胡洪濤，朱志剛，周榮華，楊靖鐘，蔡興奎，顏冬冬

1.湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢 430064； 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院， 武漢 430070；3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193

馬鈴薯是世界第三、中國(guó)第四大糧食作物，隨著我國(guó)馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的實(shí)施，馬鈴薯種植面積快速增加，我國(guó)已成為世界馬鈴薯生產(chǎn)和消費(fèi)第一大國(guó)，年種植面積約560萬(wàn)hm2，年產(chǎn)量9 000多萬(wàn)t[1]，占世界馬鈴薯種植面積和產(chǎn)量的1/4左右，馬鈴薯產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展對(duì)我國(guó)糧食安全至關(guān)重要。馬鈴薯不僅是我國(guó)第四大糧食作物，同時(shí)也是我國(guó)大多數(shù)山區(qū)經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)縣的主要栽培作物[2]，因此，馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展不僅關(guān)系到我國(guó)糧食安全，而且對(duì)國(guó)家鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略順利實(shí)施也至關(guān)重要。馬鈴薯瘡痂病作為危害馬鈴薯重要病害之一，幾乎在我國(guó)所有馬鈴薯產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，發(fā)生程度呈逐年加重趨勢(shì)，尤其是在以蛭石為基質(zhì)的脫毒微型薯生產(chǎn)基地，連作地種薯患病率高達(dá)50%以上，種薯商品價(jià)值喪失殆盡。但截至目前，我國(guó)尚無(wú)正式登記針對(duì)瘡痂病的防治藥劑，說(shuō)明我國(guó)馬鈴薯瘡痂病的防控措施嚴(yán)重缺乏[3]，亟待研究馬鈴薯瘡痂病的防控方法和技術(shù)。

馬鈴薯瘡痂病(potato common scab)最早于1890年在美國(guó)康涅狄格州被發(fā)現(xiàn)[4]，現(xiàn)在已成為世界性土傳病害[5]，是馬鈴薯四大重要病害(晚疫病、粉痂病、瘡痂病、病毒病)之一，感染該病的薯塊表面會(huì)出現(xiàn)近圓形至不定形木栓化瘡痂狀淡褐色病斑或斑塊，呈凹陷、凸起或平狀，被害薯塊品質(zhì)、產(chǎn)量均顯著降低，種薯失去商品價(jià)值。目前，馬鈴薯瘡痂病在我國(guó)幾乎所有馬鈴薯產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，一般田塊發(fā)病率在30%左右，部分田塊發(fā)病率高達(dá)50%以上[6]，連作田、干旱地區(qū)、溫室種植的馬鈴薯發(fā)病更為嚴(yán)重。馬鈴薯由于易感病毒病，生產(chǎn)上多采用脫毒苗繁育而來(lái)的微型薯作為種子，而微型薯的生產(chǎn)多在以蛭石為基質(zhì)的溫室中進(jìn)行，由于蛭石價(jià)格昂貴，為節(jié)約成本種薯繁育單位多將蛭石重復(fù)使用，導(dǎo)致瘡痂病在種薯基地發(fā)生更為嚴(yán)重，發(fā)病率甚至高達(dá)80%以上[7-8]。由于無(wú)經(jīng)濟(jì)有效的防控措施，馬鈴薯瘡痂病發(fā)生面積和程度不斷加大，這不僅嚴(yán)重威脅著馬鈴薯種質(zhì)資源安全，也阻礙了馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的綠色健康發(fā)展。

馬鈴薯瘡痂病由鏈霉菌(Streptomyces)侵染引起，目前報(bào)道導(dǎo)致馬鈴薯瘡痂病的鏈霉菌有20多種，但大多數(shù)地區(qū)的致病菌以普通瘡痂鏈霉菌為主[9-10]。瘡痂鏈霉菌屬于放線菌科鏈霉菌屬、革蘭氏陽(yáng)性菌，此類菌大部分營(yíng)腐生生活，也能感染除馬鈴薯外的多種根莖類作物，如甜菜、胡蘿卜、花生等[11]。瘡痂鏈霉菌能產(chǎn)生孢子并依靠孢子進(jìn)行擴(kuò)散、感染寄主，土壤pH 5.5～7.5、相對(duì)濕度小于60%～70%、溫度20～22 ℃最有利于病原菌入侵[5]，而且馬鈴薯發(fā)病程度與塊莖生長(zhǎng)時(shí)間密切相關(guān)，生長(zhǎng)2～3周的幼薯最為感病[12]，當(dāng)塊莖表面木栓化后，發(fā)病程度大為減輕。土壤微生物是土壤環(huán)境重要成分，在養(yǎng)分循環(huán)和植物生長(zhǎng)中起著關(guān)鍵調(diào)控作用，而最近的研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯瘡痂病的發(fā)生程度與土壤微生物組成和功能緊密相關(guān)[13]，尤其是與土壤致病性的瘡痂鏈霉菌的豐度相關(guān)，說(shuō)明降低土壤病原菌數(shù)量是控制馬鈴薯瘡痂病的關(guān)鍵。土壤消毒是采用物理、化學(xué)等方法來(lái)殺滅土壤中的有害生物，從而控制土傳性病害、害蟲或者雜草的為害，其中以化學(xué)藥劑溴甲烷消毒效果最好，但由于溴甲烷對(duì)臭氧層的破壞作用而被全球禁用。棉隆是近年來(lái)在全國(guó)大面積推廣的消毒藥劑，實(shí)踐表明棉隆消毒對(duì)土傳性真菌病害[14]、細(xì)菌病害[15]、線蟲病害[16]、根腫病[17]等均有較好的防效，而采用棉隆土壤消毒對(duì)以蛭石為基質(zhì)種植的馬鈴薯瘡痂病的防控效果尚未見報(bào)道，同時(shí)也不清楚土壤消毒對(duì)蛭石中微生物的影響。為解決蛭石種植的馬鈴薯種薯繁育中瘡痂病防控難題，我們進(jìn)行棉隆土壤消毒聯(lián)合生物菌劑試驗(yàn)，并利用16S核糖體高通量測(cè)序技術(shù)研究其對(duì)蛭石微生態(tài)影響。

1 材料與方法

1.1 材 料

1)供試品種。馬鈴薯品種為中薯5號(hào)。

2)供試藥劑及主要試劑。98%棉隆細(xì)粒劑，江蘇南通施壯化工有限公司；2×108孢子/mL青霉菌34107水劑，湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心；5%中生菌素可濕性粉劑，福建凱立生物科技股份有限公司。土壤DNA提取試劑盒，美國(guó)MP Biomedicals公司；測(cè)序文庫(kù)制備試劑盒、TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit，美國(guó)Illumina公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1)微型薯瘡痂病田間藥效小區(qū)試驗(yàn)。試驗(yàn)在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)的微型薯繁育溫室大棚內(nèi)進(jìn)行，設(shè)6個(gè)處理，98%棉隆消毒處理(225 kg/hm2)(T1)，2×108孢子/mL青霉菌34107灌根(600 kg/ hm2)(T2)，5%中生菌素灌根(500倍液)(T3)，98%棉隆消毒(225 kg/hm2)聯(lián)合2×108孢子/mL青霉菌34107灌根(600 kg/ hm2)(T4)，98%棉隆消毒(225 kg/hm2)聯(lián)合5%中生菌素灌根(500倍液)(T5)，并設(shè)空白對(duì)照(T6)。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，共18個(gè)小區(qū)，小區(qū)長(zhǎng)5 m、寬6 m，面積為30 m2，小區(qū)隨機(jī)排列。于2020年6月18日進(jìn)行棉隆土壤消毒試驗(yàn)，操作方法參照文獻(xiàn)[17]，先將棉隆均勻撒到蛭石表面，然后采用小型旋耕機(jī)將棉隆翻入蛭石，澆水至60%左右的含水量后，蓋膜，處理21 d后，揭膜敞氣。微型薯組培苗播種時(shí)間為9月14日，播種后30 d，分別采用2×108孢子/mL青霉菌34107和5%中生菌素稀釋液灌根。馬鈴薯收獲時(shí)(11月28日)進(jìn)行病害分級(jí)鑒定，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和防治效果計(jì)算參照文獻(xiàn)[18]。田間試驗(yàn)藥效試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 22.0軟件、調(diào)用Duncan’s方法進(jìn)行方差顯著性分析。

2)樣品采集和蛭石中基因組DNA提取。于馬鈴薯收獲時(shí)，按照五點(diǎn)取樣法采集蛭石樣本，放入干冰,帶回實(shí)驗(yàn)室后保存于-80 ℃冰箱。蛭石微生物基因組DNA提取按照廠家說(shuō)明書執(zhí)行。

3)16S 核糖體基因高通量測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。細(xì)菌16S核糖體基因高通量測(cè)序以及數(shù)據(jù)分析參照文獻(xiàn)[19]所述方法進(jìn)行。簡(jiǎn)述如下，基因組DNA經(jīng)檢驗(yàn)合格后，利用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCA GCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGT WTCTAAT-3)引物對(duì)細(xì)菌16S核糖體基因V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，然后上機(jī)進(jìn)行測(cè)序，原始數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)量過(guò)濾后，與GreenGenes數(shù)據(jù)庫(kù)中的16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，以97%的相似性作為閾值進(jìn)行OTU(operational taxonomic units)劃分。采用PICRUSt軟件[19]對(duì)細(xì)菌OTU與KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)微型薯瘡痂病防控效果及經(jīng)濟(jì)效益分析

不同處理對(duì)微型薯瘡痂病防控效果及經(jīng)濟(jì)效益分析詳見表1。相比T6處理，各處理病情指數(shù)均顯著降低(P<0.05)，以T4處理最低(1.73)，其次為T5(5.72)和T1(6.26)，隨后是T2(10.73)，以T3處理最高(22.43)。種薯瘡痂病防效以T4處理最高(93.43%)，其次為T5(88.27%)、T1(86.72%)、T2(74.51%)，這4個(gè)處理之間無(wú)顯著差異(P<0.05)，以T3處理防效最低(65.10%)。商品薯數(shù)量以T4(348.3萬(wàn)個(gè)/hm2)、T5(334.1萬(wàn)個(gè)/hm2)、T1(326.1萬(wàn)個(gè)/hm2)最多，顯著高于T2(226.5萬(wàn)個(gè)/hm2)和T3(156.6萬(wàn)個(gè)/hm2)(P<0.05)。產(chǎn)值和經(jīng)濟(jì)效益也以T4、T5和T1最高，顯著高于其他處理。

表1 不同處理對(duì)種薯瘡痂病防效及產(chǎn)量、經(jīng)濟(jì)分析 Table 1 Control effects of minituber common scab by different treatments and analysis of yields and economic profits

2.2 不同處理蛭石中細(xì)菌組成分析

不同處理蛭石中細(xì)菌組成詳見圖1。各處理蛭石中細(xì)菌均以變形菌門(Proteobacteria)相對(duì)豐度最高,為0.51～0.84；其次為放線菌門(Actinobacteria)，相對(duì)豐度在0.042～0.230，以T6最高、T4最低；隨后為擬桿菌門(Bacteroidetes)，相對(duì)豐度為0.019～0.13，以T6最低、T4最高。

圖1 不同處理蛭石中細(xì)菌在門水平組成

層次聚類分析顯示(圖2)，在屬水平的細(xì)菌組成除T5和T6較為相似外，其余處理均有較大差異。在T2和T4處理中，假單胞桿菌屬(Pseudomonas)豐度較高，但相對(duì)豐度低于T4處理；T5和T6處理細(xì)菌組成較為類似，均以鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)豐度較高；T1處理中以假單胞桿菌屬、Mitsuaria、伴根瘤菌屬(Pararhizobium)等豐度較高；T3處理中以硫化細(xì)菌屬(Thiobacillus)和Saccharimonas豐度較高。

圖2 蛭石中細(xì)菌在屬水平的層次聚類分析

統(tǒng)計(jì)分析顯示，185個(gè)屬的豐度發(fā)生顯著變化(P<0.05)(圖3)。相對(duì)于T6，T1處理中112個(gè)屬豐度顯著性變化，其中38個(gè)屬顯著增加、74個(gè)屬顯著減少，豐度前三的屬分別為Mitsuaria、Cellvibrio、Acidovorax，增加倍數(shù)最大的為Mitsuaria(FC，fold changes,倍數(shù)變化)=12.6)，玫瑰色半光合菌屬(Roseateles,FC=11.6)，IMCC26134(FC=10.1)；顯著性下降有74個(gè)屬，豐度前三的是鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)、類諾卡菌屬(Nocardioides)、Pelomonas，下降倍數(shù)較大的是羅氏菌屬(Rhodanobacter，F(xiàn)C=-14.8)、unclassified-Rhodanobacteraceae細(xì)菌(FC=-13.1)、Amycolatopsis(FC=-12.8)。T2中共有112個(gè)屬顯著變化，55個(gè)屬顯著性上升、57個(gè)屬顯著下降，其中，豐度前三的是假單胞桿菌屬(Pseudomonas)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、德沃斯氏菌屬(Devosia)，上升倍數(shù)較大的是食酸戴爾福特菌(Delftia，F(xiàn)C=11.4)、Leucobacter(FC=10.5)、Nitrosomonas(FC=10.1)；下降倍數(shù)較大的是Phycicoccus(FC=-11.3)、Humibacter(FC=-11.2)、Mizugakiibacter(FC=-10.2)。T3處理中有88個(gè)屬豐度顯著變化，其中29個(gè)屬增加、59個(gè)屬下降；豐度前三的分別是硫化細(xì)菌(Thiobacillus)、Saccharimonas、Domibacillus，豐度增加倍數(shù)最大是硫化細(xì)菌(FC=13.0)、嗜甲基菌屬(Methylophilus，F(xiàn)C=11.9)、Parapusillimonas(FC=11.6)；下降倍數(shù)最大的是Rhodanobacter(FC=-14.8)、Pelomonas(FC=-14.4)、硝化螺旋菌(Nitrosospira，F(xiàn)C=-13.6)。T4處理中30個(gè)屬豐度顯著變化，均為顯著增加，其中，豐度最高的是假單胞桿菌、Massilia、黃桿菌(Flavobacterium)，豐度變化最大的是嗜甲基菌屬(Methylophilus，F(xiàn)C=10.4)、Pelagibacterium(FC=9.9)、Pseudacidovorax(FC=9.6)。T5處理中共58個(gè)屬顯著變化，其中25個(gè)顯著增加、33個(gè)顯著下降，豐度最高的3個(gè)屬是不動(dòng)桿菌屬、Pelomonas、羅氏菌屬，以Parapusillimonas(FC=8.3)、芽孢桿菌(Bacillus，F(xiàn)C=3.8)、Effusibacillus(FC=2.9)增加最多，而Humibacter(FC=-5.3)、Pseudoxanthomonas(FC=-2.7)、Conexibacter(FC=-2.2)減少最多。

圖3 豐度發(fā)生顯著變化的前10個(gè)屬

2.3 不同處理對(duì)蛭石中細(xì)菌多樣性的影響

不同處理對(duì)蛭石中細(xì)菌alpha多樣性影響較大(圖4)。相對(duì)于對(duì)照(T6)，棉隆處理(T1)和棉隆+中生菌素復(fù)合處理(T5)的蛭石細(xì)菌Chao1指數(shù)顯著降低(P<0.05)；而青霉菌34107單獨(dú)使用有所增加，棉隆+青霉菌34107復(fù)合處理有所降低，但都沒有達(dá)到顯著水平(P>0.05)。與Chao1指數(shù)類似，青霉菌34107處理蛭石Shannon指數(shù)有所增加，而棉隆+青霉菌34107處理有所降低，但均沒有達(dá)到顯著水平(P>0.05)；棉隆單獨(dú)處理、棉隆+中生菌素復(fù)合處理蛭石細(xì)菌Shannon指數(shù)均顯著降低(P<0.05)。

圖4 不同處理蛭石細(xì)菌多樣性指數(shù)

相對(duì)于T6(表2)，T1～T5分別有112、112、88、100和58個(gè)屬顯著變化，其中T2處理上調(diào)數(shù)量最多(55)、T5上調(diào)數(shù)量最少(25)；T1中下調(diào)數(shù)量最多(74)、T4處理下調(diào)最少(0)。在這些屬當(dāng)中，92個(gè)屬(49.5%)存在于所有6個(gè)處理，僅少數(shù)(1～20)存在不同處理的交集中(圖5)。

表2 不同處理豐度發(fā)生顯著性變化屬的數(shù)量 Table 2 Number of genera with significant changes in different treatments

圖5 不同處理在屬水平交集的數(shù)量

2.4 蛭石中鏈霉菌與其他細(xì)菌相關(guān)性分析

相關(guān)性分析(P<0.01，R>0.6)結(jié)果顯示(圖6)，蛭石中鏈霉菌豐度與55個(gè)屬細(xì)菌呈顯著正相關(guān)，相關(guān)性最大前5位分別是中慢生根瘤菌(Mesorhizobium，r=0.979 5)、Solirubrobacter(r=0.939 9)、Acidipila(r=0.939 0)、Ellin6067(r=0.937 4)、包層不黏柄菌(Asticcacaulis，r=0.936 3)，而與Dyadobacter(r=-0.783 2)、Pedobacter(r=-0.759 9)、Paenarthrobacter(r=-0.742 2)等8個(gè)屬豐度呈顯著負(fù)相關(guān)。

1.Mesorhizobium； 2.Solirubrobacter； 3.Acidipila； 4.Ellin 6067； 5.Asticcacaulis； 6.IMCC 26256； 7.Pelomonas； 8.Xanthobacter； 9.Sphingomonas； 10.Pseudolabrys； 11.Luteimonas； 12.Kribbella； 13.Unclassified-Sphingomonas； 14.Acinetobacter； 15.AKYG 1722； 16.Rhodanobacter； 17.Elstera； 18.Unclassified-Pedosphaeraceae； 19.Dyella； 20.Ideonella； 21.Polycyclovorans； 22.Methyloversatilis； 23.Jatrophihabitans； 24.Mizugakiibacter； 25.Tumebacillus； 26.Methylobacillus； 27.Unclassified-Rhodanobacter； 28.Geothrix； 29.Intrasporangium； 30.Nitrosospira； 31.Afipia； 32.Hyphomicrobium； 33.Luteibacter； 34.Micromonospora； 35.Rhizobium； 36.Terrabacter； 37.Nitrobacter； 38.Angustibacter； 39.Candidatus_Kaiserbacteria； 40.Arenimonas； 41.Longimicrobium； 42.Mycobacterium； 43.Gemmatimonas； 44.Unclassified-Vermiphilaceae； 45.Sporolactobacillus； 46.Promicromonospora； 47.Paucibacter； 48.Aquabacterium； 49.Marmoricola； 50.Effusibacillus； 51.Lysobacter； 52.Leifsonia； 53.Humibacter； 54.Amycolatopsis； 55.Nocardioides； 56.Methylophilus； 57.Microbacterium； 58.Achromobacter； 59.MM2； 60.Noviherbaspirillum； 61.Pedobacter； 62.Paenarthrobacter； 63.Dyadobacter.

3 討 論

馬鈴薯瘡痂病是既可種傳、也可土傳的病害，但蛭石栽培的脫毒微型薯瘡痂病菌主要來(lái)源于蛭石菌。因此，清除蛭石中的病原菌對(duì)防控微型薯瘡痂病非常關(guān)鍵。棉隆是一種廣譜性農(nóng)藥，在土壤中能分解出異硫氰酸甲酯、甲醛和硫化氫等物質(zhì)，對(duì)土壤中線蟲、真菌、細(xì)菌等均有殺滅作用，實(shí)踐證明其對(duì)生姜青枯病[15]等具有較好的效果，但對(duì)土壤微生物多樣性和土壤酶活性有抑制作用[14]。本研究通過(guò)田間試驗(yàn)，探索棉隆消毒及與生物藥劑配合使用對(duì)蛭石栽培微型薯瘡痂病的防控效果，并對(duì)其微生態(tài)效應(yīng)進(jìn)行了分析。結(jié)果證明，棉隆消毒與青霉菌34107灌根聯(lián)合使用，對(duì)微型薯瘡痂病防控效果最好，高于棉隆與中生菌素聯(lián)合使用，也高于單用棉隆，商品微型薯數(shù)量、產(chǎn)值和經(jīng)濟(jì)效益也明顯增加。同時(shí)，蛭石中假單胞桿菌等有益微生物顯著提升、微生態(tài)多樣性也相比單用棉隆有顯著提升，說(shuō)明棉隆消毒與青霉菌聯(lián)合使用防控蛭石栽培的微型薯瘡痂病具有較好的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效應(yīng)。由于蛭石栽培的微型薯瘡痂病源主要來(lái)源于蛭石，因此，消滅蛭石中病原菌，對(duì)于防控該病非常關(guān)鍵。但單用棉隆消毒，可能不能完全殺滅蛭石中的病原菌，殘存的病原菌可能會(huì)導(dǎo)致部分微型薯發(fā)病，而生物菌劑灌根可以起到抑制病原菌感染，同時(shí)也能促進(jìn)土壤微生物多樣性發(fā)展。所以，棉隆與生物菌劑聯(lián)用取得較好的效果。長(zhǎng)期以來(lái)，馬鈴薯瘡痂病的防控主要以噴施農(nóng)用硫酸鏈霉素為主，但由于交互抗性和環(huán)境食品安全等問(wèn)題，2016年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已經(jīng)嚴(yán)禁其在農(nóng)業(yè)上應(yīng)用。由于缺乏經(jīng)濟(jì)有效的防控方法，馬鈴薯瘡痂病成為原種繁育的關(guān)鍵制約因子。本研究結(jié)果通過(guò)聯(lián)合棉隆消毒和青霉菌生物防治對(duì)微型薯瘡痂病取得較好的防效，對(duì)保障馬鈴薯原種繁育具有積極意義。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯瘡痂病的發(fā)生與土壤細(xì)菌數(shù)量、種類和豐富度相關(guān)[20]，然而，本研究發(fā)現(xiàn)蛭石中變形菌門的數(shù)量在處理后無(wú)顯著減少、反而有所增加，而與前人研究結(jié)果[20]相同的是，放線菌門數(shù)量有明顯減少，放線菌門減少主要是鏈霉菌數(shù)量減少，鏈霉菌在對(duì)照處理中占比很高，達(dá)到3.23%，這可能是蛭石中瘡痂病發(fā)生嚴(yán)重的關(guān)鍵因素[18]。通過(guò)相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)鏈霉菌的豐度與55個(gè)屬的細(xì)菌呈正相關(guān)，例如與中慢生根瘤菌的相關(guān)性達(dá)到0.979 5，呈極顯著正相關(guān)(P<0.001)，說(shuō)明瘡痂病的發(fā)生與蛭石中微生物密切相關(guān)，并且可能是多種微生物互作的結(jié)果[13]。因此，對(duì)土傳性病害的防控，不僅要減少病原菌的數(shù)量，同時(shí)也要恢復(fù)和重建健康土壤微生態(tài)，保持土壤微生態(tài)健康環(huán)境。