蘇皓瑀，劉春海，韓建林，陶春衛(wèi)，李 偉，董秀君

（遼寧菲迪飼料科技有限責(zé)任公司，遼寧 興城125100）

酸化劑是一種環(huán)保型飼料添加劑，無殘留、無耐藥性、無不良作用，具有抑菌效果，可通過提高消化酶的活性有效降低飼料在消化道中的pH值，從而改善營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。尚秀國等[1]研究表明，甲酸、富馬酸等對(duì)標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌（ATCC25922）、標(biāo)準(zhǔn)沙門氏菌（ATCC9120）、標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌（ATCC6538）的抑菌活性強(qiáng)。酸化劑具體分為兩大類，包括H3PO4、HCl及H2SO4等無機(jī)酸化劑，以及丁酸、檸檬酸、富馬酸等有機(jī)酸化劑。無機(jī)酸化劑的添加量難以把控，易損害器械。而有機(jī)酸化劑有良好的適口性，且可在體內(nèi)循環(huán)發(fā)揮良好作用，因此，有機(jī)酸在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用研究日趨普遍[2-6]。

植物精油作為一個(gè)潛在的抗生素替代物，可以抑制有害菌的生長(zhǎng)繁殖，甚至可直接殺死有害菌，從而達(dá)到抗菌作用[7]，同時(shí)具有調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)的作用及提高免疫力、抗氧化等功效[8-11]。因?yàn)槎呔哂幸志Ч?，因此設(shè)想二者復(fù)合可能效果更佳，故進(jìn)行試驗(yàn)以驗(yàn)證。由于有機(jī)酸的作用機(jī)理一致，本試驗(yàn)采用丁酸、月桂酸、辛酸及其衍生物等作為試驗(yàn)材料，采取二倍稀釋法，研究不同濃度酸化劑及其衍生物與植物精油復(fù)合對(duì)4種標(biāo)準(zhǔn)菌即致病性大腸埃希氏菌（BNCC 340977）、腸炎沙門氏菌（BNCC 192094）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（BNCC 185933）、金黃色葡萄球菌（BNCC 186067）的抑菌效果，從而為其作為抗生素替代品應(yīng)用于飼料中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 添加劑

植物精油（商品名為凈力安Ⅳ），主要成分有香芹酚、百里香酚、肉桂醛；酸化劑及其衍生物（辛酸、單辛酸甘油酯、月桂酸、單月桂酸甘油酯、丁酸和苯甲酸），樣品濃度為100 mg·mL-1，遼寧菲迪飼料科技有限責(zé)任公司提供。

1.2 試驗(yàn)菌種

致病性大腸埃希氏菌（BNCC 340977）、腸炎沙門氏菌（BNCC 192094）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（BNCC 185933）、金黃色葡萄球菌（BNCC 186067），均購買自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.3 主要儀器和培養(yǎng)基

高溫滅菌鍋（型號(hào)為BXM-30R）、恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)為SPX-250B-Z）、超凈工作臺(tái)（型號(hào)為SWCJ-2FD）、厭氧培養(yǎng)箱等（型號(hào)為HYQX-I）；營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、液體硫乙酸鹽培養(yǎng)基，均購買自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.4 菌懸液的制備

取凍存的菌種，接種于裝有50 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于37℃搖床中振蕩培養(yǎng)18~24 h；取凍存的菌種，接種于裝有50 mL液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基的三角瓶中，置于37℃搖床中振蕩培養(yǎng)18~24 h。采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)菌數(shù)量，制成1×107~1×108cfu·mL-1的菌懸液。

1.5 最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定

采用二倍稀釋法測(cè)定不同濃度酸化劑及其衍生物與植物精油復(fù)合對(duì)常見菌種的MIC，每個(gè)菌種做4組平行。

取11只滅菌試管，按順序編號(hào)，在第1管中加入1.6 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，其余各管均加入1.0 mL。然后在各個(gè)試管中加入添加劑復(fù)合物。第1管加入添加劑0.4 mL，混勻后吸出1.0 mL加入到第2管中。同樣的方法依次稀釋至第11管，棄去1.0 mL，第11管為生長(zhǎng)對(duì)照組。第1管濃度為10 000μg·mL-1，第2管濃度為5 000μg·mL-1，第3管的濃度為2 500μg·mL-1，以此類推。在第11管中加入0.4 mL乙醇，充分混合后加入1.0 mL菌懸液。用已滅菌的橡膠塞塞住試管口，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

培養(yǎng)24 h后觀察各試管的渾濁度，以試管中的培養(yǎng)液出現(xiàn)渾濁為有細(xì)菌生長(zhǎng)的標(biāo)志，即以某編號(hào)試管以下不再發(fā)生明顯混濁現(xiàn)象，這一試管的樣品濃度為該樣品對(duì)細(xì)菌的MIC。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物精油與辛酸復(fù)合物的抑菌效果

測(cè)定植物精油與辛酸不同質(zhì)量比復(fù)合時(shí)的MIC，結(jié)果見表1。

表1 植物精油與辛酸復(fù)合對(duì)四種常見菌的MICμg·mL-1

由表1可知，植物精油與辛酸質(zhì)量比為1∶5時(shí)對(duì)致病性大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC為156.250、78.125μg·mL-1。當(dāng)植物精油質(zhì)量一定時(shí)，隨著辛酸質(zhì)量的增加，對(duì)金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌的抑菌效果隨之升高，但不會(huì)一直升高，在植物精油與辛酸質(zhì)量比為1∶3時(shí)效果最好。

2.2 植物精油與單辛酸甘油酯復(fù)合的抑菌效果

測(cè)定植物精油與單辛酸甘油酯不同質(zhì)量比復(fù)合時(shí)的MIC，結(jié)果見表2。

表2 植物精油與單辛酸甘油酯復(fù)合對(duì)四種菌的MICμg·mL-1

由表2可知，植物精油對(duì)四種菌的MIC均為312.500μg·mL-1。在植物精油與單辛酸甘油酯質(zhì)量比為1∶5時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌、致病性大腸桿菌的抑菌效果最好。

對(duì)腸炎沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌效果不會(huì)隨單辛酸甘油酯質(zhì)量的增加而升高，在植物精油與單辛酸甘油酯質(zhì)量比為1∶3時(shí)對(duì)腸炎沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌效果最好，MIC分別為156.250、19.530μg·mL-1。

2.3 植物精油與月桂酸復(fù)合的抑菌效果

測(cè)定植物精油與月桂酸不同質(zhì)量比復(fù)合時(shí)的MIC，結(jié)果見表3。

表3 植物精油與月桂酸復(fù)合對(duì)四種菌的MICμg·mL-1

由表3可知，即植物精油∶月桂酸為1∶0時(shí)，植物精油對(duì)四種菌的MIC均為312.500μg·mL-1，植物精油與月桂酸1∶1復(fù)合時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌的MIC分別為39.062、312.500μg·mL-1；當(dāng)植物精油質(zhì)量一定時(shí)，隨著月桂酸質(zhì)量的增加，抑菌效果并沒有隨之增加。植物精油與月桂酸按質(zhì)量比1∶3復(fù)合時(shí)，對(duì)致病性大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC分別為39.062、9.765μg·mL-1，效果較好。

2.4 植物精油與單月桂酸甘油酯復(fù)合的抑菌效果

測(cè)定植物精油與單月桂酸甘油酯不同質(zhì)量比復(fù)合時(shí)的MIC，結(jié)果見表4。

表4 植物精油與單月桂酸甘油酯復(fù)合對(duì)四種菌的MICμg·mL-1

由表4可知，植物精油與單月桂酸甘油酯質(zhì)量比為1∶3、1∶5時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌、致病性大腸埃希氏菌的抑菌效果相同，植物精油與單月桂酸甘油酯質(zhì)量比為1∶1、1∶3時(shí)對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌效果相同，單月桂酸甘油酯對(duì)腸炎沙門氏菌的抑菌效果并不明顯。植物精油與單月桂酸甘油酯復(fù)合對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為19.530μg·mL-1，對(duì)致病性大腸埃希氏菌的MIC為39.062μg·mL-1，對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC為4.88μg·mL-1。

2.5 植物精油與丁酸復(fù)合的抑菌效果

測(cè)定植物精油與丁酸不同質(zhì)量比復(fù)合時(shí)的MIC，結(jié)果見表5。

表5 植物精油與丁酸復(fù)合對(duì)四種菌的MICμg·mL-1

由表5可知，植物精油與丁酸復(fù)合對(duì)金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌的抑菌效果并不明顯，抑菌效果并不隨著植物精油與丁酸的質(zhì)量比增加而增加，植物精油與丁酸質(zhì)量比為1∶2時(shí)對(duì)致病性大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC為156.250μg·mL-1。

2.6 植物精油與苯甲酸復(fù)合的抑菌效果

測(cè)定植物精油與苯甲酸不同質(zhì)量比復(fù)合時(shí)的MIC，結(jié)果見表6。

表6 植物精油與苯甲酸復(fù)合對(duì)四種菌的MICμg·mL-1

由表6可知，植物精油與苯甲酸的質(zhì)量比為1∶0、1∶2時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、致病性大腸埃希氏菌的抑菌效果相同，因此說苯甲酸對(duì)三種菌的抑菌效果并不明顯。植物精油與苯甲酸在質(zhì)量比為1∶2時(shí)對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌效果最好，MIC達(dá)156.250μg·mL-1。

3 討論與結(jié)論

3.1 單一植物精油與單一酸化劑的抑菌效果

單一植物精油具有抑菌效果，已經(jīng)被證實(shí)。王康莉等[7]的檢測(cè)結(jié)果表明，肉桂醛對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌有抑制作用，其MIC為1 560μg·mL-1，百里香酚對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌的MIC為1 560、3 130、1 560μg·mL-1。而韓乾杰等[10]也證實(shí)肉桂醛、百里香酚對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌具有抑菌效果。甲酸、富馬酸等對(duì)標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌、標(biāo)準(zhǔn)沙門氏桿菌、標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌的抑菌活性較強(qiáng)[1]。

3.2 復(fù)合植物精油的抑菌效果

根據(jù)前人試驗(yàn)結(jié)果，筆者認(rèn)為酸化劑復(fù)合植物精油具有協(xié)同作用，由試驗(yàn)結(jié)果得知，復(fù)合植物精油對(duì)金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、致病性大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的最小抑菌濃度為312.500μg·mL-1，由此可知，酸化劑與植物精油之間存在協(xié)同作用。

3.3 植物精油和酸化劑復(fù)合的抑菌效果

植物精油與辛酸、單辛酸甘油酯、月桂酸、單月桂酸甘油酯組成的復(fù)合植物精油對(duì)金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、致病性大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌效果比單獨(dú)的植物精油更強(qiáng)，而植物精油與苯甲酸的復(fù)合對(duì)金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、致病性大腸埃希氏菌的抑菌效果并不明顯，植物精油與丁酸復(fù)合對(duì)金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌抑菌效果并不明顯。