王呈,劉麗秋

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院腎病科,山東 青島 266003)

作為一種公認的可以模擬腎病綜合征的模型,阿霉素腎病具體機制尚不完全明確,其病理變化與人類腎病綜合征相類似。作為一種抗腫瘤藥物,由于具有多器官毒性,特別是腎臟毒性,阿霉素在臨床中的應(yīng)用被大大限制[1]。阿霉素誘導(dǎo)毒性的分子機制是多因素的,至今沒有完全確定。到目前為止,最被接受的理論之一是它與氧化應(yīng)激有關(guān)[2]。作為一種耐受性良好的降脂他汀類藥物,阿托伐他汀具有抗炎、抗氧化等作用。已有研究表明,他汀類藥物可以有效改善阿霉素引起的心臟毒性[3]。但是,阿托伐他汀對阿霉素引起的腎臟毒性的保護作用尚存在爭議[4]。Klotho蛋白具有抑制細胞凋亡、抗氧化、抑制纖維化、調(diào)節(jié)離子轉(zhuǎn)運等多種生物學(xué)作用,對細胞氧化應(yīng)激也具有保護作用[5]?；谝陨涎芯楷F(xiàn)狀,本研究對阿霉素腎病大鼠進行不同時間的阿托伐他汀干預(yù),檢測大鼠腎病進展情況,并檢測氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和總抗氧化能力(T-AOC)以及klotho蛋白的變化情況,探討阿托伐他汀對阿霉素腎病大鼠的保護作用及其對腎臟氧化應(yīng)激和klotho蛋白表達的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

雄性Wistar大鼠60只,8周齡,體質(zhì)量(250±15)g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,許可證號SCXK(京)2016-0006,飼養(yǎng)于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物房。阿霉素購自美國Med Chem Express,阿托伐他汀鈣片(立普妥,每片20 mg)購自輝瑞制藥有限公司。MDA、SOD 檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所,T-AOC試劑盒購自凱基生物公司,klotho抗體購自北京博奧森生物有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1阿霉素腎病大鼠模型建立及實驗動物分組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 周后,隨機選取20 只作為對照組,其余40只大鼠給予尾靜脈注射阿霉素10 mg/kg進行造模處理,對照組給予等量生理鹽水。1周后檢測大鼠24 h尿蛋白,與對照組大鼠相比,尿蛋白升高有統(tǒng)計學(xué)意義視為造模成功。造模過程中有4只大鼠死亡。將剩余36只大鼠隨機分為模型組和干預(yù)組,每組18只。干預(yù)組大鼠每天給予阿托伐他汀10 mg/kg灌胃處理,模型組及對照組大鼠每天給予1 mL/kg的生理鹽水灌胃處理,持續(xù)12周。每周稱體質(zhì)量1次,以調(diào)節(jié)藥物劑量。

1.2.224 h尿蛋白檢測 于實驗第4、8、12周,從每組隨機各取6 只大鼠放入清潔代謝籠中,留取24 h尿液,檢測24 h尿蛋白定量。實驗重復(fù)3次,取均值。

1.2.3腎臟標(biāo)本的制備及血清清蛋白檢測 于實驗第4、8、12周,每組隨機各取6只大鼠。麻醉后,切取一側(cè)腎臟,-80 ℃保存;另一側(cè)腎臟置于40 g/L中性甲醛溶液中固定,待制備石蠟切片后進行腎組織病理學(xué)觀察。同時于心臟取血,以4 000 r/min高速離心,取血清用溴甲酚綠法檢測清蛋白水平。

1.2.4腎組織病理學(xué)觀察 取出固定的腎臟組織,石蠟包埋后制備3μm 厚度切片。對切片進行二甲苯脫蠟處理,乙醇水洗,蘇木精染色,自來水沖洗,鹽酸乙醇分化,自來水浸泡,伊紅染色,常規(guī)脫水、透明、封片。用光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯BX51TF)對染色切片進行觀察分析。

1.2.5氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 采用脂質(zhì)過氧化比色試劑盒測定大鼠腎組織MDA 水平,采用黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)測定SOD 水平,使用722分光光度計通過比色測定T-AOC。

1.2.6實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測klothom RNA 用Trizol提取總RNA,用第一鏈cDNA 合成試劑盒從2μg總RNA 中合成第一鏈cDNA。用SYBR Green PCR 試劑在ABI 7500型熒光定量PCR 儀中,以第一鏈cDNA 為模板進行定量PCR。引物由Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計。Klotho-F 引物序列為5'-TTTGCCCTATTTCACCGAAG-3',klotho-R 引物序列為5'-CCTGACTGGGAGAGTTGAGC-3'。

1.2.7蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測klotho蛋白 從大鼠腎組織中提取蛋白質(zhì)并進行Western Blot分析。制備SDS-PAGE 凝膠,電泳后轉(zhuǎn)膜,加一抗和二抗進行抗體反應(yīng),曝光顯影,使用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)以表示,采用單因素方差分析(ANOVA)進行多組比較,然后采用LSD-t檢驗進行組間兩兩比較;相關(guān)性檢驗采用Spearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 造模后大鼠一般狀況

大鼠尾靜脈注射阿霉素1周后均出現(xiàn)不同程度腹瀉、食欲減退、消瘦、活動減少等表現(xiàn);2周后出現(xiàn)輕度水腫,以睪丸及足部最為明顯。

2.2 各組大鼠24 h尿蛋白定量及血清清蛋白比較

隨時間延長,模型組和干預(yù)組大鼠24 h尿蛋白定量進行性升高。實驗第4、8、12周時,模型組、干預(yù)組大鼠24 h尿蛋白定量高于對照組,干預(yù)組低于模型組,差異具有顯著性(F=242.285～1 412.89,P＜0.05)。模型組、干預(yù)組大鼠血清清蛋白水平低于對照組,而干預(yù)組高于模型組,差異具有顯著意義(F=58.265～240.54,P＜0.05)。見表1、2。

表1 各組大鼠24 h尿蛋白定量比較(n=6,m/mg,)

表1 各組大鼠24 h尿蛋白定量比較(n=6,m/mg,)

表2 各組大鼠不同時間血清清蛋白水平比較(n=6,ρ/g·L-1,)

表2 各組大鼠不同時間血清清蛋白水平比較(n=6,ρ/g·L-1,)

2.3 腎組織病理學(xué)觀察

大體觀察顯示:對照組大鼠腎臟外觀紅潤;模型組大鼠腎臟腫大,包膜緊張,外觀蒼白;干預(yù)組大鼠腎臟輕度腫大,顏色輕度暗淡,略有光澤。對大鼠腎臟進行蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察可見:模型組腎小球右側(cè)小管區(qū)無結(jié)構(gòu)、壞死,腎小管上皮細胞水腫,部分壞死、無核,管腔狹窄;干預(yù)組腎小管上皮細胞水腫減輕,壞死程度及范圍均小于模型組,細胞核損傷程度低于模型組。

2.4 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

隨時間推移,模型組大鼠腎組織MDA 水平逐漸升高,干預(yù)組則逐漸降低;而SOD 及T-AOC 的變化趨勢與MDA 相反。組間比較,模型組大鼠腎組織MDA 水平較對照組明顯升高,而干預(yù)組較模型組明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=20.43～161.64,P＜0.05);干預(yù)組大鼠腎組織SOD、T-AOC水平均高于模型組大鼠,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.97～604.10,P＜0.05)。見表3～5。

表3 各組大鼠腎組織MDA含量比較(n=6,b/μmol·g-1,)

表3 各組大鼠腎組織MDA含量比較(n=6,b/μmol·g-1,)

表4 各組大鼠腎組織SOD 含量比較(n=6,(z/m)/U·g-1,)

表4 各組大鼠腎組織SOD 含量比較(n=6,(z/m)/U·g-1,)

表5 各組大鼠腎組織T-AOC水平比較(n=6,z/kU·L-1,)

表5 各組大鼠腎組織T-AOC水平比較(n=6,z/kU·L-1,)

2.5 各組大鼠klotho m RNA 表達比較

模型組和干預(yù)組大鼠腎組織klothomRNA 表達較對照組降低,而干預(yù)組表達較模型組升高,差異有顯著性(F=253.21～964.23,P＜0.05)。見表6。

表6 各組大鼠腎組織klotho mRNA 表達比較(n=6,χ/%,)

表6 各組大鼠腎組織klotho mRNA 表達比較(n=6,χ/%,)

2.6 各組大鼠klotho蛋白表達比較

模型組大鼠腎組織klotho蛋白的表達隨時間推移而降低,但干預(yù)組大鼠腎組織klotho蛋白的表達隨時間推移而升高。組間比較,模型組和干預(yù)組大鼠腎組織klotho蛋白較對照組表達降低,而干預(yù)組較模型組表達升高,差異均具有顯著意義(F=173.88～821.60,P＜0.05)。見表7。

表7 各組大鼠腎組織klotho蛋白表達比較(n=6,χ/%,)

表7 各組大鼠腎組織klotho蛋白表達比較(n=6,χ/%,)

2.7 klotho蛋白表達與氧化應(yīng)激指標(biāo)關(guān)系

大鼠腎組織klotho蛋白表達與MDA 含量呈負相關(guān)(r=-0.728,P＜0.05),與SOD 含量和TAOC水平呈正相關(guān)(r=0.323、0.539,P＜0.05)。見圖1。

圖1 Klotho蛋白表達與氧化應(yīng)激指標(biāo)的相關(guān)性

3 討 論

阿霉素腎病模型是目前公認的腎病綜合征動物模型,其發(fā)生機制尚不完全明確,可能與氧化應(yīng)激有關(guān)。本實驗以Wistar大鼠為研究對象,應(yīng)用阿霉素進行造模,通過檢測大鼠24 h尿蛋白定量及血清清蛋白顯示,阿托伐他汀可降低阿霉素腎病大鼠尿蛋白水平,并一定程度提高血清清蛋白水平,且HE染色顯示,干預(yù)組病變較模型組減輕,這提示阿托伐他汀可改善阿霉素腎病的病理損害。

在阿霉素腎病模型中,氧化應(yīng)激是常見及重要的機制之一。MDA 可間接反映體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。在本實驗中,經(jīng)過阿霉素造模處理后,模型組大鼠腎組織中MDA 含量明顯升高,且隨時間推移逐漸增高。這是因為阿霉素腎病在無藥物治療情況下,會隨著時間推移而不斷進展惡化,所以MDA 含量會持續(xù)升高。而經(jīng)過阿托伐他汀干預(yù)后,干預(yù)組MDA 含量較模型組降低,并且隨時間推移而降低,表明阿托伐他汀可抑制氧化應(yīng)激。這與有關(guān)研究結(jié)果相吻合[6]。SOD 可以在分子、細胞水平防止和減輕機體組分受到過氧化損傷。Klotho蛋白可通過與胰島素樣生長因子(IGF)受體結(jié)合,增強SOD 活性[7]。在阿霉素腎病中SOD 活性受到抑制,故其清除氧自由基的作用明顯降低,氧自由基含量進一步升高[8]。阿霉素降低主動脈和腎臟SOD 的表達,可能是氧化應(yīng)激增強的原因之一。本實驗中模型組大鼠腎組織SOD 的表達持續(xù)降低,與TAKENAKA等[9]的研究結(jié)果相一致。在抗氧化能力評估中,TAOC 測量比單個抗氧化劑濃度測量更為可靠[10]。本實驗結(jié)果表明,阿霉素會影響正常大鼠的抗氧化能力,而阿托伐他汀則會改善阿霉素腎病大鼠減弱的抗氧化能力。

Klotho蛋白由腎小管分泌,從間質(zhì)進入Bowman囊和足細胞[11]。Klotho蛋白在腎臟中的表達水平最高[12],它參與腎臟離子通道和轉(zhuǎn)運體的調(diào)節(jié),以及腎臟1,25-二羥維生素D3的生成調(diào)節(jié)[13]。Klotho蛋白在維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面起著重要的作用[14],它通過抗炎癥、氧化應(yīng)激和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)[15],發(fā)揮對阿霉素腎病的保護作用。阿霉素腎病的發(fā)展可能與klotho的表達降低有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,阿托伐他汀會上調(diào)klotho蛋白在阿霉素腎病狀態(tài)下表達。Klotho表達的調(diào)節(jié)可能與Rho通路有關(guān)。有研究表明,阿托伐他汀可以增強klotho基因的表達[16]。YOON 等[17]研究認為,抑制Rho及其下游靶點Rho激酶也可能是他汀類藥物發(fā)揮作用的機制之一。他汀類藥物可通過Rho A滅活大鼠內(nèi)髓質(zhì)集合管上皮細胞,從而上調(diào)klothom RNA 的表達。Klotho蛋白在腎病綜合征病人體內(nèi)水平的變化與氧化/抗氧化失衡有密切聯(lián)系,其表達水平下降可能是腎臟氧化損傷加重的原因之一。在氧化應(yīng)激情況下,klotho可通過上調(diào)熱休克蛋白70(HSP70)表達來應(yīng)對機體氧化應(yīng)激狀態(tài)[18]。所以,誘導(dǎo)klotho基因表達可以挽救氧化應(yīng)激所造成的腎組織損傷,而阿托伐他汀可能通過增強klotho的表達發(fā)揮抗氧化作用。

目前認為免疫反應(yīng)、炎癥細胞浸潤與腎病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),所以抗炎、抑制免疫治療是當(dāng)前許多腎病的主要治療方法。糖皮質(zhì)激素是現(xiàn)今應(yīng)用最為廣泛的免疫-炎癥抑制劑,但在臨床上經(jīng)常會遇到糖皮質(zhì)激素依賴或糖皮質(zhì)激素抵抗,目前尚無好的解決方法。過去人們比較關(guān)注他汀類藥物通過發(fā)揮降脂作用保護腎臟,近年來越來越多地關(guān)注他汀類藥物的抗炎、免疫調(diào)節(jié)等非降脂腎臟保護作用。他汀類藥物能夠改善血管內(nèi)皮細胞功能、抑制腎小球的增生肥大和腎小球系膜細胞增殖,并抑制系膜細胞轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、血管緊張素Ⅱ的表達和分泌,從而減少病人尿蛋白排泄量,改善其腎功能[19]。但是本實驗還顯示,阿托伐他汀可以調(diào)節(jié)腎臟中關(guān)鍵基因蛋白klotho的表達,改善阿霉素腎病的病理狀況,緩解其氧化應(yīng)激損傷,這為臨床上治療腎病綜合征提供了思路。但是本實驗還存在一定的不足,如樣本量小、確切機制未研究清楚,還需要進一步研究以得到更加確切的結(jié)論。

綜上,本實驗結(jié)果表明,阿托伐他汀可以延緩并改善阿霉素腎病大鼠腎臟病理損害。阿霉素腎病大鼠腎臟受到氧化應(yīng)激損傷,氧化應(yīng)激標(biāo)記物MDA、SOD 及T-AOC 異常表達,阿托伐他汀可一定程度糾正氧化應(yīng)激損傷,其作用機制可能與上調(diào)腎臟中klotho蛋白表達有關(guān)。