莫 嬋，謝淑雯，高 磊，呂志平

南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州510515

現(xiàn)代醫(yī)家多認為肝纖維化屬于中醫(yī)“癥瘕、黃疸、脅痛”等病癥范疇［1］。呂志平教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗提出其病因病機多為“濕熱余毒未盡，肝郁氣滯，淤熱互結(jié)阻絡(luò)”，其中濕熱疫毒與脾虛血瘀是關(guān)鍵［2,3］，并設(shè)計出新方保肝寧用于治療以此類病機為主的肝纖維化患者，療效顯著［4,5］。該方主要由白背葉根、丹參、莪術(shù)、黃芪、三七等組成，諸藥合用共奏清熱祛濕解毒、活血化瘀軟堅、益氣疏肝健脾之效［6］。保肝寧復(fù)方對肝炎后肝纖維化患者的臨床癥狀、體征、主要理化指標有明顯的改善作用，臨床使用安全，無明顯副作用，值得臨床大力推廣應(yīng)用［7］。為了推廣其臨床應(yīng)用及增加國際化應(yīng)用的可能性，使更多的臨床患者收益，亟需對保肝寧治療肝纖維化作用的分子機制展開深入研究。

研究表明免疫應(yīng)答紊亂是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的重要因素。樹突狀細胞作為抗原遞呈細胞，在肝臟免疫微環(huán)境中尤為重要［7-9］。有學(xué)者指出慢性乙型病毒性肝炎患者體內(nèi)的樹突狀細胞存在功能減弱，數(shù)量減少的病理變化［10,11］。作為一種關(guān)鍵的免疫微環(huán)境調(diào)控因子，吲哚胺2,3-雙加氧酶1（IDO1）與免疫系統(tǒng)的調(diào)控密切相關(guān)。抑制IDO1的活性可顯著降低免疫性肝炎小鼠肝組織中F4/80+巨噬細胞、LY6G+中性粒細胞、CD11b+單核細胞及CD3+T 細胞的浸潤［12］。IDO1的基因缺失可使肝纖維化小鼠肝組織中IL-17a、IL-6、TNF-α和TGF-β炎癥因子水平及Th17細胞浸潤減少［13］。我們前期的研究結(jié)果表明IDO1在肝纖維化小鼠肝組織中顯著上調(diào)且IDO1可與Nrf2相互拮抗調(diào)節(jié)肝纖維化小鼠樹突狀細胞的成熟［8］。然而，關(guān)于保肝寧復(fù)方是否也可以通過調(diào)控IDO1的表達繼而影響樹突狀細胞的成熟發(fā)揮抗肝纖維化作用仍然未知。因此，本研究擬構(gòu)建四氯化碳（CCL4）所致的小鼠化學(xué)性肝纖維化，觀察保肝寧復(fù)方對實驗性肝纖維化的影響，并試圖探索IDO1的表達及樹突狀細胞的功能狀態(tài)在保肝寧復(fù)方抗肝纖維化過程中發(fā)揮的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性C57BL/6小鼠60只，體質(zhì)量18～22 g，SPF級，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SYXK（粵）2013-0034。

1.1.2 藥物 中藥復(fù)方保肝寧各組成成份購于廣州康美藥業(yè)，經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)中藥鑒定與藥用植物教研室專家鑒定、水煎后，75 ℃水浴濃縮，制成高、中、低濃度組（含生藥量分別為3.51、1.76、0.88 g/mL，其中低劑量組相當于成人等效劑量）。秋水仙堿（陽性對照藥），購自西雙版納版納藥業(yè)有限責任公司（國藥準字號：H53021369），使用前12 h研碎制成0.01 mg/mL懸濁液。

1.1.3 主要試劑 四氯化碳溶液（SIGMA），EGTA（APExBIO），Ⅳ型膠原酶（Gibco），DNA酶（SIGMA），CD16/CD32（BD），CD11c-PE-CY7（BD），CD80-BV421（BD），CD86-BV605（BD），CD40-PE（BD），MHCIIAF488（BD），7-AAD（BD）。AST、ALT檢測試劑盒均購自南京建成生物工程技術(shù)研究所。天狼星紅苦味酸染色液（phygene）。IDO1 過表達腺相關(guān)病毒（AAV9-IDO1）購自上海吉凱基因科技有限公司。免疫組化染色試劑盒（上?；蚩萍加邢薰荆?/p>

1.2 方法

1.2.1 實驗分組、造模及給藥 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，根據(jù)小鼠隨機分為6組，每組10只，分別為對照組、模型組、秋水仙堿組和保肝寧低、中、高濃度組。參照參考文獻［8］，除對照組予以腹腔注射微量純橄欖油溶液0.6 mL/（kg·d）外，其余各組予以等體積CCl4 橄欖油溶液（CCl4∶橄欖油=1∶3）注射，3次/周，持續(xù)8 周。各組按照0.2 mL/10 g的灌胃體積予以相應(yīng)的受試藥物灌胃。對照組與模型組給予生理鹽水灌胃，陽性對照組予以2 mg/kg秋水仙堿灌胃，保肝寧低、中、高濃度組分別予以0.88、1.76、3.51 g/mL保肝寧灌胃，持續(xù)8周。另取正常野生型小鼠分為腺相關(guān)病毒陰性對照干預(yù)組、IDO1過表達腺相關(guān)病毒干預(yù)組及高濃度保肝寧+IDO1過表達腺相關(guān)病毒聯(lián)合干預(yù)組。將IDO1過表達腺相關(guān)病毒干預(yù)組及高濃度保肝寧+IDO1過表達腺相關(guān)病毒聯(lián)合干預(yù)組小鼠置于固定器內(nèi)，露出尾巴，選取尾部一條側(cè)靜脈，掐住尾巴根部，使靜脈充血膨脹，用75%酒精浸泡過的棉球反復(fù)擦拭尾部，在消毒的基礎(chǔ)上使靜脈進一步膨脹。向上斜插針頭進入靜脈，回抽有血，證明針頭進入靜脈，緩慢將IDO1過表達腺相關(guān)病毒注射入小鼠體內(nèi)（3×1011v.g/只）。注射完畢后按壓3 min止血，觀察小鼠情況。另腺相關(guān)病毒陰性對照干預(yù)組注射等量空載病毒。高濃度保肝寧+IDO1過表達腺相關(guān)病毒聯(lián)合干預(yù)組小鼠同時給予3.51 g/mL保肝寧灌胃，其余各組給予等體積生理鹽水灌胃，4周后處死小鼠。所有動物處理和程序均經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物保護和使用委員會批準（S2017040，S2017043）。

1.3 指標檢測方法

1.3.1 血清指標AST、ALT的檢測 分離小鼠血清，嚴格按照試劑說明書進行檢測。

1.3.2 肝組織病理學(xué)檢測 取小鼠肝左葉用4%多聚甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋、切片，分別做HE、天狼星紅染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理變化情況。

1.3.3 免疫組化法檢測小鼠肝組織α-SMA及IDO1的表達 肝臟石蠟切片常規(guī)烤片、封閉、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后分別滴加α-SMA及IDO1一抗（稀釋濃度1∶250），4 ℃過夜孵育，后續(xù)步驟按照免疫顯色試劑盒進行，中性樹膠封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察蛋白表達情況。

1.3.4 Western blot檢測肝臟IDO1蛋白表達水平 將肝臟組織加入裂解液制成肝勻漿，離心取上清液。測定上清蛋白濃度，加入上樣緩沖液，10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，BSA室溫封閉2 h，一抗（IDO1）4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色曝光，分析。

1.3.4 肝臟非實質(zhì)細胞的分離 根據(jù)參照文獻［6,14］分離肝臟非實質(zhì)細胞：小鼠麻醉后，取腹正中切口，逐層剪開，開腹暴露下腔靜脈及門靜脈，靜脈留置針在下腔靜脈穿刺，快速注入EGTA（190 mg/L）沖洗肝臟以避免紅細胞污染及肝臟血管凝血，再以1 mL/min 注入約50 mL濃度為0.5 mg/mL的Ⅳ型膠原酶（含1%2 mg/mL DNA酶）消化。取出肝臟，撕開肝臟表面包膜，搗碎肝組織，再以0.5 mg/mL 的Ⅳ型膠原酶（含1%2 mg/mL DNA酶）體外繼續(xù)消化20 min。消化后細胞混懸液經(jīng)70 μmol/L細胞濾網(wǎng)過濾。濾液以50 g離心3 min，收集上清備用。

1.3.5 肝臟DCs表型變化及T細胞增殖情況的檢測 將上述獲得的肝臟非實質(zhì)細胞懸液調(diào)整至細胞密度為1×106/mL；取100 μL 細胞懸液先加入0.5 μL CD16/32冰上孵育5 min 阻斷非特異性染色，350 g，5 min，棄上清。隨后，各管按照檢測類型加入相應(yīng)的抗體染色液，檢測肝臟DCs表型變化的抗體染色液配置：CD11C-PECY7，CD80-BV421，CD86-BV605，CD40-PE，MHCIIAF488 各1 μL；檢測T 細胞亞群的抗體染色液配置：CD-APC-CY7，CD4-PE，CD8a-FITC各1 μL。常溫孵育30 min后加入1 mL含2%FBS的PBS洗1次，1000 r/min，5 min，棄上清。再加入5 μL7-AAD孵育10 min標記死細胞，隨后加入1 mL 含2%FBS的PBS洗1次，1000 r/min，5 min，棄上清。加500 μL含2%FBS的PBS重懸，上機待測。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)、Graph Pad Prism7.0作圖，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊性，組間兩兩比較采用Tukey檢驗；若方差不齊，組間比較采用Dunnett's T3法檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 保肝寧對CCl4所誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠的影響

對照組小鼠肝組織僅在匯管區(qū)見極少量紅色纖維增生，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，無假小葉形成（圖1A、B）。模型組小鼠肝組織匯管區(qū)及小葉間見大量紅色膠原纖維并形成纖維間隔，可見假小葉結(jié)構(gòu)，天狼星紅陽性染色面積較對照組明顯增多（P=0.003）。與模型組比較，保肝寧低濃度組小鼠肝組織膠原纖維明顯減少，假小葉結(jié)構(gòu)減少，肝小葉破壞程度減輕，但其差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.223）；其中保肝寧中、高濃度組小鼠肝組織僅在匯管區(qū)見少量膠原纖維形成，未見明顯假小葉結(jié)構(gòu)形成，肝小葉結(jié)構(gòu)較完整（P=0.001；P=0.028）。

與對照組比較，模型組小鼠血清AST（P=0.02）、ALT（P=0.001）水平均顯著升高（圖1C、D）。與模型組比較，秋水仙堿干預(yù)后可使肝纖維化小鼠血清AST、ALT水平明顯下降（P=0.011；P=0.012）。保肝寧低、中濃度組小鼠血清AST平均水平較模型組降低，但其差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.074；P=0.128），保肝寧高濃度組可顯著降低肝纖維化小鼠血清AST 水平（P=0.041）。保肝寧中、高濃度組小鼠血清ALT水平均較模型組顯著降低（P=0.003；P=0.001）。

圖1 保肝寧對CCL4所誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠的影響Fig.1 Effects of BGN on CCl4-induced liver fibrosis in mice.A:Histopathological changes in the liver shown by HE staining and Sirius Red staining(Original magnification:×100).B:Positive staining area for Sirius red measured using image J software and quantified in a bar graph.C,D:Serum concentrations ofAST andALT,respectively.Data are presented as Mean±SD.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.2 保肝寧對CCl4 所誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝臟中α-SMA、IDO1表達水平及肝臟DCs數(shù)量的影響

與對照組比較，模型組小鼠肝組織中α-SMA的表達明顯上升（P=0.002），表達的陽性物質(zhì)呈黃色，主要分布在匯管區(qū)、肝竇Disse間隙及纖維間隔等纖維區(qū)。與模型組相比，秋水仙堿組α-SMA 表達明顯降低（P=0.001），僅在肝竇Disse間隙見極少量表達；保肝寧低、中、高濃度組治療后，α-SMA的表達水平均較模型組顯著下降（P=0.004；P=0.003；P=0.002），在匯管區(qū)、肝竇間隙及纖維組織等見少量α-SMA表達（圖2A、B）。

Western blot結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組小鼠肝組織中IDO1的蛋白表達水平明顯增多（P=0.024）。與模型組比較，保肝寧低、中濃度組小鼠肝組織IDO1平均表達水平均較模型組降低，但其差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.204；P=0.15，圖2C、D），保肝寧高濃度組可顯著降低肝纖維化小鼠肝臟中IDO1 蛋白水平（P=0.031，圖2C、D）。

本研究以CD11C+DCs標記樹突狀細胞。模型組小鼠肝臟中CD11C+DCs細胞較對照組顯著下降（P=0.000，圖2E、F）。保肝寧低、中濃度組小鼠肝臟中CD11C+DCs細胞比例的平均水平均較模型組升高，但其差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.627；P=0.188），保肝寧高濃度組可顯著上調(diào)肝纖維化小鼠肝臟中CD11C+DCs細胞比例（P=0.003）。

圖2 保肝寧對肝纖維化小鼠肝臟中α-SMA、IDO1表達水平及肝臟CD11C+DCs數(shù)量的影響Fig.2 Effects of BGN on expression levels of α-SMA,IDO1 and frequencies of hepatic CD11c+DCs in the liver of the mice with liver fibrosis.A,B:Immunohistochemistry for hepatic α-SMA expression(×200)and positive staining area measured using image J software and quantified in a bar graph.C,D:Western blotting for hepatic IDO1 expression and semi-quantitative analysis of the results(GAPDH as the loading control).E,F:Flow cytometry and summary data showing the percentage of hepatic CD11C+DC cells in hepatic NPCs.Data are presented as Mean±SD.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.3 保肝寧對CCL4所誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝臟中DCs表型的影響

與對照組比較，模型組小鼠肝臟CD11C+CD80+DCs、CD11C+CD86+DCs細胞比例顯著降低（P=0.000；P=0.007）。保肝寧低、中濃度干預(yù)組小鼠肝臟中CD11C+CD80+DCs（P=0.153；P=0.69）、CD11C+CD86+DCs（P=0.254；P=0756）細胞比例的平均水平均較模型組小鼠升高，但其差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組比較，保肝寧高濃度干預(yù)組小鼠肝臟CD11C+CD80+DCs、CD11C+CD86+DCs 細胞比例顯著升高（P=0.01；P=0.008，圖3A、B、E、F）。

與對照組比較，模型組小鼠肝臟中CD11C+CD40+DCs細胞比例平均水平呈下降趨勢，但其差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.14）。保肝寧低、中濃度干預(yù)組小鼠肝臟中CD11C+CD40+DCs細胞比例的平均水平均較模型組小鼠升高，但其差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.354；P=0.182）。保肝寧高濃度干預(yù)組小鼠肝臟中CD11C+CD40+DCs細胞比例較模型組小鼠顯著升高（P=0.04，圖3C、G）。

與對照組比較，模型組小鼠肝臟CD11C+MHCII+DCs細胞比例平均水平明顯下降（P=0.019）。保肝寧低、高濃度干預(yù)組小鼠肝臟CD11C+MHCII+DCs 細胞比例均較模型組小鼠顯著升高（P=0.039；P=0.019，圖3D、H）。

圖3 保肝寧對肝纖維化小鼠肝臟中DCs表型的影響Fig.3 Effects of BGN on the phenotype of hepatic DCs in mice with liver fibrosis.A-D:Flow cytometry of hepatic CD11C+CD80+DCs,CD11C+ CD86+ DCs,CD11C+ CD40+ DCs and CD11C+ MHCII+ DCs in hepatic NPCs,respectively.E-H:The corresponding summary data of cell percentages.Data are presented as Mean±SD.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.4 保肝寧對CCL4所誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝臟中T細胞亞群的影響

模型組小鼠肝臟CD3+T細胞比例較對照組小鼠顯著降低（P=0.002）；保肝寧低、中濃度干預(yù)組小鼠肝臟CD3+T細胞比例平均水平均較模型組小鼠升高，但其差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=1.00；P=0.053）；保肝寧高濃度干預(yù)組小鼠肝臟CD3+T細胞比例較模型組小鼠顯著升高（P=0.002，圖4A、B）。

與對照組相比，模型組小鼠肝臟CD3+CD4+T細胞比例顯著降低（P=0.02）；保肝寧低濃度組小鼠肝臟CD3+CD4+T細胞比例平均水平較模型組小鼠升高，但其差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.996）；保肝寧中（P=0.033）、高濃度（P=0.001）干預(yù)組小鼠肝臟CD3+CD4+T細胞比例均較模型組小鼠顯著升高（圖4A、C）。

模型組小鼠肝臟中CD4+/CD8a+比值較對照組明顯降低（P=0.006）；保肝寧低（P=0.001）、高濃度（P=0.005）干預(yù)組小鼠肝臟CD4+/CD8a+比值較模型組小鼠顯著升高（圖4A、D）。

圖4 保肝寧對肝纖維化小鼠肝臟中T細胞亞群的影響Fig.4 Effects of BGN on hepatic T cell subsets in mice with liver fibrosis.A:Frequencies of CD3+,CD3+CD4+,and CD3+CD8+T cells in hepatic NPCs analyzed by flow cytometry and the summary data(B-D).Data are presented as Mean±SD.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.5 保肝寧對肝臟特異性過表達IDO1小鼠的肝組織中IDO1表達水平及DCs數(shù)量和表型的影響

免疫組化染色結(jié)果示：尾靜脈注射IDO1過表達腺相關(guān)病毒4周后，小鼠肝組織IDO1蛋白表達水平較注射空載病毒組顯著增多（P=0.000，圖5A、B）。高濃度保肝寧干預(yù)后可顯著降低IDO1過表達腺相關(guān)病毒干預(yù)小鼠肝臟中IDO1的表達水平（P=0.001，圖5A、B）。

IDO1 過表達腺相關(guān)病毒干預(yù)組小鼠肝臟中CD11C+DCs數(shù)量（P=0.026）及CD11C+CD86+DCs（P=0.002）、CD11C+CD40+DCs（P=0.001）、CD11C+MHCII+DCs（P=0.05，圖5C、G）細胞比例較腺相關(guān)病毒陰性對照干預(yù)組明顯降低，高濃度保肝寧干預(yù)后可明顯上調(diào)IDO1 過表達腺相關(guān)病毒干預(yù)小鼠肝臟中CD11C+CD40+DCs（P=0.017）、CD11C+MHCII+DCs（P=0.008）細胞比例。

圖5 保肝寧對肝臟特異性過表達IDO1小鼠的肝組織中IDO1表達水平及DCs數(shù)量和表型的影響Fig.5 Effects of BGN on the expression level of hepatic IDO1 and the number and phenotype of hepatic DCs in AAV-IDO1 infected mice.A,B:Immunohistochemistry for detecting hepatic IDO1(×100)and bar graph of the positive staining area.C-G:FACS plots(left)and summary data (right) showing the percentage of hepatic CD11C+ DCs,CD11C+ CD80+ DCs,CD11C+ CD86+ DCs,CD11C+ CD40+ DCs,and CD11C+MHCII+DCs in hepatic NPCs.Data are presented as Mean±SD.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

2.6 保肝寧對肝臟特異性過表達IDO1小鼠的肝組織中T細胞亞群的影響

IDO1過表達腺相關(guān)病毒干預(yù)組小鼠肝臟中CD3+CD4+T細胞比例較腺相關(guān)病毒陰性對照干預(yù)組顯著降低（P=0.006，圖6），高濃度保肝寧干預(yù)后可明顯上調(diào)IDO1過表達腺相關(guān)病毒干預(yù)小鼠肝臟中CD3+CD4+T細胞比例（P=0.03）。IDO1過表達腺相關(guān)病毒干預(yù)組小鼠肝臟中CD3+T（P=0.373）細胞比例、CD4+/CD8+（P=0.135）比值均較腺相關(guān)病毒陰性對照干預(yù)組降低，高濃度保肝寧干預(yù)后可上調(diào)IDO1過表達腺相關(guān)病毒干預(yù)小鼠肝臟中CD3+T細胞比例（P=0.516）、CD4+/CD8+（P=0.828）比值，但其差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖6 保肝寧對肝臟特異性過表達IDO1小鼠的肝組織中T細胞亞群的影響Fig.6 Effects of BGN on hepatic T cell subsets in AAV-IDO1-infected mice.A:Frequencies of CD3+,CD3+CD4+,and CD3+CD8+T cells in hepatic NPCs analyzed by flow cytometry and the summary data(B-D).Data are presented as Mean±SD.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

3 討論

本研究采用給小鼠腹腔注射具有肝毒性的化學(xué)物質(zhì)CCl4以誘導(dǎo)復(fù)制肝纖維化模型，是最早也是目前國內(nèi)外使用最廣泛的一種實驗性肝纖維化模型［15］。CCl4進入體內(nèi)可破壞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜的滲透性，引起肝細胞的損傷與壞死［16］。我們采用單因素腹腔注射CCL4的造模方法，排除了其他復(fù)合因素的干擾，更有利于分析保肝寧的藥效作用。當肝細胞受損時，轉(zhuǎn)氨酶會釋放入血液，故血清中轉(zhuǎn)氨酶會升高。本研究結(jié)果示，保肝寧可顯著降低CCL4所致的肝纖維化小鼠血清中ALT、AST水平，表明保肝寧具有護肝、抑制肝細胞損傷的作用。肝纖維化的主要病理特征是活化的肝星狀細胞（HSC）產(chǎn)生大量的膠原纖維和細胞外基質(zhì)（ECM）的過度沉積［17］。α-SMA的表達是HSC早期被激活的標記。目前，以抑制肝星狀細胞活化為靶點的治療方法已成為肝纖維化的研究熱點［18］。本研究病理切片示模型組小鼠肝組織中見大量纖維結(jié)締組織，并形成纖維間隔把肝小葉分割成假小葉，說明本研究肝纖維化模型復(fù)制成功。保肝寧可以減少肝纖維化小鼠肝組織中膠原纖維的形成，改善肝組織病理結(jié)構(gòu)。表明保肝寧具有抑制膠原蛋白的沉積，減輕肝纖維化程度的作用。此外，模型組小鼠肝組織見大量α-SMA表達，表明HSC活化水平增多，予以保肝寧治療后可顯著降低肝組織中α-SMA的表達水平，即抑制了HSC 的活化，提示保肝寧可能通過抑制HSC的活化繼而延緩肝纖維化的病理進程。

肝纖維化是組織細胞損傷和修復(fù)的免疫應(yīng)答過程［19］。IDO1是肝臟外唯一可以催化色氨酸分解代謝的限速酶，是一種抑制性免疫調(diào)節(jié)酶［13］。多項研究表明IDO1可在單核-巨噬細胞、DCs等免疫細胞中表達，負責各種免疫調(diào)節(jié)功能［20-22］。DCs是目前已發(fā)現(xiàn)的功能最強的專職抗原呈遞細胞，成熟DCs是體內(nèi)免疫反應(yīng)的重要媒介，進一步激活T細胞并參與免疫應(yīng)答過程或通過免疫耐受來維持機體的免疫平衡狀態(tài)［23,24］。成熟DCs的表面高表達CD80、CD86、CD40和MHCII等黏附分子，對抗原加工提呈能力很強，而對抗原的攝取能力減弱［25-27］。因此，肝纖維化過程中可能伴隨著IDO1表達水平的變化及DCs表型和其下游T細胞的改變。已有臨床研究表明肝纖維化分級越高，慢性乙型肝炎患者外周血DCs的數(shù)量越低。DCs數(shù)目下降和功能減弱是慢性乙型肝炎患者重要的病理特征［10,11］。與臨床研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)肝纖維化小鼠肝臟中IDO1表達水平顯著升高的同時CD11C+DCs、CD11C+CD80+DCs、CD11C+CD86+DCs、CD11C+MHCII+DCs細胞比例較對照組顯著降低。更重要的是，保肝寧干預(yù)后可顯著降低肝纖維化小鼠肝組織中IDO1 表達水平，上調(diào)CD11C+DCs、CD11C+CD80+DCs、CD11C+CD86+DCs、CD11C+CD40+DCs、CD11C+MHCII+DCs細胞比例，說明保肝寧能有效的下調(diào)肝纖維化小鼠肝臟中IDO1表達、增加DCs數(shù)量和其表面成熟分子的表達。同時，模型組小鼠肝臟CD3+T、CD3+CD4+T細胞比例與對照組比較均呈低水平，予以保肝寧治療后可使肝纖維化小鼠肝臟中CD3+T、CD3+CD4+T細胞比例顯著上調(diào)。說明保肝寧可降低肝纖維化小鼠肝臟中IDO1表達水平，同時改變DCs的成熟表型，促進DCs功能的恢復(fù)。研究表明，調(diào)節(jié)樹突狀細胞的功能、抑制IDO1的表達均可抑制肝纖維化的進展［28,29］。為了進一步驗證保肝寧的分子機制，本課題組利用保肝寧干預(yù)肝臟中特異性過表達IDO1的小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)保肝寧可有效降低IDO1過表達腺相關(guān)病毒干預(yù)組小鼠肝臟中IDO1 的表達水平、CD11C+CD40+DCs、CD11C+MHCII+DCs細胞比例和CD3+CD4+T細胞比例。因此，本實驗不僅揭示了保肝寧能夠通過抑制IDO1的表達進而發(fā)揮促進DCs成熟和刺激T細胞增殖的免疫調(diào)節(jié)作用，還證實了保肝寧具有治療抗肝纖維化的潛能。

保肝寧是以“活血化瘀”為基本治則，兼以“清熱解毒、軟堅、益氣健脾、疏肝理氣”等多途徑發(fā)揮抗肝纖維化的藥效。本實驗研究證實保肝寧能有效防治實驗性小鼠肝纖維化的形成，其作用機制可能與保護肝細胞損傷、抑制膠原蛋白的形成、改善肝臟免疫應(yīng)答等相關(guān)，有助于詮釋保肝寧多途徑、多層次抗肝纖維化的科學(xué)內(nèi)涵，為保肝寧更好地應(yīng)用于臨床提供了實驗依據(jù)。