李倩倩,陳沉,劉曉涵,慈一帆,宋揚(yáng)

(青島大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,山東 青島 266073)

結(jié)直腸癌(CRC)是世界上第三大常見(jiàn)的癌癥,也是導(dǎo)致癌癥死亡的常見(jiàn)原因之一[1]。只有10%的CRC病例具有遺傳易感性,高達(dá)90%的病例無(wú)家族史或遺傳易感性[2]。與CRC 發(fā)展有關(guān)的環(huán)境因素包括吸煙、酗酒、肥胖、久坐的生活方式、2型糖尿病、紅肉的攝入、高脂肪飲食和纖維攝入量不足等。慢性炎癥也是CRC 發(fā)生的重要環(huán)境危險(xiǎn)因素之一[3]。有研究表明,一些促炎因子如干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)可以通過(guò)影響緊密連接(TJ)蛋白的表達(dá),誘導(dǎo)腸道黏膜屏障功能受損[4-5]。而腸道黏膜屏障功能受損,如腸上皮細(xì)胞完整性破壞、腸黏膜通透性增加等與炎癥相關(guān)[6]。腸道屏障功能受損和促炎因子共同作用,促進(jìn)了CRC的發(fā)生發(fā)展[7]。纖維素是一種不可溶性膳食纖維,主要存在于蔬菜和水果等植物組織中[8]。有研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)充纖維素可以減輕葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠炎癥,抑制其腫瘤的發(fā)生[9-10]。MOEN 等[11]的研究結(jié)果也表明,纖維素能夠降低氧化偶氮甲烷(AOM)誘導(dǎo)的A/J Min+小鼠的腫瘤負(fù)荷。纖維素具有抗炎和抗腫瘤作用,其可能的機(jī)制是改善了腸道屏障功能,但目前相關(guān)研究尚少。因此,本研究通過(guò)建立小鼠結(jié)直腸炎癥腫瘤模型,探討不同纖維素濃度膳食對(duì)結(jié)直腸腫瘤發(fā)生、炎癥及腸道屏障功能的影響。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

SPF級(jí)C57BL/6小鼠100 只,雄性,6～8 周齡,體質(zhì)量20～22 g,購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司(質(zhì)量合格證號(hào):37009200015329),飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室。AOM 購(gòu)自美國(guó)SIGMA 公司。DSS購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司。纖維素購(gòu)自北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司。小鼠飼料購(gòu)自江蘇南通特洛菲飼料科技有限公司,在標(biāo)準(zhǔn)AIN-93M 飼料的基礎(chǔ)上,脫去或調(diào)整纖維素含量制成含0、25、50及100 g/L 纖維素的AIN-93M 飼料。本研究經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)(倫審批件號(hào):QYFYWZLL25668)。

1.2 研究方法

1.2.1動(dòng)物模型制備 采用AOM/DSS建立結(jié)腸炎癥腫瘤模型。第1天,小鼠腹腔注射濃度為1 g/L的AOM 10 mg/kg,7 d后,飲水給予20 g/L 的DSS,自由飲水7 d,間隔14 d,循環(huán)3個(gè)周期,完成模型制備。

1.2.2動(dòng)物分組及其干預(yù)措施 將100 只雄性C57BL/6小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組(CG 組,標(biāo)準(zhǔn)AIN-93M 飼料喂養(yǎng))、模型組(MG 組,不含纖維素的飼料喂養(yǎng))、纖維素低劑量組(LCEG 組,含25 g/L纖維素飼料喂養(yǎng)),纖維素中劑量組(MCEG組,含50 g/L纖維素飼料喂養(yǎng))和纖維素高劑量組(HCEG 組,含100 g/L 纖維素飼料喂養(yǎng)),每組20只。用標(biāo)準(zhǔn)AIN-93M 飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,各組小鼠給予不同纖維素含量的AIN-93M 飼料,預(yù)防性飲食干預(yù)2周后,模型組及纖維素低、中、高劑量組小鼠建立AOM/DSS模型。實(shí)驗(yàn)期間,各組小鼠給予相應(yīng)的AIN-93M 鼠糧干預(yù),直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,實(shí)驗(yàn)持續(xù)13周。

1.2.3小鼠一般狀態(tài)及腫瘤發(fā)生情況觀察 每周記錄小鼠體質(zhì)量,每2 d記錄小鼠進(jìn)食進(jìn)水量,觀察各組小鼠精神、活動(dòng)、毛色、飲食和排泄物等情況。于末次干預(yù)后24 h,眼球摘除取血;頸椎脫臼處死小鼠,剝離結(jié)直腸組織,剖開(kāi)小鼠結(jié)直腸,記錄腫瘤發(fā)生數(shù)(腫瘤最大直徑≥2 mm),按下列公式計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=(模型組腫瘤平均數(shù)量-纖維素干預(yù)組腫瘤平均數(shù)量)/模型組腫瘤平均數(shù)量×100%。

1.2.4小鼠結(jié)直腸腫瘤組織Claudin-1、Occludin和閉鎖帶-1(ZO-1)m RNA 表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)方法分別檢測(cè)小鼠結(jié)直腸腫瘤組織Claudin-1、Occludin、ZO-1m RNA 表達(dá)水平。用TRIzol試劑提取組織總RNA,用IMPLEN 納米光度計(jì)、P-330 核酸檢測(cè)儀測(cè)定m RNA 濃度和純度。本研究中A260/A280比值范圍為1.90～2.00,說(shuō)明樣品質(zhì)量良好。使用Primer Script RT Reagent Kit和Bio-Rad My Cycler PCR 儀反向轉(zhuǎn)錄RNA(2μg)。PCR 引物序列見(jiàn)表1。PCR 通過(guò)Eppendorf Mastercycler EP梯度系統(tǒng)(Eppendorf)根據(jù)制造商說(shuō)明進(jìn)行操作。反應(yīng)體積20μL,進(jìn)行兩步循環(huán),包括95 ℃的變性步驟和60 ℃的退火/延伸聯(lián)合步驟。GADPH作為內(nèi)參基因。使用比較式2-△△ct計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取均值。

表1 PCR 引物序列及大小

1.2.5小鼠結(jié)直腸腫瘤組織Claudin-1、Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)小鼠結(jié)直腸腫瘤組織Claudin-1、Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)水平。取50～100 mg腫瘤組織,用無(wú)菌手術(shù)剪將組織剪成細(xì)小的碎片,然后加入含磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液,提取腫瘤組織的總蛋白。用BCA 蛋白測(cè)定法測(cè)定蛋白濃度。測(cè)定完成后向各組蛋白中加入上樣緩沖液,混勻,加熱使蛋白變性。蛋白冷卻后加入SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離,將分離后的蛋白分子轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。再用含脫脂奶粉的TBST 封閉2 h,漂洗3次,加入一抗孵育3～4 h,漂洗后加入二抗孵育2 h。加入ECL 發(fā)光液在Fusion FX5 顯影儀中顯影,得到目的蛋白條帶。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取均值。

1.2.6小鼠血清中TNF-α、白細(xì)胞介素-12(IL-12)和環(huán)氧化酶-2(COX-2)的檢測(cè) 按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,在酶標(biāo)儀上讀取450 nm 波長(zhǎng)處各孔吸光度值,按稀釋標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中細(xì)胞因子含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以表示,多組比較采用單因素方差分析(ANOVA),組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般狀態(tài)及腫瘤發(fā)生情況

除CG 組外,在飲水中加入20 g/L的DSS期間及之后1周內(nèi),其他各組小鼠均出現(xiàn)毛色無(wú)光澤,呈靜電樣改變,活動(dòng)減少,糞便性狀改變,以及稀便、脫肛、血便等癥狀。但隨著正常飲水,以上現(xiàn)象均會(huì)改善。CG、MG、LCEG、MCEG 和HCEG 組小鼠的存活率分別為100%(20/20)、55%(11/20)、75%(15/20)、85%(17/20)和90%(18/20)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后解剖小鼠,觀察并記錄腫瘤的發(fā)生情況。LCEG、MCEG、HCEG 組小鼠結(jié)直腸腫瘤數(shù)量較MG 組減少,MCEG、HCEG 組較LCEG 組減少,HCEG 組較MCEG 組減少,差異均有顯著意義(F=93.23,P＜0.05)。LCEG、MCEG 和HCEG 組的抑瘤率分別為47.06%、61.34%和73.95%。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠腫瘤發(fā)生情況的比較()

表2 各組小鼠腫瘤發(fā)生情況的比較()

與MG組相比較,a P ＜0.05;與LCEG 組比較,b P ＜0.05;與MCEG 組比較,c P＜0.05。

2.2 各組小鼠結(jié)直腸腫瘤組織Claudin-1、Occludin、ZO-1 m RNA表達(dá)比較

研究結(jié)果表明,MG 組小鼠結(jié)直腸腫瘤組織中的Claudin-1m RNA 表達(dá)水平較CG 組明顯升高,而LCEG、MCEG、HCEG 組Claudin-1m RNA 表達(dá)水平較MG 組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.34,P＜0.05)。MG 組小鼠結(jié)直腸腫瘤組織中的Occludin、ZO-1m RNA 表達(dá)水平較CG 組明顯降低,而MCEG、HCEG 組Occludin、ZO-1m RNA表達(dá)水平較MG 組明顯升高,差異均有顯著性(F=152.56、65.30,P＜0.05);MG 組和LCEG 組小鼠結(jié)直腸腫瘤組織中ZO-1、Occludinm RNA 表達(dá)水平差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠結(jié)直腸腫瘤組織Claudin-1、Occludin、ZO-1 mRNA表達(dá)影響()

表3 各組小鼠結(jié)直腸腫瘤組織Claudin-1、Occludin、ZO-1 mRNA表達(dá)影響()

與CG 組比較,a P＜0.05;與MG 組比較,b P＜0.05;與LCEG 組比較,c P＜0.05;與MCEG 組比較,d P＜0.05。

2.3 各組小鼠結(jié)直腸腫瘤組織Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)的比較

MG 組小鼠結(jié)直腸腫瘤組織中Claudin-1蛋白表達(dá)水平較CG 組明顯升高,LCEG、MCEG、HCEG組Claudin-1蛋白表達(dá)水平較MG 組明顯降低,差異均有顯著性(F=162.21,P＜0.05)。MG 組小鼠結(jié)直腸腫瘤組織中Occludin、ZO-1 蛋白表達(dá)水平較CG 組明顯降低,LCEG、MCEG、HCEG 組Occludin 蛋白表達(dá)水平較MG 組明顯升高,MCEG、HCEG 組ZO-1蛋白表達(dá)水平較MG 組明顯升高,差異均有顯著性(F=115.12、40.55,P＜0.05);而MG 組和LCEG 組小鼠結(jié)直腸腫瘤組織中ZO-1 蛋白表達(dá)水平差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。見(jiàn)圖1、表4。

表4 各組小鼠結(jié)直腸腫瘤組織中Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)的比較()

表4 各組小鼠結(jié)直腸腫瘤組織中Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)的比較()

與CG 組比較,a P＜0.05;與MG 組比較,b P＜0.05;與LCEG 組比較,c P＜0.05;與MCEG 組比較,d P＜0.05。

圖1 各組小鼠結(jié)直腸腫瘤組織Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)

2.4 各組小鼠血清中炎癥因子表達(dá)的比較

與CG 組相比,MG、LCEG、MCEG 和HCEG組小鼠血清中TNF-α、COX-2 的表達(dá)水平明顯升高,IL-12的表達(dá)水平明顯降低;與MG 組相比較,LCEG、MCEG 和HCEG組小鼠血清中TNF-α的表達(dá)水平明顯降低,IL-12 的表達(dá)水平明顯升高,MCEG 和HCEG 組小鼠血清中COX-2的表達(dá)水平明顯降低(F=43.15～243.45,P＜0.05)。MG 組和LCEG 組小鼠血清中COX-2的表達(dá)水平差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。見(jiàn)表5。

表5 各組小鼠血清中相關(guān)炎癥因子表達(dá)的比較(ρ/ng·L-1,)

表5 各組小鼠血清中相關(guān)炎癥因子表達(dá)的比較(ρ/ng·L-1,)

與CG 組比較,a P＜0.05;與MG 組比較,b P＜0.05;與LCEG 組比較,c P＜0.05;與MCEG 組比較,d P＜0.05。

3 討 論

研究表明,纖維素可以減輕腸道炎癥和抑制腫瘤發(fā)生[8-9]。本研究通過(guò)AOM/DSS誘導(dǎo)成功建立小鼠結(jié)直腸炎癥腫瘤模型,用含不同濃度纖維素的飼料進(jìn)行干預(yù),結(jié)果顯示,與MG 組相比,纖維素干預(yù)能夠使AOM/DSS誘導(dǎo)的CRC 小鼠的腫瘤數(shù)量降低,增加結(jié)直腸腫瘤的抑瘤率。另外,本研究還顯示,纖維素干預(yù)能夠影響小鼠結(jié)直腸腸道屏障功能。

TJ由跨膜蛋白(如Occludins、Claudins)和連接黏附分子以及外周膜蛋白(如zona occludens,ZO-1、-2、-3)等組成[10]。在健康狀態(tài)下,TJ蛋白能夠構(gòu)建一種動(dòng)態(tài)的腸道屏障,調(diào)節(jié)細(xì)胞間隙對(duì)水、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和電解質(zhì)的攝取。而TJ功能障礙可以破壞腸道屏障的完整性,促進(jìn)腸道炎癥以及結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生[11]。Claudin-1能啟動(dòng)TJ結(jié)構(gòu)的形成活性,其過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞分化,使腸黏膜受損[12]。Occludin在胞外環(huán)和跨膜區(qū)選擇性調(diào)節(jié)細(xì)胞間隙的通透性[13]。ZO-1能夠與Occludin相結(jié)合,調(diào)節(jié)細(xì)胞間隙通透性,在細(xì)胞間具有黏附作用[14]。下調(diào)ZO-1的表達(dá),能夠阻斷和破壞TJ復(fù)合體的完整性,增加上皮通透性[15]。

慢性炎癥和癌癥之間的聯(lián)系密切[2]。炎癥性腸病(IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD),該病病人患CRC 的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加[16]。有研究顯示,與健康對(duì)照組相比,UC 病人結(jié)腸組織中Claudin-1蛋白表達(dá)上調(diào)[17]。PORITZ等[18]的研究結(jié)果也顯示,UC病人結(jié)腸樣本中Claudin-1蛋白的表達(dá)增加,Occludin 蛋白的表達(dá)減少。KUCHARZIK等[19]的研究則顯示,UC 和CD 病人結(jié)直腸組織中的Occludin蛋白表達(dá)下調(diào)。SOLER 等[20]研究表明,在人類(lèi)和大鼠中,腸腫瘤周?chē)鷧^(qū)域的TJ通透性增加;在人類(lèi)腸道的腫瘤豐富區(qū)域TJ蛋白ZO-1和Occludin表達(dá)減少。纖維素能夠改善腸道黏膜屏障功能,抑制腸道炎癥及腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8-9]。與上述研究結(jié)果一致,本研究結(jié)果也顯示,AOM/DSS誘導(dǎo)的結(jié)直腸炎癥腫瘤模型小鼠結(jié)直腸腫瘤組織中Claudin-1的表達(dá)水平明顯升高,Occludin、ZO-1的表達(dá)水平明顯降低;纖維素干預(yù)后,Claudin-1的表達(dá)水平明顯降低,Occludin、ZO-1 的表達(dá)水平明顯升高。表明AOM/DSS誘導(dǎo)的結(jié)直腸炎癥腫瘤模型小鼠,其TJ功能受損,結(jié)直腸腸道屏障的完整性被破壞,而纖維素的干預(yù)使TJ功能得到一定程度的恢復(fù),從而保護(hù)腸道屏障的完整性。

腸黏膜屏障功能受損可能與腸道炎癥有關(guān),因此本研究還檢測(cè)了小鼠血清中的炎癥相關(guān)指標(biāo)。TNF-α可以通過(guò)增加肌球蛋白輕鏈激酶磷酸化影響TJ,降低上皮屏障功能[21]。本文研究結(jié)果顯示,AOM/DSS誘導(dǎo)的結(jié)直腸炎癥腫瘤模型小鼠血清中TNF-α的表達(dá)水平明顯升高,在纖維素干預(yù)后,小鼠血清中TNF-α的表達(dá)水平明顯降低,腸道炎癥改善。表明纖維素干預(yù)可能通過(guò)調(diào)控炎癥因子TNFα表達(dá),改善腸道屏障功能。IL-12在抗腫瘤免疫及抗感染免疫中起重要作用,與正常人相比,CRC 病人外周血中IL-12的表達(dá)水平明顯降低[22]。本研究中,IL-12在結(jié)直腸炎癥腫瘤模型小鼠血清中的表達(dá)水平明顯降低,在纖維素干預(yù)各組中的表達(dá)水平明顯升高。COX-2在炎癥過(guò)程中是重要的限速酶,其高表達(dá)與慢性炎癥和腫瘤的發(fā)生有關(guān)[23]。本研究結(jié)果顯示,在結(jié)直腸炎癥腫瘤模型小鼠血清中COX-2的表達(dá)水平明顯升高,在纖維素干預(yù)組中其表達(dá)水平明顯降低。可見(jiàn),纖維素干預(yù)可使結(jié)直腸炎癥腫瘤模型小鼠的腸道炎癥減輕。

綜上所述,纖維素干預(yù)能夠減少AOM/DSS誘導(dǎo)的模型小鼠的腫瘤數(shù);降低小鼠結(jié)直腸腫瘤組織中Claudin-1的表達(dá),升高Occludin、ZO-1的表達(dá),改善腸道屏障功能;降低小鼠血清中TNF-α、COX-2的表達(dá)水平,升高IL-12的表達(dá)水平,減輕腸道炎癥。纖維素干預(yù)可能通過(guò)改善AOM/DSS 誘導(dǎo)的結(jié)直腸炎癥腫瘤模型小鼠的腸道屏障功能,減輕其腸道炎癥,而抑制結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生。但相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。