何 蕾，陰 晴，吳 亮，周亞玲，吳 瑤，戴曉玥，夏 雯

(1. 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212000； 2. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

肝膿腫是由細(xì)菌、真菌或寄生蟲等病原微生物引起的肝化膿性病變，其中以細(xì)菌性肝膿腫(bacterial liver abscess, BLA)最常見，占80%以上[1]。過去認(rèn)為大腸埃希菌是肝膿腫的主要致病菌，自1986年我國臺灣首次報(bào)道肺炎克雷伯菌肝膿腫(Klebsiellapneumoniaeliver abscess, KPLA)以來，近30年里，肺炎克雷伯菌逐漸取代大腸埃希菌成為東亞地區(qū)肝膿腫最主要的致病菌[2]。研究發(fā)現(xiàn)引起肝膿腫的肺炎克雷伯菌多為具有高黏液表型的高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae, hvKP)[3]，并且由hvKP導(dǎo)致的肝膿腫已被認(rèn)為是一種新的侵襲性疾病，可引起轉(zhuǎn)移性感染，如眼內(nèi)炎、腦膜炎、骨髓炎及壞死性筋膜炎等，嚴(yán)重時可危及患者生命[3-4]。為加強(qiáng)對肺炎克雷伯菌肝膿腫的認(rèn)識，本研究回顧性分析某院34例細(xì)菌性肝膿腫患者的臨床資料，比較KPLA和非肺炎克雷伯菌肝膿腫(NKPLA)的臨床特征差異，并探討肺炎克雷伯菌毒力基因攜帶情況，為臨床早期診斷及合理治療提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 研究對象為江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院2017年7月—2019年8月收治的34例細(xì)菌性肝膿腫患者。所有患者均符合以下診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]：①具有發(fā)熱、寒戰(zhàn)或腹痛等臨床癥狀；②影像學(xué)檢查結(jié)果(B超或CT)符合肝膿腫影像學(xué)特征；③血培養(yǎng)或膿液培養(yǎng)出致病菌；④經(jīng)皮肝穿刺或外科手術(shù)治療后證實(shí)；⑤排除阿米巴、結(jié)核性肝膿腫。根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果將細(xì)菌性肝膿腫患者分為肺炎克雷伯菌肝膿腫組(KPLA組)與非肺炎克雷伯菌肝膿腫組(NKPLA組)。

1.2 方法

1.2.1 研究方法 通過查閱患者病歷，對34例細(xì)菌性肝膿腫患者的臨床資料、實(shí)驗(yàn)室資料和影像學(xué)資料進(jìn)行回顧性分析。對從上述患者體內(nèi)分離的22株肺炎克雷伯菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)、耐藥基因檢測、黏液絲試驗(yàn)、莢膜血清分型及毒力基因檢測。

1.2.2 主要儀器及試劑 VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析儀(法國生物梅里埃生物公司)；PCR擴(kuò)增儀和凝膠電泳成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；2×PCR Master Mix預(yù)混液(南京諾唯贊生物科技有限公司)；DNA標(biāo)志物(上海捷瑞生物工程有限公司)；PCR引物由蘇州泓訊生物科技有限公司合成。

1.2.3 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn) 采用VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)配套的鑒定卡及藥敏卡對細(xì)菌進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)2019年標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果。

1.2.4 耐藥基因檢測 采用PCR擴(kuò)增法檢測細(xì)菌耐藥基因，引物參照文獻(xiàn)[6-8]合成，見表1。從血平板上挑取3～5個菌落于盛有300 μL滅菌ddH2O的EP管中振蕩混勻，煮沸10 min以裂解細(xì)菌，經(jīng)12 000 r/min離心10 min后收集上清即為DNA模板。PCR擴(kuò)增碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaNDM-1)、ESBLs基因(blaTEM、blaCTX-M-1)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后拍照。

1.2.5 黏液絲試驗(yàn)鑒定高黏液菌株 用接種環(huán)輕觸在血瓊脂平板上過夜生長的單個菌落并向外牽拉，同時測定形成的黏液絲長度。重復(fù)牽拉2次，若2次形成的黏液絲長度大于5 mm即判為陽性[4]。

1.2.6 莢膜血清分型、毒力基因檢測及高毒力肺炎克雷伯菌的確認(rèn) PCR擴(kuò)增法檢測7種莢膜血清型(K1、K2、K5、K16、K20、K54、K57)及9個毒力基因(rmpA、rmpA2、iucA、iroB、peg-344、terB、iutA、magA、wcaG)。引物參照文獻(xiàn)[9-12]合成，見表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后拍照。參照文獻(xiàn)[13]，將攜帶rmpA基因的高黏液肺炎克雷伯菌認(rèn)定為hvKP。

表1 莢膜血清型、耐藥基因及毒力基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 臨床特點(diǎn) 本研究共收集34份BLA患者的臨床資料，其中KPLA組22份，NKPLA組12份。KPLA組患者伴發(fā)糖尿病比率(59.1%)較高，而NKPLA組患者伴發(fā)膽道疾病比率(75.0%)較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 KPLA組與NKPLA組患者臨床特征比較

2.3 耐藥基因檢測結(jié)果 22株肺炎克雷伯菌中共檢出2種ESBLs基因(blaTEM和blaCTX-M-1)，未檢出碳青霉烯酶基因(blaKPC和blaNDM-1)。其中8株肺炎克雷伯菌檢出blaTEM基因，陽性率為36.4%；6株菌檢出blaCTX-M-1基因，陽性率為27.3%。22株肺炎克雷伯菌中有2株菌同時攜帶blaTEM、blaCTX-M-1基因，見圖1。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物；1：肺炎克雷伯菌ESBLs基因PCR產(chǎn)物電泳圖。

2.4 高黏液菌株鑒定試驗(yàn) 22株肺炎克雷伯菌黏液絲試驗(yàn)結(jié)果均為陽性，陽性率達(dá)100.0%。

2.5 莢膜血清分型及毒力基因攜帶結(jié)果 本研究22株肺炎克雷伯菌共檢出5種莢膜血清型，以K1血清型為主，占68.2%(15/22)；其次為K2型，占13.6%(3/22)；血清型K20、K54、K57檢出率均為4.5%(1/22)；未發(fā)現(xiàn)K5、K16血清型；另有1株未見分型。見圖2。

毒力基因攜帶結(jié)果顯示，22株肺炎克雷伯菌均攜帶rmpA基因，結(jié)合黏液絲試驗(yàn)結(jié)果，本研究中22株肺炎克雷伯菌均為hvKP。毒力基因以iucA、iroB、iutA和wcaG攜帶率最高，為100.0%；peg-344、terB、rmpA2和magA的攜帶率分別為95.5%、86.4%、72.7%、68.2%。見圖3。22株肺炎克雷伯菌均攜帶有毒力基因rmpA、iucA、iroB、iutA。K1血清型以9種毒力基因同時攜帶為主；在K2和K57血清型中rmpA+rmpA2+wcaG+iucA+iroB+peg-344+terB+iutA是主要的攜帶模式；K20、K54和未知血清型均為rmpA+wcaG+iucA+iroB+peg-344+terB+iutA。見表3。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物；1～5：K1、K2、K20、K54、K57部分陽性結(jié)果電泳圖。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物；1～9：rmpA、magA、wcaG、iutA、rmpA2、peg-344、iroB、iucA、terB部分陽性結(jié)果電泳圖。

表3 不同莢膜血清型攜帶毒力基因情況

3 討論

肺炎克雷伯菌屬于革蘭陰性桿菌，可引起肺炎、尿路感染、血流感染等多種感染性疾病[14]。近年來，肺炎克雷伯菌己經(jīng)取代了大腸埃希菌，成為BLA的主要致病菌。目前由肺炎克雷伯菌所致的BLA已占肝膿腫的 43%～66%[15]。我國是BLA的高發(fā)國家之一，本研究結(jié)果表明，該院BLA患者多為中老年男性，肺炎克雷伯菌是其主要致病菌，占63.6%。與NKPLA組患者相比，KPLA好發(fā)于糖尿病患者，而NKPLA則好發(fā)于有膽道疾病或惡性腫瘤基礎(chǔ)病的患者，該結(jié)果提示不同致病菌引起的BLA可能與患者自身基礎(chǔ)疾病有關(guān)，而既往研究[16-17]也表明糖尿病是BLA的獨(dú)立危險因素，并且誘發(fā)糖尿病患者BLA的致病菌多為肺炎克雷伯菌。可能是由于糖尿病患者機(jī)體免疫力低下，長期的高血糖狀態(tài)抑制了白細(xì)胞的趨化和吞噬功能，有利于細(xì)菌的生長繁殖。此外長期的高血糖狀態(tài)會破壞血管壁，使機(jī)體局部循環(huán)障礙，導(dǎo)致機(jī)體對細(xì)菌的清除能力下降[18-19]。而NKPLA則更好發(fā)于膽道疾病和惡性腫瘤基礎(chǔ)上，除了因?yàn)闄C(jī)體免疫力降低，還可能是由于膽道梗阻、炎癥、解剖結(jié)構(gòu)的改變，使膽汁排泄受阻，腸道細(xì)菌更易于沿膽管進(jìn)入肝臟所致[20-21]。

肺炎克雷伯菌毒力因子主要有莢膜多糖、脂多糖、黏附素和鐵載體這四大類，其中莢膜多糖和鐵載體是其主要的毒力因子，也是導(dǎo)致hvKP具有特征性的主要因素。莢膜多糖有助于肺炎克雷伯菌抵抗宿主中性粒細(xì)胞吞噬，介導(dǎo)菌體逃避宿主免疫殺傷[26-27]。根據(jù)莢膜多糖(K抗原)分型，可將肺炎克雷伯菌分為78種莢膜血清型，其中K1、K2、K5、K16、K20、K54和K57被認(rèn)為是高毒力血清型，K1型和K2型最為常見且毒力最強(qiáng)[28]，其中K1型是亞洲地區(qū)最常見的血清型[29]。本研究中共檢出5種高毒力莢膜血清型，分別為K1、K2、K20、K54和K57，以K1型為主，占68.2%，與既往相關(guān)報(bào)道[29]相符，表明K1型是hvKP最常見的血清型。

本試驗(yàn)菌株攜帶的毒力因子主要為與莢膜多糖相關(guān)的毒力基因，如rmpA、rmpA2、magA、wcaG；與鐵載體相關(guān)的毒力基因，如iucA、iroB、terB、iutA。有研究發(fā)現(xiàn)magA與hvKP莢膜合成有關(guān)，僅存在于K1型菌中，被認(rèn)為是高黏液表型的介導(dǎo)因子[30]。Struve等[30]對菌株基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)檢出的K1型菌株數(shù)量與檢出攜帶magA基因的菌株數(shù)一致，可提示magA基因是K1型特有基因，與本研究結(jié)果一致。本研究中hvKP均攜帶有4種毒力基因：rmpA、iucA、iroB、iutA。據(jù)文獻(xiàn)[31]報(bào)道，賦予菌株高毒力表型最具特征性的毒力因子由毒力質(zhì)粒上存在的基因編碼，其中包括iuc、iro、peg-344、rmpA和rmpA2。毒力質(zhì)粒可直接影響hvKP的毒力，在hvKP的致病中發(fā)揮重要作用。Ye等[32]研究了從社區(qū)獲得性肝膿腫患者分離的40株hvKp菌株，所有菌株均具有iuc、iro、rmpA和rmpA2。本研究中hvKP主要攜帶有5種毒力基因可能是hvKP引起肝膿腫所不可缺少的基因。peg-344是hvKp特異性基因，位于hvKp毒力質(zhì)粒上，編碼內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。根據(jù)作為hvKP標(biāo)記的性狀的優(yōu)勢比，peg-344基因具有最高的準(zhǔn)確性、敏感性和特異性[31]。本研究中該基因在hvKP的攜帶率為95.5%。

綜上所述，該院KPLA多發(fā)于中老年男性及有糖尿病基礎(chǔ)的人群，其分離的肺炎克雷伯菌均為hvKP，以K1血清型為主，并攜帶多種毒力基因，目前對臨床常用抗菌藥物耐藥率低，但可攜帶耐藥基因。需引起臨床醫(yī)生高度重視，合理使用抗菌藥物，減少hvKP耐藥菌株的出現(xiàn)。