diào)pH值至7.6，過0.22 μm膜以配制乳桿菌原生質(zhì)體高滲穩(wěn)定液（Lactobacillusprotoplast high osmotic buffer，LPB），4 ℃保存待用。

調(diào)整鼠李糖乳桿菌的菌落數(shù)為108CFU/mL時(shí)，取1 mL菌液，菌液置于4 ℃冰箱中冷藏30 min，以4 ℃、6 000 r/min離心10 min后收集沉淀，PBS清洗沉淀2 次后重懸，添加溶菌酶至終質(zhì)量濃度為20 mg/mL，37 ℃恒溫水浴2 h，約1.5 h時(shí)取樣，運(yùn)用革蘭氏染色法染色菌體并觀察原生質(zhì)體的形成情況，待80%菌株數(shù)目的菌體呈圓球形后停止酶解。以4 ℃、2 000 r/min離心15 min后收集沉淀，再用LPB溶液清洗2 次后重懸，4 ℃保存以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用[20]，使用前以4 ℃、2 000 r/min離心15 min后收集沉淀中的原生質(zhì)體。

1.3.4.3 制備細(xì)胞壁和肽聚糖

調(diào)整鼠李糖乳桿菌菌落數(shù)為108CFU/mL時(shí)，取1 mL菌液，菌液離心后收集沉淀，PBS清洗3 次后收集沉淀，以400 W、30 min的條件超聲破碎樣品，以4 ℃、12 000 r/min離心15 min后收集沉淀，加入體積分?jǐn)?shù)為8%的SDS溶液并沸水浴10 min后快速冷卻至室溫，離心后收集沉淀，用去離子水清洗沉淀至無泡沫，再加入質(zhì)量濃度為3 mg/mL的胰蛋白酶溶液，并溶于濃度為0.10 mol/L Tris-HCl溶液（pH 7.6）后于設(shè)置37 ℃、200 r/min的搖床過夜8 h，以4 ℃、12 000 r/min離心20 min后收集沉淀，沉淀用去離子水清洗3 次以得到細(xì)胞壁。向沉淀中添加體積分?jǐn)?shù)為10%的TCA溶液重懸，以4 ℃、16 h的條件垂直混合，以4 ℃、15 000 r/min離心20 min后收集沉淀，沉淀重懸于體積分?jǐn)?shù)為10%的TCA溶液后沸水浴10 min，快速冷卻至室溫后以4 ℃、15 000 r/min離心20 min，收集沉淀，用去離子水清洗沉淀3 次以得到肽聚糖[19]。

1.3.5 鼠李糖乳桿菌的表面基團(tuán)掩蔽

1.3.5.1 羧基的化學(xué)處理

通過化學(xué)處理掩蔽鼠李糖乳桿菌表面的羧基，測定掩蔽前后菌體消減TTX免疫活性的能力變化。按照活化菌體的制備方法得到菌體重懸液，調(diào)整菌落數(shù)至108CFU/mL，菌懸液以4 ℃、12 000 r/min離心10 min后收集沉淀，沉淀用超純水清洗3 次，加入1 mL 0.1 mol/L HCl-無水甲醇（1∶1，V/V）于4 ℃垂直混合24 h后用超純水清洗3 次，收集沉淀，于4 ℃保存以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用[21]。

1.3.5.2 氨基的化學(xué)處理

通過化學(xué)處理掩蔽鼠李糖乳桿菌表面的氨基，測定掩蔽前后菌體消減TTX免疫活性的能力變化。按照活化菌體的制備方法得到菌體重懸液，調(diào)整菌落數(shù)至108CFU/mL，菌懸液以4 ℃、12 000 r/min 離心10 min后收集沉淀，沉淀用超純水清洗3 次，加入1 mL甲醛-甲酸（1∶2，V/V）溶液，于4 ℃垂直混合6 h后用超純水清洗3 次，收集沉淀，于4 ℃保存以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用[21]。

1.3.6 TTX-BSA抗原偶聯(lián)物的制備

為了得到用于ELISA檢測的抗原，利用載體蛋白BSA和TTX標(biāo)準(zhǔn)品以1.3.2節(jié)的方法制備。

實(shí)驗(yàn)參考Kamath等[22]評(píng)價(jià)鼠李糖乳桿菌消減TTX免疫活性的方法進(jìn)行部分修改。取KCl∶NaCl∶KH2PO4∶Na2PO4質(zhì)量比為4∶160∶4∶23的混合液溶于去離子水中，用濃度為4 mol/L的HCl溶液調(diào)pH值為7.2，定容至1 L，加入500 μL吐溫-20溶液混勻以配制PBST溶液。完全抗原TTX-BSA用50 mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）稀釋至質(zhì)量濃度為10 μg/mL，于4 ℃包被過夜8 h后，用PBST溶液洗滌。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的脫脂奶粉37 ℃封閉2 h后洗滌。將各菌體樣品消減TTX后的上清液與特異性單克隆抗體6F7等體積混合，37 ℃孵育1 h后加入酶標(biāo)板孵育1 h，洗滌。加入辣根過氧化物酶-羊抗小鼠單克隆抗體（用抗體稀釋液稀釋2 500 倍）37 ℃孵育1 h，洗滌。然后加入ELISA顯色試劑，室溫反應(yīng)15 min，最后加入終止液終止反應(yīng)，并立即用酶標(biāo)儀測定450 nm波長的OD值。以質(zhì)量濃度為10 μg/mL的TTX-BSA與分別不加一抗單克隆抗體6F7、二抗羊抗鼠抗體作為陰性對(duì)照，以加一抗、二抗作為陽性對(duì)照，以50 μg TTX標(biāo)準(zhǔn)品作為樣品競爭為對(duì)照組，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行組實(shí)驗(yàn)。樣品中TTX消減率計(jì)算如式（1）、（2）所示：

式中：OD陽性、OD樣品、OD陰性分別為陽性孔、樣品孔、陰性孔的OD值。

1.3.7 鼠李糖乳桿菌表面的官能團(tuán)變化分析

參考王靜等[23]方法。用1.3.3節(jié)制備的菌體樣品與1.3.6節(jié)方法消減TTX，得到消減前后的菌體重新用超純水懸浮，用微量移液器分別吸取10 μL菌懸液于硒化鋅窗片中心位置，45 ℃烘干至無水分的干燥菌斑。將載有樣品的硒化鋅窗片置于傅里葉紅外變換光譜儀上進(jìn)行光譜采集。參數(shù)設(shè)置為分辨率4 cm－1、掃描次數(shù)32 次。

將原始的紅外譜圖用處理軟件Perkin Elmer Spectrum（Version 10.4.3）進(jìn)行基線校正、多項(xiàng)式最小二乘法平滑處理得到樣品的紅外譜圖。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS Statistics 23.0軟件分析不同不同實(shí)驗(yàn)組之間消減率的顯著性差異，Graphpad Prism 8.0.2軟件繪制鼠李糖乳桿菌不同處理方式、不同組分、化學(xué)掩蔽基團(tuán)分別與TTX消減率的關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 TTX-BSA抗原偶聯(lián)物的制備

如圖1所示，相較于TTX和對(duì)照載體蛋白BSA，偶聯(lián)物TTX-BSA在200～220 nm處的吸收明顯增強(qiáng)，其與叢蕾[1]和劉燕婷[24]等的發(fā)現(xiàn)一致，表明合成的抗原TTXBSA可用于后續(xù)ELISA分析。

圖1 BSA、TTX和TTX-BSA的紫外光譜Fig.1 UV absorption spectra of BSA, TTX and TTX-BSA

2.2 鼠李糖乳桿菌與TTX的作用方式分析

2.2.1 不同處理方式的鼠李糖乳桿菌對(duì)TTX免疫活性的消減效果

如圖2所示，活化菌體、滅活菌體和碎菌體均對(duì)樣品溶液中TTX免疫活性有不同程度的消減作用，消減率越高則說明樣品消減TTX效果越好，反之亦然?；罨w、滅活菌體、碎菌體消減后消減率的均值分別為80%、79%、94%，活菌和滅活菌的消減率無顯著性差異（P＞0.05），碎菌體消減率有明顯提高（P＜0.05），表明鼠李糖乳桿菌對(duì)TTX的消減作用和菌體活性無關(guān)。Zhao Hongfei等[10]發(fā)現(xiàn)乳桿菌L.plantarumB7和L.pentosusX8對(duì)伏馬毒素有很高的去除效率，毒素與菌株細(xì)胞的結(jié)合能力與細(xì)胞活力無必要關(guān)系。Yousefi等[25]研究指出乳酸菌對(duì)苯并芘、苯并蒽、?和苯并(b)熒蒽共4 種多環(huán)芳烴有去除能力，但是乳酸菌和這4 種多環(huán)芳烴的結(jié)合能力與細(xì)胞活力無關(guān)，酸處理、熱處理和超聲處理的細(xì)菌與多環(huán)芳烴的結(jié)合能力更強(qiáng)。Corassin等[26]也同樣證明乳酸菌吸附黃曲霉毒素的能力與菌體活性無關(guān)。曾東等[27]研究發(fā)現(xiàn)非活性的植物乳桿菌F22能夠更好地吸附黃曲霉毒素B1，說明植物乳桿菌F22對(duì)黃曲霉毒素B1的排除作用是物理吸附，而不是生物代謝。因此，實(shí)驗(yàn)推測鼠李糖乳桿菌對(duì)TTX免疫活性的消減很可能是源于TTX和菌體結(jié)構(gòu)的結(jié)合作用。破碎菌體具有更理想消減效果的原因可能為其破碎的狀態(tài)增加了菌體與TTX在結(jié)合時(shí)的接觸表面積，因此細(xì)胞表面暴露更多的結(jié)合位點(diǎn)，增加結(jié)合效率。

圖2 鼠李糖乳桿菌活菌、滅活菌和碎菌消減TTX消減率Fig.2 Reduction percentage of TTX immunological activity by activated, inactivated and broken L.rhamnosus cells

2.2.2 鼠李糖乳酸菌不同組分對(duì)TTX免疫活性的消減效果

為進(jìn)一步探究鼠李糖乳酸菌對(duì)TTX的消減作用部位，實(shí)驗(yàn)分離鼠李糖乳酸菌的不同組分，組分分離法是評(píng)價(jià)菌體內(nèi)各組分對(duì)毒素吸附能力的主要方法[28]。通過不同處理方法制備鼠李糖乳酸菌的不同組分，分別與TTX作用后通過ELISA檢測樣品溶液中TTX的免疫活性，其結(jié)果如圖3所示，完整鼠李糖乳酸菌、無EPS、鼠李糖乳酸菌細(xì)胞壁、鼠李糖乳酸菌原生質(zhì)體、鼠李糖乳酸菌肽聚糖對(duì)TTX單克隆抗體的消減率平均值分別為33%、21%、14%、5%、47%。其中，鼠李糖乳酸菌原生質(zhì)體對(duì)TTX免疫活性幾乎沒有消減作用，此結(jié)果與翟齊嘯[21]發(fā)現(xiàn)乳酸菌原生質(zhì)體在吸附鎘離子過程中沒有明顯作用的結(jié)論相吻合。除原生質(zhì)體樣品外的其他4 種組分中，鼠李糖乳桿菌肽聚糖對(duì)TTX的毒性消減作用最強(qiáng)，比完整菌體的消減率增加14%（P＜0.01）。Zhang Dan等[29]分析了4 種乳酸菌肽聚糖與丙烯酰胺的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌1.0065的肽聚糖與丙烯酰胺的結(jié)合率最高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Zhao Hongfei等[10]研究得出的乳酸菌肽聚糖為吸附、消除伏馬毒素的主要菌體組分的結(jié)論大體一致。

圖3 鼠李糖乳桿菌不同組分消減TTX消減率Fig.3 Percentage reduction of different component in L.rhamnosus

2.2.3 鼠李糖乳桿菌對(duì)TTX的消減作用位點(diǎn)分析

FTIR技術(shù)可讀取微生物菌體細(xì)胞壁、細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)肽聚糖、脂多糖、磷脂雙分子層、蛋白質(zhì)、水、脂肪、多糖以及核酸等物質(zhì)結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵振動(dòng)情況，從而提供整個(gè)微生物菌體生化組成成分的光譜定量信息[30]。實(shí)驗(yàn)對(duì)鼠李糖乳桿菌的活菌、滅活菌和碎菌共3 種不同樣品消減TTX前后的菌體樣品進(jìn)行FTIR光譜分析，結(jié)果如圖4所示，結(jié)合其他研究發(fā)現(xiàn)消減處理前后光譜的變化[31-33]主要集中在以下4 點(diǎn)：1）1 660～1 535 cm－1是酰胺I、II帶的吸收區(qū)域，1 652 cm－1和1 542cm－1處明顯尖峰為－NH2的變形振動(dòng)吸收峰；2）1 396～1 389 cm－1是氨基酸側(cè)鏈的羧基對(duì)稱拉伸吸收域； 3）1 452 cm－1處為氨基酸C－N伸縮振動(dòng)；4）1 240～900 cm－1是多糖的吸收區(qū)域，1 147 cm－1處為CO－O－C的伸縮振動(dòng)，1 078 cm－1處為C－O的伸縮振動(dòng)?；罹蜏缁罹诮Y(jié)合TTX前后的譜圖變化相似，酰胺帶和蛋白質(zhì)羧基區(qū)域的吸收峰在結(jié)合TTX前后均發(fā)生明顯位移，多糖區(qū)域的峰形有所變化，但位移變化不明顯。碎菌體結(jié)合TTX前后的譜圖變化更明顯，酰胺II帶、蛋白質(zhì)C－N、多糖C－O和COO－C區(qū)域的峰位移發(fā)生明顯變化，蛋白質(zhì)的COO－峰形有明顯變化。Shen Yu等[34]通過FTIR和能量色散X射線光譜分析發(fā)現(xiàn)，C＝O、C－O和N－H組是乳酸菌吸附丙烯酰胺的主要官能團(tuán)。李暢[35]通過探究戊糖片球菌菌株9-b-1與鉛的作用，證明－COOH、－NH2、－OH、－H2PO4和－CO等官能團(tuán)參與鉛的吸附過程。由此可見，3 種處理方式與TTX結(jié)合前后的主要基團(tuán)變化集中在蛋白質(zhì)和多糖區(qū)域，其對(duì)應(yīng)的峰值變化區(qū)域與肽聚糖的特征峰吻合[36]，同時(shí)印證鼠李糖乳桿菌組分分離的肽聚糖是與TTX的主要結(jié)合位點(diǎn)，肽聚糖上N－H和COO－可能是鼠李糖乳桿菌對(duì)TTX起消減作用的主要官能團(tuán)。

圖4 鼠李糖乳桿菌活菌、滅活菌和碎菌消減TTX前后的FTIR圖譜Fig.4 FTIR spectra of activated, inactivated and broken L.rhamnosus before and after incubation with TTX

為進(jìn)一步探究鼠李糖乳桿菌表面官能團(tuán)對(duì)TTX消減作用的參與，利用化學(xué)反應(yīng)掩蔽鼠李糖乳桿菌表面的羧基和氨基，通過ELISA檢測TTX消減后的免疫活性變化。如圖5所示，發(fā)現(xiàn)未處理菌體、掩蔽羧基樣品、掩蔽氨基樣品對(duì)TTX單克隆抗體的消減率均值分別是33%、18%、38%，表明掩蔽羧基會(huì)使鼠李糖乳桿菌對(duì)TTX免疫活性的消減率明顯降低（P＜0.05），而掩蔽氨基對(duì)TTX免疫活性消減率基本無影響（P＞0.05）。對(duì)比未處理菌體，掩蔽羧基樣品的消減率降低說明消減后樣品中殘留TTX的免疫活性更強(qiáng)，TTX的消減更少。由此可見，鼠李糖乳桿菌表面羧基被掩蔽后，鼠李糖乳桿菌對(duì)TTX的消減效果會(huì)降低。Chakravarty等[37]發(fā)現(xiàn)掩蔽嗜酸細(xì)菌表面的氨基和羧基后，菌體對(duì)鎘離子的吸附能力顯著下降[37]；Endo等[12]報(bào)道了通過化學(xué)修飾中和羧基中的負(fù)電荷，會(huì)降低發(fā)酵乳桿菌對(duì)鎘和鉛的結(jié)合。李暢[35]證明了細(xì)胞組成成分參與鉛離子與乳酸菌的相互作用，羧基等活性官能團(tuán)參與鉛的吸附過程；Zhang Dan等[29]研究了植物乳桿菌1.006 5的肽聚糖在和丙烯酰胺結(jié)合過程中起到重要作用，肽聚糖中包含C－O的羧基、多糖和芳烴共3 種基團(tuán)參與丙烯酰胺的結(jié)合。TTX因?yàn)槠浠瘜W(xué)結(jié)構(gòu)的特殊性，胍基是主要的正電中心[38]，使得TTX整體帶正電荷，而羧基帶負(fù)電，化學(xué)修飾中和羧基會(huì)使菌體表面負(fù)電荷減少，降低鼠李糖乳桿菌與TTX結(jié)合的概率，因而掩蔽羧基會(huì)使得消減率下降。而掩蔽氨基樣品的TTX免疫活性消減率沒有明顯變化，則表明鼠李糖乳桿菌表面氨基對(duì)TTX的免疫活性消減作用的影響不大，其原因可能為化學(xué)修飾掩蔽氨基減少鼠李糖乳桿菌表面的部分正電荷，破壞菌體和TTX之間的靜電平衡，增加鼠李糖乳桿菌與TTX的結(jié)合概率，因而掩蔽氨基會(huì)使得消減率有所增加，但變化不明顯。因此，鼠李糖乳桿菌表面的羧基為結(jié)合TTX的主要位點(diǎn)。

圖5 鼠李糖乳桿菌的不同化學(xué)掩蔽基團(tuán)消減TTX的消減率Fig.5 Reduction percentage of TTX immunological activity by L.rhamnosus with masking of different chemical groups

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)通過研究活菌、滅活菌和破碎狀態(tài)的鼠李糖乳桿菌對(duì)TTX免疫活性的消減作用，發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌與TTX的結(jié)合和鼠李糖乳桿菌的活性無關(guān)，可能是由鼠李糖乳桿菌與TTX間的相互作用所致。通過分析鼠李糖乳桿菌的不同組分對(duì)TTX的消減作用，發(fā)現(xiàn)菌體表面的肽聚糖是TTX的主要結(jié)合部位，因此對(duì)菌體表面的氨基和羧基官能團(tuán)進(jìn)行化學(xué)掩蔽，結(jié)合FTIR分析發(fā)現(xiàn)TTX與菌體表面肽聚糖的結(jié)合位點(diǎn)是肽聚糖上的羧基。因此鼠李糖乳桿菌與TTX通過肽聚糖的羧基而結(jié)合是消減TTX免疫活的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)為河豚魚加工副產(chǎn)物的無害化處理提供理論支撐，為海洋生物毒素的去除機(jī)理探究提供參考。