孫艷秋，劉 健，忻 凌，周 琴，陳曉露，丁 香，張先恒

1安徽中醫(yī)藥大學研究生院，安徽 合肥 230031；安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院2風濕科，3信息中心，安徽 合肥230031

類風濕關節(jié)炎（RA）是一種以對稱性多關節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)，以關節(jié)滑膜慢性炎癥、關節(jié)的進行性破壞為特征的自身免疫疾病［1-3］。RA發(fā)病與遺傳、環(huán)境、應激等因素有關，能異常誘導激活固有免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)，導致免疫耐受破壞而誘發(fā)一系列炎癥反應［4,5］。RA 病變可累及全身多系統(tǒng)，其全球發(fā)病率為0.5%～1.0%，我國大陸發(fā)病率為0.42%，具有較高發(fā)病率和致殘率［6］。RA發(fā)病機制雖尚不明確，但氧化應激（OS）及免疫炎癥反應在RA發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［7-9］。長鏈非編碼RNA（lncNA）參與RA炎癥、凋亡、氧化應激等過程，已成為研究的熱點［10,11］。本團隊前期通過高通量測序及生物信息學分析，認為Linc00638是參與RA炎癥反應及氧化應激的關鍵lncRNA［12,13］。RA體內氧化、抗氧化作用失衡，導致大量氧化中間產(chǎn)物ROS自由基的產(chǎn)生，抗氧化能力減弱，進一步加重炎癥反應、引起組織損傷［14,15］。目前國內外關于Linc00638的研究較少且主要集中于腫瘤方面報導，缺乏Linc00638在RA中研究，以及如何參與RA免疫炎癥反應、氧化應激的調控過程。

本研究主要是研究Linc00638在RA患者的表達，分析其與臨床指標的的相關性，進一步通過細胞實驗，采用RA 患者滑膜成纖維細胞（RA-FLS）探究Linc00638干擾或過表達狀態(tài)下對RA-FLS炎癥和氧化應激的影響。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

35例RA患者來自2020年6月～2020年10月安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院風濕免疫科住院患者（RA組），其中男性5例，女性30例，年齡56.03±12.43歲；20例正常人為健康對照組（HC組）來自我院健康體檢中心，其中男性3例，女性17例，年齡56.25±7.33歲，兩組基線差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準（2019AH-12）。

選取患者入院后首次檢查的實驗室指標，具體指標如下：炎癥指標：血沉（ESR）、C反應蛋白（CRP）；免疫指標：類風濕因子（RF）、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（Anti-CCP）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、補體C3（C3），補體C4（C4），并計算RA患者DAS28評分。

1.2 診斷標準

所有患者均符合2010年美國風濕病學會（ACR）聯(lián)合歐洲抗風濕病聯(lián)盟（EULAR）提出的RA 診斷標準［16］。

1.3 納入及排除標準

納入標準：符合上述診斷標準。排除標準：入院后后無相應實驗室指標者；未成年、妊娠期及哺乳期患者；合并其他風濕病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎等及合并心血管、血液系統(tǒng)等疾病者。

1.4 RA-FLS培養(yǎng)及轉染

RA 患者原代滑膜成纖維細胞經(jīng)SV40 過表達慢病毒轉染而成的永生化細胞系。在青霉素（終濃度為100 U/mL）和鏈霉素（終濃度為0.1 mg/mL）的RPMI 1640 培養(yǎng)基，5%CO2、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達70%即可傳代。根據(jù)制造商的說明，將pcDNA3.1-Linc00638、si-Linc00638與各自陰性對照用Li-pofectamine2000轉染至RA-FLS中，繼續(xù)孵育48 h。pcDNA3.1-Linc00638、si-Linc00638與各自陰性對照質粒（GenePharma）。

1.5 實驗試劑及儀器

DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone）；白介素4 ELISA試劑盒（武漢基因美），白細胞介素6 ELISA試劑盒（武漢基因美），超氧化物歧化酶ELISA試劑盒（南京建成），A001-1；活性氧（ROS）檢測試劑盒（上海貝博）；CCK8檢測試劑盒（上海貝博），逆轉錄試劑盒（TaKaRa）；熒光定量PCR儀（Thermo Scientific，型號：PIKOREAL 96）；高速臺式冷凍離心機（安徽嘉文儀器裝備有限公司，型號：JW-3021HR）；酶標儀（雷杜生命科學股份有限公司，型號：RT-6000）。

1.6 實驗方法

1.6.1 ELISA檢測IL-4、IL-6、ROS、SOD表達 收集各組細胞培養(yǎng)上清液，1000 r/min離心10 min，棄去沉淀。將上清液加入酶標板中（每孔100 μL），37 ℃孵育1.5 h，采用ELISA方法，嚴格按照各試劑盒說明書進行操作，檢測IL-4、IL-6、ROS、SOD的表達。

1.6.2 RT-qPCR檢測Linc00638的表達 Trizol提取各組RA-FLS總RNA，逆轉錄反應，進行擴增反應，瓊脂糖凝膠電泳，采用Gelpro32 凝膠圖像分析軟件對PCR產(chǎn)物進行半定量分析，以β-actin表達量為參照采用2-△△Ct進行相對定量分析。引物：Linc00638正向引物為5'-CCATAGCCGATTAGCTGTCA'，反向引物為5'-AAT GCCGAACTGGAGGTG-3'，β-actin正向引物為5'-CC CTGGAGAAGAGCTACGAG-3'，反向引物為5'-GGA AGGAAGGCTGGAAGAGT-3'。

1.7 CCK8檢測RA-FLS細胞活力

根據(jù)制造商的操作說明，用CCK8檢測試劑盒檢測細胞活力。以每孔3×104RA-FLSs接種到96孔板中，培養(yǎng)至70%～90%匯合。按上述方法轉染對數(shù)生長期細胞。每組3孔，分別培養(yǎng)0、24、48 h。在每個時間點，向每個孔中添加10 μL CCK-8溶液，并將細胞在37 ℃下培養(yǎng)1.5 h。酶標儀測定A450nm值來評估細胞活力。

1.8 統(tǒng)計學分析

SPSS 24.0 軟件進行統(tǒng)計學處理，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差表示，不合符正態(tài)分布，采用四分位數(shù)間距表示。正態(tài)分布則采用兩獨立樣本t檢驗，不符合正態(tài)分布，則采用秩和檢驗；采用Spearman進行相關性分析；IBM SPSS Modeler 18.0軟件中Apriri模塊進行關聯(lián)規(guī)則分析；GraphPad Prism 8.0.1軟件繪圖，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 受試者臨床特征

RA患者的平均DAS28評分為5.16±0.57分，與健康對照組相比，RA患者ESR、CRP、RF、anti-CCP、IgA和C4顯著升高（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義；兩組IgG、IgM和C3差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表1）。

表1 受試者臨床指標比較情況Tab.1 Comparison of the clinical indexes between healthy control(HC)subjects and RApatients

2.2 Linc00638在RA患者中低表達

為了研究Linc00638在RA患者中的表達，對35例RA組和20例HC組受試者的PBMCs進行RT-qPCR檢測。結果顯示，在RA中Linc00638的水平下調（圖1A）。進行受試者操作特征（ROC）曲線分析以評估Linc00638 的診斷效用，ROC 曲線下面積（AUC）為0.9186（95%CI:0.85～0.99）。根據(jù)Youden 指數(shù)，區(qū)分RA和HC的最佳截斷值為0.74，具有88.57%的敏感性和80.00%的特異性（圖1B）。

圖1 Linc00638在RA患者PBMCs中表達Fig.1 Expression of Linc00638 in PBMCs of RA patients.A:The expression of Linc00638 in PBMCs from RA patients was decreased (***P＜0.001 vs HC).B:ROC curve analysis of Linc00638 for diagnosis of RA.

2.3 RA患者PBMCs中IL-4、SOD低表達，IL-6、ROS高表達

與健康對照組相比，RA患者PBMCs中IL-4、SOD表達水平顯著降低（P＜0.01，圖2A、D），IL-6、ROS表達水平顯著升高（P＜0.01，圖2B、C）。

圖2 ELISA檢測炎癥因子、氧化應激指標Fig.2 Detection of inflammatory factors and oxidative stress indicators by ELISA.A:IL-4 was lowly expressed in PBMCs of RA patients.B:IL-6 was highly expressed in PBMCs of RA patients.C:ROS was highly expressed in PBMCs of RA patients.D:SOD was lowly expressed in PBMCs of RApatients.***P＜0.01.

2.4 Linc00638與年齡、病程、DAS28及免疫炎癥、氧化應激指標存在相關性

Spearman 相關性分析結果顯示，RA 患者Linc00638 與年齡、病程、DAS28、ESR、CRP、RF、anti-CCP 呈負相關（P＜0.05）；與IL-4、SOD 呈正相關（P＜0.05），與其他指標無相關性（P＞0.05，圖3A～I）。

圖3 Linc00638與指標的相關性分析Fig.3 Correlation analysis between Linc00638 and the clinical and biochemical indicators of RA patients.Linc00638 is negatively correlated with age(A),course of the disease(B),DAS28(C),ESR(D),CRP(E),RF(F),and anti-CCP(G),and positively correlated with IL-4(H)and SOD(I).

2.5 Linc00638的降低與高齡、長病程、免疫炎癥及氧化應激指標具有強關聯(lián)

RA患者Linc00638的下降與年齡（＞60歲）、病程（＞10年）、DAS28、ESR、RF、CRP及anti-CCP的升高具強關聯(lián)，支持度均大于40%，置信度均大于60%；Linc00638的下降與SOD、IL-4指標值的下降具有強關聯(lián)，支持度均大于65%、置信度均大于75%（表2）。

表2 Linc00638與年齡、病程、DAS28及實驗室指標的關聯(lián)規(guī)則分析Tab.2 Association rule analysis of Linc00638 with age,course of disease,DAS28 and laboratory indexes

2.6 Linc00638 在RA-FLS 中的表達及對細胞活力的影響

與pcDNA3.1-NC組相比，Linc00638組Linc00638表達顯著升高（P＜0.01）；與si-NC組相比，si-Linc00638組Linc00638表達顯著降低（P＜0.01，圖4A）。CCK8檢測Linc00638對RA-FLS細胞活力的影響，結果顯示，與pcDNA3.1-NC組相比，Linc00638組細胞活力明顯降低（P＜0.01）；與si-NC組相比，si-Linc00638組細胞活力明顯降低（P＜0.01，圖4B）。4組中si-Linc00638組細胞活力最高，Linc00638組細胞活力最低（圖4B）。

圖4 Linc00638在RA-FLS中的表達以及對細胞活力的影響Fig.4 Expression of Linc00638 in RA-FLS and its effect on cell viability.A:Expression level of Linc00638 in RA-FLS with Linc00638 overexpression or interference.B:Results of CCK8 assay for detecting viability of RA-FLS with Linc00638 overexpression or interference.***P＜0.01.

2.7 Linc00638對RA-FLS中IL-4、IL-6表達的影響

與pcDNA3.1-NC組相比，Linc00638組IL-4表達顯著升高，IL-6表達顯著下降（P＜0.05，圖5A、B）；與si-NC組相比，si-Linc00638組IL-4表達顯著降低，IL-6表達升高（P＜0.05，圖5A、B）。

圖5 Linc00638對RA-FLS中IL-4、IL-6表達的影響Fig.5 Effect of Linc00638 overexpression or interference on expressions of IL-4(A)and IL-6(B)in RA-FLS.**P＜0.05,***P＜0.01.

2.8 Linc00638對RA-FLS中ROS、SOD表達的影響

與pcDNA3.1-NC組相比，Linc00638組ROS表達顯著降低，SOD 表達顯著升高（P＜0.05，圖6A、B）；與si-NC組相比，si-Linc00638組ROS表達顯著升高、SOD表達降低（P＜0.05，圖6A、B）。

圖6 Linc00638對RA-FLS中ROS、SOD表達的影響Fig.6 Effect of Linc00638 overexpression or interference on expressions of ROS(A)and SOD(B)in RA-FLS.**P＜0.05,***P＜0.01.

3 討論

RA是一種病因復雜的炎癥性自身免疫疾病，氧化應激產(chǎn)生的自由基可作為氧化劑和炎癥介質參與RA的病理過程［17,18］。氧化損傷可以誘發(fā)RA患者體內炎癥反應，產(chǎn)生諸多炎癥因子如IL-6、TNF-α和IL-1β等，而自由基的增多，可造成氧化劑與抗氧化劑系統(tǒng)的紊亂，導致機體的抗氧化能力減弱，進一步加重炎癥反應［19,20］。本團隊以中醫(yī)學理論為指導，前期通過高通量測序、生物信息學分析及臨床驗證表明Linc00638是參與RA炎癥、氧化應激的關鍵lncRNA。目前國內外關于Linc00638的研究較少，缺乏在RA患者中的臨床及研究。本研究通過臨床試驗和細胞實驗，驗證Linc00638在RA濕熱痹阻證患者表達情況，以及參與調控炎癥與氧化應激的可能機制。

本研究表明Linc00638在RA患者PBMCs中表達顯著降低，ROC曲線下面積AUC為91%，表明Linc00638具備較高的診斷價值。細胞因子在RA的發(fā)病過程中調節(jié)炎癥過程，特別是一些促炎細胞因子，并在滑膜炎癥和滑膜增生中發(fā)揮重要作用，從而導致RA的軟骨和骨破壞［21,22］。秦文等［23］通過基因芯片篩選及生信學分析表明LINC00638、Uc011jsq.2和AK021458有可能參與了炎癥來源牙周膜干細胞（PPDLSCs）在力學信號介導下的成骨分化的作用。本研究中RA患者的IL-4、SOD水平降低，IL-6、ROS水平升高，表明患者存在炎癥因子失衡、氧化與抗氧化系統(tǒng)紊亂；相關性分析顯示Linc00638 與年齡、病程、DAS28、ESR、CRP、RF、anti-CCP呈負相關，與IL-4、SOD呈正相關，表明Linc00638與臨床免疫炎癥、氧化應激指標存在相關性。進一步通過關聯(lián)規(guī)則分析，得出同樣的結論，表明Linc00638與臨床免疫炎癥、氧化應激指標存在相關性。研究表明三陰性乳腺癌（TNBC）中FOLH1、LINC00638、OAS3 等是關于腫瘤預后的重要基因，其機制與T細胞激活免疫調節(jié)有關［24］；研究發(fā)現(xiàn)HCP5、LINC00638、TP53TG1等基因可能作為新生兒敗血癥的潛在標志物，與調節(jié)機體免疫應答過程有關［25］。

RA患者關節(jié)滑膜中聚集了大量炎性細胞并產(chǎn)生炎性因子，加重滑膜、軟骨的炎癥及骨破壞，進一步導致滑膜腔缺氧［26,27］。而細胞在代謝過程產(chǎn)生的ROS等有害自由基持續(xù)升高，產(chǎn)生了高水平的氧化應激。在氧化應激下，脂質過氧化改變細胞膜的滲透性，削弱膜基酶的活性，從而激活抗氧化酶［28-30］。為了進一步探究Linc00638在RA中發(fā)揮的潛在機制作用，本研究構建Linc00638的過表達質粒和小干擾RNA，成功轉染進入RA-FLS 并影響Linc00638 的表達。CCK8 結果表明Linc00638的過表達質粒能夠顯著降低RA-FLS細胞活力，而si-Linc00638能夠顯著提高細胞活力。過表達Linc00638能夠顯著提升RA-FLS中IL-4、SOD的表達，降低IL-6、ROS的表達；反之，對Linc00638干擾后IL-4、SOD表達明顯降低，IL-6、ROS表達明顯升高，表明在RA患者中Linc00638可能通過調控患者炎癥和氧化應激，參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。Linc00638在不同疾病中，發(fā)揮著重要作用，在食管鱗癌的研究中Linc00638與VEGF-C mRNA可直接結合，促進VEGF-C蛋白表達，或與miR-216b相互作用，調控靶基因KRAS的表達，來促進食管癌的進展［31］。LINC00638、hsa_circ_0005139、hsa_circ_0037858等被認為參與為腰椎間盤退行性病變進展的關鍵基因，參與組織細胞組成、細胞生物合成過程、基因表達和代謝過程的調控［32］。

綜上所述，Linc00638在RA患者低表達，與臨床指標存在相關性，過表達Linc00638能夠降低RA-FLS細胞活力，炎癥反應及氧化應激水平。國內外有關Linc00638在RA發(fā)生發(fā)展中的研究較少。因此，對其在RA中的具體調控機制、下游通路需進一步研究。