劉燕妮 毛芙蓉 范慧冬 鄭士金 侯柏森

摘要：以番茄細(xì)菌性潰瘍病病菌的特異性基因cytC為檢測(cè)靶標(biāo)，以番茄潰瘍病病菌等8種病原細(xì)菌為供試菌株。根據(jù)檢測(cè)靶標(biāo)設(shè)計(jì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）引物并進(jìn)行特異性和靈敏度檢測(cè)。結(jié)果顯示，引物cytC-170能特異性檢測(cè)出番茄潰瘍病病菌，檢測(cè)靈敏度高達(dá)5×105 copy/μL，環(huán)引物的加成將試驗(yàn)進(jìn)程縮短為33.06 min，使整個(gè)反應(yīng)控制在50 min內(nèi)。研究建立的LAMP檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果可視，非常適用于番茄細(xì)菌性潰瘍病病菌的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：番茄潰瘍病病菌;LAMP;特異性;檢測(cè);cytC基因;加環(huán)試驗(yàn)

中圖分類(lèi)號(hào)：S436.412.1+9?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）11-0072-04

收稿日期：2020-09-01

基金項(xiàng)目：吉林省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（20140204032NY）。

作者簡(jiǎn)介：劉燕妮（1988—），女，山東青島人，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)槭卟瞬『C合防治。E-mail：704870590@qq.com。

通信作者：毛芙蓉，碩士，副研究員，研究方向?yàn)槭卟瞬∠x(chóng)害綜合防治。E-mail：5155885@qq.com。

番茄細(xì)菌性潰瘍病病菌是我國(guó)禁止入境的檢疫性有害微生物，1954年我國(guó)首次報(bào)道該病害，之后便迅速蔓延，現(xiàn)在在黑龍江、吉林、山東、遼寧、河北、四川等地均有發(fā)生，每年給番茄帶來(lái)25%～75%的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約著番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。番茄細(xì)菌性潰瘍病由密執(zhí)安棒狀桿菌密執(zhí)安亞種（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis，以下簡(jiǎn)稱(chēng)為Cmm）引起，除侵染番茄外，還可侵染辣椒、裂葉茄、龍葵、煙草、天仙子等47種茄科植物[1-2]。這些植物的病殘?bào)w都可作為病害再次流行的初侵染源。有關(guān)報(bào)道表明，當(dāng)番茄體內(nèi)的病菌濃度達(dá)到1×108～1×109 CFU/mL時(shí)，番茄就會(huì)表現(xiàn)出被害癥狀[3]，當(dāng)番茄種子的帶菌率達(dá)1%以上時(shí)，便可引起病害的快速流行[4-5]。因此進(jìn)行番茄潰瘍病病菌的初期檢測(cè)并進(jìn)行有效防治是預(yù)防該病發(fā)生的最有效手段。

目前，針對(duì)番茄細(xì)菌性潰瘍病病菌的檢測(cè)方法主要有半選擇性培養(yǎng)基的富集培養(yǎng)[6]、菌株的致病性測(cè)定[7]、血清學(xué)檢測(cè)、DNA 探針[8]以及PCR[9]等方法，但這些檢測(cè)方法都存在操作復(fù)雜、準(zhǔn)確率低以及技術(shù)要求高等各方面的限制。本研究使用建立的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)方法對(duì)技術(shù)要求低、靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便，更適用于番茄細(xì)菌性潰瘍病病菌的早期檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本研究使用的菌株番茄細(xì)菌性潰瘍病病菌[Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis （Smith） Davis et al.]，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室自主分離和中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)種子病理中心提供;番茄青枯假單胞菌和茄青枯假單胞菌（Pseudomonas solanacearum E. F.Smith），均由廣東省微生物保存中心提供;黃瓜角斑病病菌[Pseudomonas syringae pv. lachrymans （Smith & Bryan） Yong，Dye & Wilkie]和西瓜果斑病病菌（Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. citrulli Schaad et al.），均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室提供;馬鈴薯環(huán)腐病病菌[Clavibacter michiganense subsp. sepedonicum （Spieckermann & Kotthoff） Davis，Gillaspie，Vidaver and Harris]和馬鈴薯瘡痂病病菌[Streptomyces scabies （Thaxte） Waks.et Henvici]，均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室自主保存。

1.2 培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g、蛋白胨5.0 g、酵母粉3.0 g、瓊脂粉16～18 g，定容至1 000 mL，調(diào)pH值至7.0，121 ℃滅菌30 min。LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g、酵母粉5.0 g、NaCl 10.0 g，定容至1 000 mL，調(diào)pH值至7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.3 LAMP反應(yīng)體系的建立

試驗(yàn)于2015年4—12月在吉林省蔬菜花卉科學(xué)研究院植物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。

1.3.1 細(xì)菌基因組DNA的提取

將供試菌株在NA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)至LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)至菌液濃度為108 CFU/mL。培養(yǎng)好的菌株使用細(xì)菌基因組提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取菌體DNA，并用ND 1000分光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 LAMP引物設(shè)計(jì)

根據(jù)PCR的試驗(yàn)結(jié)果[10]，針對(duì)特異性基因（cytC基因），使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)LAMP反應(yīng)內(nèi)外引物及環(huán)引物（表1）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成及純化。

1.3.3 LAMP反應(yīng)體系

利用設(shè)計(jì)的內(nèi)外引物及環(huán)引物（引物均稀釋到100 μmol/L），使用廣州華峰生物科技有限公司生產(chǎn)的通用型恒溫實(shí)時(shí)熒光試劑盒進(jìn)行LAMP反應(yīng)。反應(yīng)體系：2×LAMP reaction mixture 12.5 μL、熒光染料0.25 μL、Bst酶 0.5 μL、引物 1.0 μL （內(nèi)、外引物終濃度分別為1.6、0.2 μmol/L）、環(huán)引物 （100 μmol/L） 0.2 μL（終濃度為0.8 μmol/L）、DNA模板 2.0 μL，用水定容至25 μL。反應(yīng)程序：63 ℃，70 min。

1.3.4 加環(huán)后反應(yīng)體系

使用廣州華峰生物科技有限公司生產(chǎn)的凍干通用型恒溫實(shí)時(shí)熒光試劑盒進(jìn)行LAMP反應(yīng)。反應(yīng)體系：復(fù)溶液15 μL、引物1.0 μL（內(nèi)、外引物終濃度分別為1.6、0.2 μmol/L）、環(huán)引物（100 μmol/L） 0.2 μL （終濃度為0.8 μmol/L）、 DNA模板2.5 μL，用水定容至25 μL。反應(yīng)程序：63 ℃，70 min。

1.3.5 LAMP 方法引物篩選

將設(shè)計(jì)好的內(nèi)外引物加到反應(yīng)體系中進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，采用熒光定量PCR儀器進(jìn)行LAMP反應(yīng)，在每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)讀取熒光信號(hào)值，判斷引物擴(kuò)增效果。

1.3.6 LAMP 方法特異性檢測(cè)

使用表1中所列的LAMP反應(yīng)所需引物進(jìn)行特異性檢測(cè)，以無(wú)菌水為空白對(duì)照，驗(yàn)證LAMP檢測(cè)的特異性。結(jié)果通過(guò)3種不同的方法進(jìn)行判斷：將LAMP產(chǎn)物用2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè);采用熒光定量PCR儀器進(jìn)行LAMP反應(yīng)，在每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)讀取熒光信號(hào)值;將LAMP產(chǎn)物離心，使管蓋上的顯色物質(zhì)進(jìn)入產(chǎn)物，觀察顯色情況。

1.3.7 LAMP 方法靈敏度檢測(cè)

利用篩選出的引物組，對(duì)番茄潰瘍病病菌進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)LAMP反應(yīng)的靈敏度。提取番茄潰瘍病病菌的DNA，并進(jìn)行不同濃度的稀釋使其終濃度分別為5、50、5×102、5×103、5×104、5×105、5×106 copies/μL共7個(gè)濃度作為各個(gè)梯度的DNA 模板，以無(wú)菌水為空白對(duì)照進(jìn)行LAMP反應(yīng)的靈敏度檢測(cè)。結(jié)果判斷同“1.3.6”節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP引物篩選

使用設(shè)計(jì)引物cytC-170和cytC-49對(duì)Cmm進(jìn)行特異性擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示。引物cytC-170能擴(kuò)增出目的片段，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，而引物cytC-49 擴(kuò)增效果不理想，不能擴(kuò)增目的片段。因此選擇引物cytC-170進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2 LAMP檢測(cè)加環(huán)試驗(yàn)

對(duì)篩選出的cytC-170引物組進(jìn)行環(huán)引物加成處理，將處理后的引物組重新進(jìn)行LAMP反應(yīng)，通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果（圖2）可以看出，加環(huán)后擴(kuò)增時(shí)間從47.27 min縮減為33.06 min;反應(yīng)時(shí)間約縮短1/3，擴(kuò)增速度明顯加快，更有利于檢測(cè)的進(jìn)行。

2.3 cytC基因LAMP特異性檢測(cè)

利用供試菌株對(duì)篩選優(yōu)化的cytC-170引物組進(jìn)行特異性檢測(cè)，結(jié)果（圖3）顯示，3種檢測(cè)方法均證明cytC-170基因只能從Cmm樣品中獲得預(yù)期目標(biāo)產(chǎn)物，而在番茄青枯假單胞菌、黃瓜角斑病病菌等病原細(xì)菌中均不能獲得目標(biāo)片段，表明cytC-170基因能通過(guò)LAMP檢測(cè)的方法特異性檢測(cè)出番茄潰瘍病病菌。

2.4 cytC-170基因LAMP靈敏度性檢測(cè)

對(duì)篩選出的cytC-170引物組進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，結(jié)果（圖4）顯示：3種檢測(cè)方法均證明，當(dāng)病菌的濃度達(dá)到5×105 copies/μL時(shí)，cytC-170基因能很好地?cái)U(kuò)增出目的片段，可用于檢測(cè)Cmm。

3 討論與結(jié)論

番茄潰瘍病是一種系統(tǒng)性維管束病害，植株發(fā)病后病情可以隨流水、農(nóng)事操作等迅速蔓延，可能給番茄生產(chǎn)帶來(lái)毀滅性打擊。進(jìn)行番茄潰瘍病病菌的早期檢測(cè)預(yù)防能夠有效減少該病帶來(lái)的損失。有關(guān)報(bào)道表明，只有當(dāng)番茄植物體內(nèi)的Cmm濃度達(dá)到1×108～1×109 CFU/mL時(shí)，番茄才會(huì)表現(xiàn)出被害狀[3]，本研究建立的以cytC基因?yàn)闄z測(cè)靶標(biāo)的LAMP檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏度為5×105 copies/μL，遠(yuǎn)低于發(fā)病濃度，能夠達(dá)到早期檢測(cè)的要求。

針對(duì)番茄潰瘍病病菌的檢測(cè)廣大學(xué)者也進(jìn)行了廣泛研究，但是選擇培養(yǎng)基的富集培養(yǎng)[6]及接種紫茉莉葉片引起過(guò)敏性壞死反應(yīng)[7]存在耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn);血清學(xué)檢測(cè)及DNA探針、PCR等方法有效縮短了檢測(cè)時(shí)間。但是血清學(xué)檢測(cè)存在檢測(cè)靈敏度低;DNA探針不能區(qū)分致病與非致病菌株;PCR檢測(cè)存在耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)操作人員技術(shù)要求高等缺點(diǎn)，不適用于檢測(cè)的推廣。本研究選取了與致病性相關(guān)的cytC基因，而非高保守性的16S rRNA序列以及高變異性的ITS序列，有效避免了假陽(yáng)性。建立的LAMP檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單簡(jiǎn)便，只需要1臺(tái)恒溫水浴鍋便可完成;耗時(shí)短，反應(yīng)時(shí)間為33.06 min，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可控制在50 min內(nèi)，比常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光 PCR檢測(cè)能更早得到反應(yīng)結(jié)果。雖然PCR檢測(cè)的靈敏度要高于LAMP檢測(cè)，但是PCR檢測(cè)相對(duì)要求比較高，而LAMP檢測(cè)更快速、便捷，只需一個(gè)恒等溫的環(huán)境即可，更適用于生產(chǎn)應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1]Gleason M L，Gitaitis R D，Ricker M D. Recent progress in understanding and controlling bacterial canker of tomato in Eastern North Amercica[J]. Plant Disease，1993，77（11）：1069-1076.

[2]張慶萍，李玉民，席先梅. 番茄潰瘍病的發(fā)生與防治[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2012（6）：71-72.

[3]Gitaitis R D，Beaver R W，Voloudakis A E. Detection of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis in symptomles tomato transplants[J]. Plant Disease，1991，75：834-838.

[4]張滿(mǎn)良. 番茄潰瘍病的識(shí)別與綜合防治[J]. 西北園藝，2009（9）：41.

[5]李煥玲，石延霞，謝學(xué)文，等. 李寶聚博士診病手記（四十二）番茄潰瘍病的發(fā)生規(guī)律與防治技術(shù)[J]. 中國(guó)蔬菜，2011，1（23）：24-27.

[6]Ftayeh R M，von Tiedemann A，Rudolph KW E. A new selective medium for isolation of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis from tomato plants and seed[J]. Phytopathology，2011，101（11）：1355-64.

[7]Gitaitis R D. Induction of a hypersensitive like reaction in four-oclock by Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis[J]. Plant Disease，1990，74（1）：58-60.

[8]Dreier J，Meletzus D，Eichenlaub R. Characterization of the plasmid encoded virulence region pat-1 of phytopathogenic Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，1997，10（2）：195-206.

[9]毛芙蓉，李飛武，劉燕妮，等. 番茄細(xì)菌性潰瘍病菌的定性PCR檢測(cè)方法[J]. 北方園藝，2015（5）：128-131.